专利名称：用于治疗ErbB/ErbB配体相关疾病的分子和使用所述分子的方法
用于治疗ErbB/ErbB配体相关疾病的分子和使用所述分子的方法发明领域和背景
本发明涉及选择用于治疗过度增生性疾病(hyperproliferative disease)例如癌症的药剂(agent)的方法，并涉及用于治疗所述疾病的药剂组合。ErbB家族的酪氨酸激酶受体和与之结合的配体在胚胎发育中以及在贯穿成人期的组织重建中起重要作用。信号转导级联开始于配体的结合，该结合导致受体二聚化和磷酸化，并且引起多个细胞进程，包括增殖、分化、迁移和存活。有四种关系密切的ErbB受体:ErbB-1 [表皮生长因子受体(EGFR)]，其结合表皮生长因子(EGF)、转化生长因子a (TGFa )、肝素-结合EGF-样生长因子(HB-EGF)、双调蛋白(AR)、β动物纤维素(betacellulin) (BTC)、表皮调节素(epiregulin, EPR)和epigen ;ErbB_3和ErbB_4,其结合神经调节蛋白生长因子；和目前还没有已知配体的ErbB-2 (HER2)。所有ErbB家族配体共享50_60个氨基酸-长度的序列，该序列在保守的间距和背景中含有统称为表皮生长因子(EGF)基序的6个半胱氨酸。该基序是负责受体识别的关键结构特征和功能特征。生长因子作为I型跨膜蛋白合成，并且发生胞外结构域脱落(经由蛋白水解加工)，这导致可溶性生长因子(包含EGF-样结构域)的释放。可溶性配体可以依次结合和激活远距离细胞、邻近细胞或其起源细胞上的受体。一些膜-锚定配体也可以激活邻近细胞膜上的EGFR，该机制可能引起与可溶性配体不同的生物学结果。已经在涉及包括银屑病、关节硬化在内的若干病理学以及若干类型的人癌症中阐述了 ErbB蛋白。例如，很多上皮起源的肿瘤在其细胞表面表达增加水平的ErbB-1[Ullrich, A.等(1984) Nature 309, 418-425]。具有增加的ErbB受体表达的肿瘤通常表现出TGF α或其它ErbB配体的产生增加，这使得可通过自分泌环激活受体。临床研究表明一种或多种ErbB配体的过表达与患者存活降低相关。例如,在原发性结直肠肿瘤样本中TGFa的广泛表达与出现肝转移风险增加多于50倍相关[Barozzi，C.等(2002) Cancer 94，647-657]。在膀胱癌中，多种 ErbB 配体(AR、HB-EGF、TGF α 尤其是EPR)的提高的表达与患者存活降低相关[Thogersen, V.B.等(2001) Cancer Res61，6227-6233]。此外，在转移性疾病中TGFa表达提高与患者效果较差相关[De Jong,K.P.等(1998) Hepatology 28，971-979]，头颈肿瘤中TGF α表达增加与患者存活降低相关[Grandis, J.R.等(1998) J Cell Biochem 69，55-62]。此外，一些配体特别是 TGF α、AR和HB-EGF的肿瘤细胞表达与化疗抗性相关[Eckstein, N.等(2008) J Biol Chem 283，739-750 ；ffang, F.等(2007) Oncogene 26， 2006-2016]。新出现的数据表明在某些肿瘤中特定ErbB配体的表达不同程度地与预后有关。乳腺肿瘤样本中EGF表达与更有利的预后相关，而TGFa表达与更具侵入性的肿瘤相关[Revillion, F.等(2008) Int J Biol Markers 23, 10-17]。同样,微阵列分析显示乳腺癌早期增生前体展示，相对于正常乳腺组织增加了 AR转录并降低了 EGF转录[Lee，S.等(2007) Am J Pathol 171，252-262]。在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，TGFa 和 AR 血清浓度与肿瘤侵入性相关[Lemos-Gonzalez, Y.等(2007) Br J Cancer 96, 1569-1578]。结合起来考虑，该数据提示TGF α和AR与EGFR-相关的肿瘤细胞侵入性和化学抗性相关，而EGF可能实际上拮抗TGFa和AR导致的病原性信号转导刺激[Wilson，K.J.等(2009)Pharmacol Ther 122, 1-8]。当前批准用于治疗ErbB相关癌症的药物包括针对ErbB-1 (EGFR，例如艾比特思(erbitux)/ 西妥昔单抗(cetuximab))或针对 HER2 (ErbB-2,例如赫赛汀(herceptin)/曲妥珠单抗(trastuzumab))的单克隆抗体,或小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI,例如塔西法(tarceva) / 埃罗替尼(erlotinib)) [Britten, C.D.(2004) Mol Cancer Ther 3,1335-1342 ；ffeiner, L.Μ.，和 Borghaei, H.(2006) Hum Antibodies 15，103-111]。对单克隆抗体(例如曲妥珠单抗)或酪氨酸激酶抑制剂(例如吉非替尼(gefitinib))的获得性抗性通常与ErbB受体或配体的上调相关，例如，所选择的体内抗曲妥珠单抗的人乳腺癌细胞显著地过量表达EGFR和ErbB配体TGF α、HB-EGF和NRGl [Ritter, C.A.等(2007) Clin Cancer Res 13，4909-4919]。同样，靶向 EGFR 和 HER2 的单克隆抗体通过阻断功能受体和药物逃脱(evasion)机制提高多西他赛的抗肿瘤作用[Bijman, Μ.N.等(2009) Anticancer Drugs 20, 450-460 ；Freeman, D.J.等(2009).Mol Cancer Ther 8,1536-1546]。 此外，已经提出直接靶向配体的备选策略。一种所述策略是对于单个配体特异性的单克隆抗体。例如，贝伐单抗(bevacizmab)是与血管内皮生长因子_A (VEGF-A)结合的人源化单克隆抗体[Hurwitz, H.等(2004) N Engl J Med 350, 2335-2342 ；Shih,T.，和 Lindley, C.(2006) Clin Ther 28，1779-1802]。另一策略利用“配体-陷阱(ligand-trap) ”,其为特异性受体的可溶性配体结合结构域。所述配体-陷讲的实例是依那西普(etanercept),—种包含与人免疫球蛋白G (IgG) Fe区融合的TNF-α受体的配体结合结构域的融合蛋白，其可用于治疗类风湿性关节炎[Mohler，K.Μ.，等(1993) JImmunol 151，1548-1561]。另一备选是对脱落剂的抑制,所述脱落剂是解聚素和金属蛋白酶(ADAM)家族成员，认为其介导EGFR配体的脱落，这是产生功能EGFR配体的关键性事件[Kataoka, H.(2009) J Dermatol Sci 56，148-153 ；Kenny, P.Α.和 Bissell, M.J.(2007) J Clin Invest 117， 337-345 !Merchant, N.B.等(2008) Clin Cancer Res 14，1182-1191]。本领域业已阐述靶向ErbB配体的另外的单克隆抗体。例如，PCT公开号WO2009/026705描述了用于治疗骨关节炎的靶向TGFa的单克隆抗体。美国专利号7501122阐述了用抗-ErbB2抗体组合的治疗。美国专利号7501122明确教导用人源化抗_ErbB2抗体治疗癌症(例如乳腺癌、结肠癌)。可以一起或单独给予该发明教导所述的抗体，以在过量表达表皮生长因子受体(EGFR)或EGFR配体(例如EGF、TGF- a或ΗΒ-EGF)的癌症中阻断ErbB受体的配体激活，藉此抑制癌细胞的生长。美国专利号7，485，302阐述了使用抗_ErbB2抗体和化疗剂治疗癌症的方法。美国专利号7，485，302明确教导化疗剂和抗_ErbB2抗体一起用于治疗过量表达表皮生长因子受体(EGFR)或其配体(例如TGF a)的癌症(例如乳腺癌、肺癌)的用途。发明概沭
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了选择用于治疗需要治疗的受试者的过度增生性疾病的靶的方法，所述方法包括分析来自受试者的生物样品中至少一种ErbB配体的量和/或活性，其中选择与非过度增生细胞或组织相比显示出上调的量和/或活性超过预设水平的ErbB配体作为治疗过度增生性疾病的靶。根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了治疗需要治疗的受试者的过度增生性疾病的方法，所述方法包括:(a)选择用于治疗过度增生性疾病的靶；和(b)给予受试者治疗有效量的下调靶的量和/或活性的作用剂(agent)，藉此治疗受试者的过度增生性疾病。根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了治疗需要治疗的受试者的过度增生性疾病的方法，所述方法包括:(a)给予治疗有效量的下调第一 ErbB配体的量和/或活性的作用剂；和(b)给予治疗有效量的下调第二 ErbB配体的量和/或活性的作用剂，所述第一和第二 ErbB配体不完全相同，藉此治疗受试者的过度增生性疾病。根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了药物组合物，其包含药学上可接受载体和下调第一 ErbB配体的量和/或活性的第一活性剂和下调第二 ErbB配体的量和/或活性的第二活性剂，所述第一和第二 ErbB配体不完全相同。根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了制品，其包含包装材料和下调第一ErbB配体的量和/或活性的第一作用剂和下调第二 ErbB配体的量和/或活性的第二作用齐U，所述第一和第二 ErbB配体不完全相同，所述制品在印刷物或包装材料上标识用于治疗过度增生性疾病。根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了单克隆抗体或其片段，其能够特异地结合TGFa的EGF-样结构域的至少一个表位，所述TGFa由保藏在法国国立微生物保藏中心(Collection Nationale De Cultures De Microorganismes, CNCM)的保藏号 CNCM1-4292 (克隆号 551.6.103)所述。根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了单克隆抗体或其片段，其能够特异地结合HB-EGF的EGF-样结构域的至少一个表位，所述HB-EGF由保藏在法国国立微生物保藏中心(CNCM)的保藏号CNCM 1-4291 (克隆号898.47)所述。根据本发明的一些实施方案，作用剂包含与靶特异结合的抗体或其片段。根据本发明的一些实施方案，作用剂包含与靶特异结合的siRNA。根据本发明的一些实施方案，给药包含给予至少两种作用剂，两种作用剂中每一种特异性结合不完全相同的靶。根据本发明的一些实施方案，作用剂包含特异性结合第一 ErbB配体和/或第二ErbB配体的抗体或其片段。根据本发明的一些实施方案，作用剂包含特异性结合第一 ErbB配体和/或第二ErbB 配体的 siRNA。根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括给予受试者化疗剂。根据本发明的一些实施方案，过度增生性疾病为癌症。根据本发明的一些实施方案，所述癌症是胰腺癌。根据本发明的一些实施方案，所述癌症是肺癌。根据本发明的一些实施方案，所述生物样品包含癌细胞。根据本发明的一些实施方案，分析通过ELISA实现。
根据本发明的一些实施方案，ErbB配体选自表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-a (TGF α)、肝素-结合EGF-样生长因子(HB-EGF)、双调蛋白(AR)、β动物纤维素(BTC)、表皮调节素(EPR)、epigen和神经调节蛋白生长因子。根据本发明的一些实施方案，第一 ErbB配体包含转化生长因子a (TGFa)0根据本发明的一些实施方案，第二 ErbB配体包含肝素-结合EGF-样生长因子(HB-EGF)。根据本发明的一些实施方案，药物组合物进一步包含化疗剂。根据本发明的一些实施方案，制品进一步包含化疗剂。根据本发明的一些实施方案，第一作用剂和第二作用剂在单独的药物组合物中配制。根据本发明的一些实施方案，第一作用剂和第二作用剂在单一药物组合物中配制。根据本发明的一些实施方案，单克隆抗体或其片段包含可检测部分。根据本发明的一些实施方案，单克隆抗体或其片段包含连接在其上的细胞毒素剂。除非另有定义，否则本文所用所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然在实施或测试本发明实施方案中可使用与本文所述的相似或等同的方法和材料，但以下阐述了例示性方法和/或材料。在发生冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的，并非意欲必定限制性的。附图简沭
本文仅通过实施例参照附图阐述了本发明的一些实施方案。现在详细地具体参照附图，强调所示细节仅作为实例并为了阐明性论述本发明实施例方案的目的。在这方面，对附图的说明使本领域技术人员明白可以如何实施本发明的实施方案。在附图中:
图1A-E描述重组EGF-样配体的构建、表达和生物活性以及用GP1-锚定的TGF α检测阻断TGFa的抗体。图1A显示一般性嵌合蛋白图解，包括硫氧还蛋白(TRX)结构域、组氨酸盒子(6XHis)、因子Xa侧翼切割位点和羧基末端EGF-样结构域。标示了残基编号。图1B显示考马斯蓝染色的丙烯酰胺凝胶，其显示用细菌表达制备并在NiNTA柱上纯化的纯TGFa和ΗΒ-EGF。分子量标记用千道尔顿标明。图1C显示纯化蛋白的生物学活性，其通过测试其诱导EGFR在酪氨酸残基上的磷酸化的能力证实。细胞接种于24孔板中，洗涤，与渐增浓度的纯化融合蛋白(TRX-TGFa:2、20、200 ng/ml ；TRX-HB-EGF:3,30,300 ng/ml)孵育。用EGF (10 ng/ml)作为阳性对照。孵育10分钟后，裂解细胞，用抗-磷酸酪氨酸(P-Tyr)抗体对澄清的提取物进行免疫印迹(IB)。图1D显示呈现一般性GPI (糖基磷脂酰肌醇)融合蛋白的结构域结构的图解，所述融合蛋白包含ErbB-2’信号肽(SP)、TGFa (或HB-EGF)的EGF-样结构域、HA肽标签和能在质膜锚定的GPI脂质锚。残基编号参照TGF a。突出显示了 EGF-样结构域的半胱氨酸残基。图1E显示TGFa诱导的EGFR磷酸化，其如在存在增加量的来自经免疫小鼠的抗血清时所测试。将细胞接种于24孔板中，洗涤，与含有或不含有TGFa (5 ng/ml)，和含有渐增体积的来自TGFa-免疫小鼠的抗血清(将0.2、2、4、6、8和10 μ I血清稀释至总共120 μι ;对照:10 μ 来自首次用于实验的动物的血清)孵育。将抗-磷酸酪氨酸mAb用于检测磷酸化的EGFR。图2A-C描述了抗TGF a mAb的抗原特异性和功能测试。图2A显示抗原特异性。用标明的配体(0.1 ng/ml)包被96孔板，然后与抗-TGFa mAb551 (灰色)或与盐水(黑色)孵育2小时。此后，让孔与缀合HRP的抗-小鼠抗体孵育I小时，接着与ATBS孵育30分钟。用ELISA读数器(设置于420 nm)测定信号。图2B显示抗-TGF a mAb与TGF a的市售制品的免疫沉淀。使用缀合抗-小鼠Fe抗体的珠粒，用抗-TGF a mab551抗体免疫沉淀TGFa (50 ng ；Sigma)。将免疫复合物用mAb551进行印迹。标明了分子量标记(7千道尔顿)。图2C显示mAb-551特异性抑制TGF α -诱导的EGFR磷酸化的能力。将细胞接种在24孔板中，孵育10小时后洗涤，在含有或不含有标明的配体情况下，与渐增浓度的抗-TGFamAb (15、80和160 μ g/ml)孵育10分钟。此后，如所标明来裂解细胞，用抗-磷酸酪氨酸mAb或用抗-EGFR mAb对澄清提取物进行免疫印迹(IB)。图3A-C描述了抗HB-EGF mAb的功能测试。图3A显示抗原特异性。用标明的配体(0.1 ng/ml)包被 96 孔板，然后与抗-HB-EGF mAb898 (白色)、抗-HB-EGF mAb878 (灰色)或抗-HB-EGF mAb384 (黑色)孵育2小时。此后，将孔与缀合HRP的抗-小鼠抗体孵育I小时，接着与ATBS孵育30分钟。用ELISA读数器(设置于420 nm)测定信号。图3B显示使用不同抗-HB-EGF mAb与HB-EGF的市售制品的免疫沉淀。使用缀合抗_小鼠Fe抗体的珠粒让标明的HB-EGF mab551免疫沉淀(ip) HB-EGF (Sigma; St.Louis, MO)。将免疫复合物用与HB-EGF的mAb327进行印迹。标明了标记的分子量。图3C描述HB-EGF mAb特异性抑制HB-EGF-诱导的EGFR磷酸化的能力。洗涤稀疏的单层HeLa或T47D细胞，与HB-EGF (3 ng/ml)和不同的抗HB-EGF mAb (384、878、898)孵育10分钟。此后，裂解细胞，用抗-磷酸酪氨酸mAb、抗-EGFR mAb (HeLa)或抗ErbB_3 mAb (T47D)对澄清提取物进行免疫印迹。图4A- B描述了通过抗-TGF α和抗-HB-EGF mAb组合有效抑制人胰腺癌细胞的增殖和致肿瘤性(体外和体内)。图4A显示用本发明mAb处理的胰腺癌细胞的体外细胞生长降低。将BxPC3细胞(2X104)接种于96孔板，使其贴壁过夜，然后加入抗-TGFa或抗-HB-EGF mAb (每种30 μ g/ml)或两种mAb的混合物(每种15 Pg/ml)。96小时后用MTT法一式六份测定细胞增殖。显示平均值土 S.D.。实验重复两次。图4B显示用本发明mAb治疗的小鼠胰腺癌细胞的体内细胞生长降低。用2 X IO6 BxPC3细胞皮下接种雌性裸鼠(6周龄)。一旦肿瘤变得可触及(5-7天)，则将小鼠随机分组，腹膜内注射抗-TGFa或抗-HB-EGF mAb (每只每次注射125 μδ)或两种mAb的组合(每种每次注射125 μδ)。在第9、16、20、23、26、30、33、37、40和44天时用mAb治疗小鼠。对照组包括12只小鼠，各治疗组包括8只小鼠。值得注意的是，观察到的小鼠体重没有区别(未显示)。图5A-B描述两种mAb和化学疗法联用有效抑制人胰腺癌细胞生长(体外和体内)。图5A显示用本发明mAb与化学治疗一起处理的胰腺癌细胞的体外细胞生长降低。如图4A (上述)所述处理BxPC3细胞(2 X IO4),不同之处在于使用了吉西他滨(gemcitabine)(50 mg/ml)，其单独使用或与抗-TGFa和抗-HB-EGF mAb混合物(每种15 Pg/ml)联用。实验重复两次。图5B显示用本发明mAb与化学治疗一起治疗的小鼠胰腺癌细胞的体内细胞生长降低。用2 X 106BxPC3细胞皮下接种雌性裸鼠出周龄)。一旦肿瘤变得可触及(5-7天)，则将小鼠随机分组。第一组在腹膜内注射TGF α和HB-EGF的特异性mAb混合物(每种每次注射250 μ g;用白色箭头描述)。第二组(11只小鼠)在第16和21天用吉西他滨治疗(腹膜内注射，150 mg/kg体重；用黑色箭头描述)，第三组(6只小鼠)联用吉西他滨和mAb治疗。对照组(11只小鼠)用盐水处理。显示了肿瘤体积的平均值土 S.D.。值得注意的是，除了体重的缓慢增加外，体重监测未检测到一致的趋势和差异(数据未显示)。图6A-D描述了在动物模型中抗-TGF α和抗-HB-EGF mAb对人肿瘤细胞的抑制。每周两次(每次125 μ g)用抗-TGF α和抗-HB-EGF mAb组合，治疗荷有可触及的MiaPaCa人胰腺癌细胞(图6A和6C)或人肺肿瘤细胞系H1437 (图6B和6D)肿瘤的裸鼠。在第14、18、21、24、27、30、34和37天用mAb治疗荷有MiaPaCa异种移植物的小鼠。对照组包含8只小鼠，治疗组包含5只小鼠。在第6、10、14、17和21天用mAb治疗荷有H1437肿瘤异种移植物的小鼠。相应的对照组包含15只小鼠，治疗组包含11只小鼠(图6B)。显示了肿瘤体积(图6A-B)和体重(图6C-D)。黑色圆圈代表用mAb (抗-TGF α和抗-HB-EGF)治疗的小鼠，白色环代表对照小鼠。发明具体实施方案详述
本发明涉及选择用于治疗过度增生性疾病例如癌症的药剂的方法，并涉及用于治疗所述疾病的药剂组合。参照附图和随附说明可以更好地理解本发明的原理和操作。在详细解释本发明至少一个实施方案前，应该理解本发明未必将其应用限制于以下说明所示或由实施例所例证的细节。本发明能够有其它实施方案或以不同的方式实践或实施。同样，应该理解本文所用措辞和术语用于说明目的，不应该认为是限制。已知ErbB蛋白涉及包括银屑病、关节硬化在内的若干病理学以及若干类型的人癌症。临床研究表明一种或多种ErbB配体的过表达与患者存活的降低相关。本发明人现在提出用于治疗癌症的疗法可按照特定患者需求，基于来源于其的生物样品的ErbB表达概况来选择，并个别调整。此外，本发明人已证明用两种靶向ErbB配体(例如TGFa和HB-EGF，两种配体在特定肿瘤中均特异性上调)的单克隆抗体联合治疗显著降低肿瘤生长，有利于癌症治疗。本发明人已明确证明胰腺肿瘤遭受若干自分泌环，包括EGFR和ErbB配体，即TGFa、HB-EGF和AR (见下文表I)。发明人生成了靶向TGFa (mAb551，下文实施例3)和HB-EGF (mAb898、mAb878和mAb384，下文实施例4)的特异性单克隆抗体，并证明了这些抗体对它们的靶配体为特异的(分别为图2A和3A)。此外，这些mAb单独或联合使用显著降低体外(图4A)和体内(图4B)肿瘤生长。重要的是，将这些mAb加到常规化学治疗药像吉西他滨中，可能通过使肿瘤细胞对细胞毒性敏感及延迟化学抗性起始来增加治疗功效(图5A-B)。综合考虑，本发明教导描述了靶向ErbB配体的单克隆抗体的治疗价值，并建议用所述单克隆抗体治疗肿瘤。因此，根据本发明的一个方面，提供了在需要治疗的受试者中治疗过度增生性疾病的方法，所述方法包括:(a)分析来自受试者生物样品中的至少一种ErbB配体的量和/或活性，其中选择与非过度增生的细胞或组织相比显示出上调量和/或活性高于预设水平的ErbB配体作为用于治疗过度增生性疾病的靶；和(b)给予受试者治疗有效量的下调靶的量和/或活性的作用剂，藉此治疗受试者的过度增生性疾病。
本文所用术语“治疗”指预防疾病的发作，缓和、衰减、减轻或消除疾病症状，减慢、逆转或阻止疾病进程，或治愈疾病。本文所用短语“过度增生性疾病”，指以快速和/或不受控制的细胞分裂为特征且其发作和/或进展依赖于ErbB配体(活性和/或表达)任何疾病。所述疾病可以是癌性的或良性的。过度增生性疾病可包括但不限于:癌症；皮肤�。缫疾 ⒐庀咝越腔�、脂溢性角化病、片层状鱼鳞癣、毒性湿疹、变应性湿疹、特应性皮炎和鲍文病(Bowen’sDisease);脊髓发育不良病症；宫颈原位癌；家族性肠息肉病,例如Gardner综合征；口腔白斑；组织细胞增多症；�：鄹泶瘢谎芰觯谎字⑿怨亟谘祝还冉腔⒑颓鹫盍坌夹云ふ睿ü亟谘�。也包括病毒诱导的过度增生性疾�。琊嗪虴BV诱导的疾病(即传染性单核细胞增多症)；�：坌纬桑谎茉錾圆≈�,例如再狭窄、动脉粥样硬化、支架内狭窄、血管移植再狭窄等；纤维变性病症；肾小球肾炎；黄斑变性病症；良性生长病症，例如前列腺肥大和脂肪瘤；自身免疫病症；心律紊乱；子宫内膜异位症、子宫纤维瘤(子宫平滑肌瘤)、月经过多、宫颈糜烂、宫颈息肉；和椎间盘缺陷或病症。按照具体实施方案，过度增生性疾病是癌症。本文所用术语“癌症”，指依赖ErbB配体(活性和/或表达)发作或进展的癌性疾病。癌细胞可以与以下表型相关:例如不受控制的增殖、特化功能丧失、永生性、显著转移性潜能、抗细胞凋亡活性显著增加、快速生长率和增殖率及某些特有的形态和细胞标记。在一些情况下，癌细胞是肿瘤形式，所述细胞可在动物局部存在，或作为独立细胞例如白血病细胞在血流中循环。应当理解的是，本文所用术语癌症包括处于任何阶段和以任何形式的所有类型的癌症。可经由本发明方法治疗的肿瘤疾病类型包括良性肿瘤、疣、息肉、初癌和恶性肿瘤
/癌症。可用本发明方法治疗的肿瘤疾病的具体实例包括但不限于:遗传性肾上腺皮质癌；膀胱癌；乳腺癌；导管型乳腺癌；侵入性导管内乳腺癌；散发性乳腺癌；易感性乳腺癌；4型乳腺癌；4型乳腺癌；乳腺癌-1 ;乳腺癌-3 ;乳腺-卵巢癌；伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’slymphoma);宫颈癌；结直肠腺瘤；结直肠癌；1型遗传性非息肉病性结直肠癌；2型遗传性非息肉病性结直肠癌；3型遗传性非息肉病性结直肠癌；6型遗传性非息肉病性结直肠癌；7型遗传性非息肉病性结直肠癌；隆凸性皮肤纤维肉瘤；子宫内膜癌；食管癌；胃癌、纤维肉瘤、多形性胶质母细胞瘤；多发性血管球肿瘤；肝胚细胞瘤；肝细胞癌(h印atocellularcancer);肝细胞癌(hepatocellular carcinoma);急性淋巴细胞白血�。患毙运栊园籽。话樗媸人嵝粤Ｏ赴龆嗉毙运栊园籽。患毙苑橇馨拖赴籽。宦运栊园籽。籐1-Fraumeni综合征；脂肪肉瘤、肺癌；小细胞肺癌；非何杰金氏淋巴瘤；lynch癌症家族综合征II ;男性生殖细胞肿瘤；肥大细胞白血�。患鬃聪偎柩凰枘赶赴觯缓谒亓�、恶性黑素瘤、脑膜瘤；多发性内分泌瘤�。灰赘行运栊远裥灾琢�,粘液肉瘤、神经母细胞瘤；骨肉瘤；卵巢癌(ovarian cancer);衆液性卵巢癌；卵巢癌(ovarian carcinoma);卵巢性索肿瘤；胰腺癌；胰腺内分泌肿瘤；家族性非嗜铬性副神经节瘤；毛母质瘤；侵入性脑垂体肿瘤；前列腺腺癌；前列腺癌；家族性和散发性乳头状肾细胞癌；视网膜母细胞瘤；家族性杆状易患病体质综合征(rhabdoid predisposition syndrome, familial);杆状肿瘤；横纹肌肉瘤；小细胞肺癌；头颈软组织肉瘤、头颈鳞状细胞癌、头颈基底细胞癌；T-细胞急性淋巴母细胞白血�。话樗娼褐誓赶赴龅腡urcot综合征；伴食管癌的胼胝形成；子宫颈癌、2型Wilms氏肿瘤和I型Wilms氏肿瘤等等。业已很好地表征初癌，并为本领域中已知(参考例如Berman JJ.和Henson DE.，2003.Classifying the Precancers: a metadata approach (初癌分类:一种兀数据方法).BMC Med Inform Decis Mak.3:8)。可经由本发明方法治疗的初癌种类包括:获得性小型或微型初癌；具有核异型的获得性大损伤(large lesion);出现发展成癌症的遗传增生性综合征的前体损伤；和获得性弥散性过度增生和弥散性化生。小型或微型初癌实例包括HGSIL (子宫颈高度鳞状上皮内病损)、AIN (肛门上皮内瘤病)、声带发育不良、变异(结肠)隐窝(aberrant crypts (of colon))、PIN (前列腺上皮内瘤病)。具有核异型的获得性大损伤实例包括管状腺瘤、AILD (血管免疫母细胞性淋巴结病伴异常蛋白血症)、非典型脑膜瘤、胃息肉、大斑块副银屑病、脊髓发育不良、原位乳头状移行细胞癌、未成熟细胞过多的难治性贫血和Schneiderian乳头状瘤。出现发展成癌症的遗传增生性综合征的前体损伤实例包括:非典型疲综合征(atypical mole syndrome)、C细胞腺瘤病和MEA。获得性弥散性过度增生和弥散性化生的实例包括:AIDS、非典型淋巴样增生、骨的佩吉特病(Paget’ sdisease of bone)、移植后淋巴组织增生性疾病和溃瘍性结肠炎。按照本发明该方面具体实施方案，所述癌症是胰腺癌或肺癌。本文所用短语“胰腺癌”指胰腺的恶性赘生物，包括但不限于腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶质癌、未分化癌、伴随破骨细胞样巨细胞的未分化癌和胰岛细胞癌。本文所用短语“肺癌”指肺组织中任何不受控的细胞生长，包括但不限于小细胞肺癌、复合性小细胞癌、非小细胞肺癌、肉瘤样癌、唾液腺瘤、类癌瘤、腺鳞癌、胸膜肺母细胞瘤和类癌瘤。本文所用短语“需要治疗的受试者”，指患有过度增生性疾病(例如癌症)或易于患有过度增生性疾病的受试者。所述受试者可以是哺乳动物例如人。例如，如果待治疗的疾病是胰腺癌，则受试者通常为被诊断为胰腺癌的受试者，其在疾病的任何阶段，伴随或不伴随转移。本文所用术语“ErbB配体”指:表皮生长因子(EGF)基因产物(即蛋白或mRNA)，例如以GenBank登记号ΝΜ_001963或ΝΡ_001954示出；转化生长因子a (TGFa)基因产物(即蛋白或mRNA)，例如以GenBank登记号ΝΜ_003236或ΝΡ_003227示出；肝素-结合EGF-样生长因子(HB-EGF)基因产物(即蛋白或mRNA)，例如以GenBank登记号NM_001945或ΝΡ_001936示出；双调蛋白(AR)基因产物(即蛋白或mRNA)，例如以GenBank登记号NM_001657或NP_001648示出；β动物纤维素(BTC)基因产物(即蛋白或mRNA)，例如以GenBank登记号001729或NP_001720示出；表皮调节素(EPR)基因产物(即蛋白或mRNA)，例如以GenBank登记号NM_001432或NP_001423示出；epigen基因产物(即蛋白或mRNA)，例如以GenBank登记号NM_001013442或NP_001013460示出；神经调节蛋白基因产物(即蛋白或mRNA)，包括神经调节蛋白I (NRGl)，例如以GenBank登记号NM_004495或NP_004486示出，神经调节蛋白2 (NRG2)，例如以GenBank登记号NM_013981或NP_053584示出，神经调节蛋白3 (NRG3)，例如以GenBank登记号NM_001010848或NP_001010848示出，和神经调节蛋白4 (NRG4)，例如以GenBank登记号NM_138573或NP_612640示出。
如下表I所示，并在以下实施例部分的实施例1中阐述，本发明人已发现癌细胞分泌上调水平的ErbB配体及其不同的组合。本文所用ErbB配体的量，指细胞内、细胞膜、细胞表面和/或近基细胞的ErbB配体(例如ErbB配体mRNA、ErbB配体多肽)的量。本文所用ErbB配体的活性指ErbB配体与其适当的ErbB受体的结合(例如EGF、TGF α或HB-EGF与ErbB-1受体的结合)并激活ErbB配体(例如激活细胞内信号转导途径)。为了选择用于治疗过度增生性疾病的靶，首先从受试者获取生物样品并分析ErbB配体的量和/或活性。按照一个实施方案，所述样本包含流体，例如血液、血浆、唾液等。所述样品可以包含细胞，包括但不限于血细胞、骨髓细胞、胰脏细胞、肺细胞、肝细胞、脾细胞、肾细胞、心细胞、卵巢细胞、乳腺组织细胞、皮肤细胞(例如上皮细胞、成纤维细胞、角质化细胞)、淋巴结细胞。按照特定实施方案，所述细胞包含癌细胞。可以用本领域已知方法获取所述细胞,所述技术包括但不限于:细针活检、穿刺针活检、芯针活检(coreneedle biopsy)和手术活检(例如脑或肝活检)、口腔粘膜涂片和灌洗。然后可使用本领域已知的任何结构、生物或生化方法检测样品中ErbB配体的量和/或活性，所述方法为本领域已知用于检测编码ErbB配体的RNA表达水平(使用例如RNA印迹分析、RT-PCR分析、RNA原位杂交染色、原位RT-PCR染色)或ErbB配体蛋白自身(使用例如蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选术(FACS)、免疫组织化学分析)的方法。然后将ErbB配体的量或活性与对照样品中ErbB配体的量或活性进行比较。如果与对照样品相比测试样品中ErbB配体的量或活性增加(例如至少1.5倍、至少2倍、至少5倍)，则可将该配体选为治疗靶。与受试者样品比较的对照样品可以从通常为相同物种、年龄和来自相同亚群(例如吸烟者/非吸烟者)的典型健康个体获得。或者，对照样品可以源自患者自身，但是源自非过度增生组织(例如非癌组织)。或者，对照数据可取自数据库和文献。一旦选择适合的靶，则可使用下调其量和/或活性的任何作用剂实现治疗。本文所用术语“下调”当涉及到靶的量和/或活性时，指预防、降低、抑制、减少和/或消除ErbB配体的量和/或活性。按照一个实施方案，实现降低以使与对照样品比较该水平没有实质提高。按照另一实施方案，最大化降低该水平以便完全消除ErbB配体的活性。按照本发明该方面，可将多种作用剂用于降低/下调过度增生细胞(例如癌细胞)中ErbB配体的量和/或活性。因此，例如，可使用干扰转录和/或翻译的各种各样的分子(例如，反义分子、SiRNA、核酶、DNA酶)在基因组和/或转录水平，或使用例如拮抗物、抗体、切割多肽或抑制肽功能的酶等在蛋白质水平，降低ErbB配体表达水平。以下是能降低本发明ErbB配体的量和/或活性的作用剂的列表。能下调本发明ErbB配体(或降低其表达水平)的作用剂的一个实例，是能特异性结合ErbB配体的抗体或抗体片段。优选抗体特异地结合ErbB配体至少一个表位(例如ErbB配体的EGF-样结构域)。按照一个实施方案，抗体对特定ErbB配体相对于任何其它ErbB配体具有至少2倍的亲和力。按照一个实施方案，抗体对特定ErbB配体相对于任何其它ErbB配体具有至少5倍的亲和力。按照一个实施方案，抗体对特定ErbB配体相对于任何其它ErbB配体具有至少10倍的亲和力。按照本发明该方面另一优选实施方案，抗体以至少I μΜ、200 nMUOO nM、l nM或
更高的最小亲和力与其靶ErBB配体结合。本发明该方面的抗体可以选自已存在的抗体(例如，可公开获得的杂交瘤或市购抗体)或按照本领域熟知方法生产的新生成的抗体，并且在下文中进一步描述。市购抗体的实例包括EGF单克隆抗体(例如来自Abazyme的Clone S-21)、HB-EGF单克隆抗体(例如来自R&D systems的Clone 125923和Clone 406316)和TGF α单克隆抗体(例如来自Abcam 的 Clone 134A-2B3 和 Clone 189-2130.1)。本文所用术语“表位”指抗体互补位与其结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由化学活性分子表面基团(groupings)例如氨基酸或碳水化合物侧链组成，并且通常具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。本发明所用术语“抗体”包括完整的分子及其功能片段，例如Fab、F(ab’ )2,Fv或单结构域分子，例如针对抗原表位的VH和VL。这些功能抗体片段定义如下:
(1)Fab，其为含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化全抗体以产生完整的轻链和一条重链的一部分来产生；
(2)Fab’，其为可通过用胃蛋白酶处理全抗体接着还原产生完整的轻链和重链的一部分来获得的抗体分子的片段，每个抗体分子获得两个Fab’片段；
(3)(Fab’)2，其为可通过用胃蛋白酶处理全抗体而无后续还原获得的抗体的片段；(Fab’) 2是通过两个二硫键结合在一起的两条Fab’片段的二聚体；
(4)Fv，定义为含有表达为双链的轻链可变区和重链可变区的经遗传工程改造的片
段；
(5)单链抗体("SCA")，含有轻链可变区和重链可变区的遗传工程改造的分子，其由适合的多肽接头连接为遗传融合的单链分子；和
(6)单结构域抗体，其由对抗原表现出足够亲和力的单VH或VL结构域组成。生产多克隆和单克隆抗体及其片段的方法为本领域熟知(参见例如=Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1988，通过引用并入本文；和下述实施例部分)。可通过蛋白水解抗体或通过在大肠杆菌(E.coll)或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA，来制备本发明的抗体片段。可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶水解全抗体来获得抗体片段。例如，可通过用胃蛋白酶酶促切割抗体提供标为F(ab’)2的5S片段，来产生抗体片段。可进一步用巯基还原剂并任选针对因二硫键切割而产生的巯基的封闭基团来切割该片段，以生产3.5SFab’单价片段。或者，用胃蛋白酶酶促切割直接产生两个单价Fab’片段和一个Fe片段。例如由以下文献阐述了这些方法:Goldenberg，美国专利号4，036, 945和4，331，647及其中包含的参考文献，这些专利通过引用以其整体并入本文。还参见Porter, R.R.[Biochem.J.73: 119-126 (1959)]。亦可使用其它切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步切割片段，或其它酶学、化学或遗传技术，只要片段与被完整抗体识别的抗原结合即可。
Fv片段包含VH和VL链的缔合物(association)。该缔合物可以是非共价的,其如 Inbar 等[Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA 69:2659-62 (19720]所述。或者，可变链可以由分子间二硫键连接或化学物质例如戊二醛交联。优选Fv片段包含由肽接头连接的VH和VL链。通过构建结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)，所述结构基因包含编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列。将结构基因插入表达载体，随后将其引入到宿主细胞例如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成具有桥连两个V结构域的接头肽的单链多肽链。例如在以下文献中阐述了生产sFv的方法:Whitlow和Filpula，Methods 2: 97-105(1991) ;Bird 等，Science 242:423-426 (1988) ;Pack 等，Bio/Technology 11:1271-77
(1993);和美国专利号4，946，778 ;其全部通过引用并入本文。抗体片段的另一种形式是编码单互补决定区(OTR)的肽。可通过构建编码目的抗体⑶R的基因来获得⑶R肽(“最小识别单位”)。例如，通过用聚合酶链式反应以从抗体生产细胞的RNA合成可变区，来制备所述基因。参见例如Larrick和Fry [Methods, 2:106-10 (1991)]ο非人(例如鼠类)抗体的人源化形式是免疫球蛋白的嵌合分子。免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F (ab') 2.sub.2或抗体的其它抗原结合子序列(subsequence))的嵌合分子，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供者抗体)的CDR残基取代，所述非人物种例如具有所期需特异性、亲和性和生产力(capacity)的小鼠、大鼠或兔。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基取代。人源化抗体亦可以包含既未在受者抗体又未在引入CDR或构架序列中发现的残基。一般而言，人源化抗体包含至少一种，通常两种可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的CDR区域，并且全部或基本上全部FR区域是人免疫球蛋白共有序列的FR区域。人源化抗体最佳还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常为人免疫球蛋白恒定区[Jones 等，Nature, 321:522-525 (1986) ;Riechmann 等，Nature, 332:323-329(1988)和 Presta, Curr.0p.Struct.Biol., 2:593-596 (1992)]。用于使非人抗体人源化的方法为本领域熟知。人源化抗体通常具有一个或多个引入其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为输入残基，其通常来自输入可变结构域。人源化可基本上按照Winter及其同事的方法[Jones等，Nature, 321:522-525 (1986) ;Riechmann 等，Nature 332:323-327 (1988) ；Verhoeyen等，Science, 239:1534-1536 (1988)]来实施，其通过用啮齿动物⑶R或⑶R序列取代人抗体相应的序列来实现。因此，所述人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4，816，567)，其中基本上小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体类似位点的残基取代的人抗体。亦可使用本领域已知的各种技术生产人抗体，所述技术包括噬菌体展示文库[Hoogenboom 和 Winter, J.Mol.Biol., 227:381 (1991) ;Marks 等，J.Mol.Biol.,222:581 (1991)]。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, 第 77 页(1985) 和Boerner等，J.1mmunol., 147 (I):86-95 (1991)]。相似地,可通过将人免疫球蛋白位点引入到转基因动物中来制备人抗体，所述转基因动物例如其中内源性免疫球蛋白基因已部分或全部失活的小鼠。当受到攻击时，观察到人抗体产生，这在各方面与在人中看到的极其相似，包括基因重排、组装和抗体谱。该方法在例如以下文献中阐述:美国专利号5，545，807,5, 545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016 和以下科学出版物:Marks 等，Bio/Technology 10: 779-783 (1992) ;Lonberg 等，Nature 368: 856-859
(1994)；Morrison, Nature 368 812-13 (1994) ;Fishwild 等，Nature Biotechnology
14,845-51 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)和 Lonberg和Huszar, Intern.Rev.Tmmunol.13, 65-93 (1995)。应该了解，可以使用细胞内抗体(也被称为“胞内抗体(intrabodies)”)来实现靶向细胞内特定区室。这些基本上是已被添加胞内定位信号(例如，ER、线粒体、核、胞质的)的SCA。该技术已成功应用于本领域(综述参见Richardson和Marasco, 1995,TIBTECH第13卷)。已显示胞内抗体实质上消除其它大量细胞表面受体的表达，并抑制细胞内蛋白功能(参见例如，Richardson 等，1995，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92: 3137-3141 ;Deshane 等，1994，Gene Ther.1: 332-337 ;Marasco 等，1998 HumanGene Ther 9: 1627-42 ;Shaheen 等，1996 J.Virol.70: 3392-400 ；fferge, Τ.Μ.等，1990, FEBS Letters 274:193-198 ；Carlson, J.R.1993 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:7427-7428 ；Biocca, S.等，1994，Bio/Technology 12: 396-399 ；Chen, S_Y.等，1994, Human Gene Therapy 5:595-601 ;Duan, L等，1994，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 91:5075-5079 ；Chen, S_Y.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 91:5932-5936 ;Beerli, R.R.等，1994，J.Biol.Chem.269:23931-23936 ；Mhashilkar, A.M.等，1995，EMBO J.14:1542-1551 ；Marasco 等的 PCT
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