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一种肿瘤标志物的制作方法【专利摘要】本发明一方面提供了一种确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包括检测该受试者的血液样本中Hsp90α的浓度，如果该浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15％范围内的数值均被视为具有等同判定意义。【专利说明】一种肿瘤标志物【
技术领域：
】[0001]本发明涉及肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等16种肿瘤的诊断、病情监测和疗效评价等。更具体地说，本发明涉及通过热休克蛋白90α定量检测辅助诊断肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤和进行病情监测和疗效评价的方法。【
背景技术：
】[0002]热休克蛋白90a(HSp90a)是一个含量丰富的细胞内伴侣蛋白。近年来研究显示，Hsp90a可以被癌细胞特异性的分泌到细胞外，且与癌症的发生和发展密切相关。本研究组已发现，分泌到胞外的Hsp90a可以在外周血中很方便的被定量检测，其含量与肿瘤的负荷和恶性程度呈现一定的相关性，但并没有任何数据能够指导该项指标在肿瘤临床中的应用。因此，如何将分泌型Hsp90a应用于肿瘤临床实践是亟待解决的问题。【
发明内容】[0003]本发明一方面提供了一种确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包括检测该受试者的血液样本中Hsp90a的浓度，如果该浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15%范围内的数值均被视为具有等同判定意义。[0004]本领域技术人员可以理解，由于检测方法的局限性，要做到浓度测定结果完全准确是相当困难的。根据本领域的惯常做法，上下偏差15%以内可以被认为是合理误差。例如当所述阈值选定为50ng/ml时，如果受试者的测量值为43ng/ml，也可以判定该受试者患有癌症，或者具有较商的摧患癌症的风险。[0005]在本发明中，所述血液样本可以为血浆或血清样本。在本发明的优选实施方案中，血浆样本是优选的，其测量精度更高。[0006]所述Hsp90a的阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117叩/1111。例如，在本发明一个具体实施方案中，针对肺癌的特别优选的阈值是67.47ng/ml(可以四舍五入取67ng/ml)，此时对应的特异度为85%，灵敏度为64%。在上述阈值±15%的范围内的数值均可视为等同的判定范围。[0007]在本发明一个具体实施方案中，针对肺癌的一个优选的阈值是82ng/ml，即Hsp90a的浓度为〇-82ng/ml时被认为是正常值范围；在本发明一个优选实施方案中，针对肺癌的一个特别优选的阈值是53ng/ml，即Hsp90a的浓度为〇-53ng/ml时被认为是正常值范围。同样的，在上述阈值±15%的范围内的数值均可视为具有等同判定意义。所述血液样本优选为血浆样本。[0008]本发明另一方面提供了一种用于对正在接受治疗的癌症患者进行病情监测和/或疗效评价或者用于对候选治疗药物进行疗效评价的方法，包括在治疗前及治疗后分别检测受试者的血液样本中Hsp90a的浓度，如果治疗后Hsp90a的浓度相对于治疗前Hsp90a浓度增加的百分比达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者病情进展和/或疗效较差，或者判定所述候选治疗药物疗效较差，其中所述阈值选自10%到50%的范围内，例如所述阈值可以为34%，且所述阈值±15%范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地,所述血液样本为血浆样本。[0009]此处所用的术语"治疗"应当做广义的理解。例如，在对肺癌患者进行治疗时，可能涉及多个治疗周期，例如总共8个治疗周期。如果将整个治疗过程作为一个整体来看，可以在第1个治疗周期开始前和第8个治疗周期结束后，分别对Hsp90α的浓度进行检测，并据此判断整个治疗过程的效果。或者，也可以将每个治疗周期视为一次"治疗"（例如出于获得更精确评估结果的目的）。例如，可以在每个治疗周期开始前和结束后，均对Hsp90α的浓度进行检测，并据此判断单个治疗周期的效果。或者，还可以进行更精确的评估。例如，在单个治疗周期包括总共20天治疗的情况下，可以将每一天视为一次"治疗"，在当天的治疗开始前和当天的治疗结束后，分别对Hsp90α的浓度进行检测，从而判断当天的治疗效果。本领域技术人员可以根据不同的评估要求，具体设定"治疗"的时间跨度。[0010]本发明还提供了确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包括联合检测该受试者的血液样本中Hsp90a的浓度以及至少一种其他肿瘤标志物的浓度，如果Hsp90a的浓度和所述至少一种其他肿瘤标志物的浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中Hsp90a的阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15%范围内的数值均被视为具有等同判定意义。所述血液样本优选为血浆样本，所述至少一种其他肿瘤标志物优选选自由癌胚抗原（CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)、AFP、CA19-9、CA125、CA15-3、PSA和CA72-4构成的组。[0011]根据本发明的优选实施方案，本发明方法中Hsp90a的浓度优选地采用EDTA-K2作为抗凝剂进行检测。[0012]本发明的方法适用的癌症种类包括：肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌。[0013]本发明还提供了用于确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的试剂盒，包括：任选的人分泌型Hsp90a、人分泌型Hsp90a单克隆抗体、检测试剂以及说明书，其中所述说明书中标明了健康人血液样本中Hsp90a浓度的阈值，如果受试者的血液样本中Hsp90a的浓度达到或超过所述阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50叫/1111到1201^/1111的范围，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117叩/1111，且所述阈值±15%范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地,所述血液样本为血浆样本。[0014]此处所用的术语"任选的"表示可以有，也可以没有。例如，"任选的人分泌型Hsp90a"，是指本发明的试剂盒可以包括人分泌型Hsp90a，也可以不包括人分泌型Hsp90a。例如，可以将人分泌型Hsp90a单独包装，并与试剂盒的主体部分联合使用。优选地，出于方便使用的目的，本发明的试剂盒中包括人分泌型Hsp90a，用作检测时的标准品。特别优选的是重组人分泌型Hsp90a。[0015]根据本发明的优选实施方式，所述试剂盒中可以包括用于采集血液样本的容器，并且该容器中包含EDTA-K2。在本发明的优选实施方案中，所述用于采集血液样本的容器为包含EDTA-K2的采血管。[0016]根据在本发明的具体实施方案，Hsp90α的浓度采用EDTA-K2作为抗凝剂进行检测是优选的。[0017]本发明的试剂盒适用的癌症种类包括：肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌。[0018]本发明的实施例中还将Hsp90a定量检测在癌症辅助诊断和疗效监测中的有效性研究方法应用于多种癌症，发现Hsp90a浓度在癌症诊断中的阈值范围对肺癌、肝癌、结直肠癌和乳腺癌等同样适用，并提供了肿瘤标志物Hsp90a定量检测用于肺癌、肝癌、结直肠癌和乳腺癌诊断的具体统计学参数。[0019]本发明的实施例中根据不同人群的数据绘制相应的R0C曲线。根据本领域公知技术，每一条R0C曲线都提供了一系列阈值及与之相对应的灵敏度和特异度。因此，使用这些R0C曲线，本领域技术人员能很容易地查出选取任意阈值（即cut-off值）时该项检测对疾病的识别能力，即诊断相应癌种的灵敏度、特异度和符合率。例如：[0020]当适应症为肝癌时，患者相对于健康人的cut-off值是52.79ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是93.7%，85%和94.5%，当cut-off值是62.20ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是91.4%，90%和92.2%;患者相对于非癌症肝部相关疾病的cut-off值是63.66ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是90.7%，90%和90.3%，当cut-off值是85.24ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是80.7%，95%和88.6%。[0021]当适应症是结直肠癌时，患者相对于健康人及非癌症结直肠相关疾病组的cut-off值是52.79ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是89.9%，85%和87%，当cut-off值是62.20ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是83.4%，90%和87%。[0022]当适应症为乳腺癌时，患者相对于健康人的cut-off值是52.66ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是65.6%，85%和73.85%，当cut-off值是61.92ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是54.6%，90%和69.68%;患者相对于非癌症乳腺相关疾病组的cut-off值是63.4lng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是52.4%，84.9%和68.29%，当cut-off值是72.21ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是41.9%，90.1%和65.41%。[0023]本领域技术人员可以理解，由于受试人群和瘤种的不同，cut-off值的选取及其对应的灵敏度、特异度和符合率等参数会有所差别，但均包含在本发明限定的阈值范围内。本领域技术人员可以根据实际使用需求，如对特定瘤种、灵敏度、特异度等的要求，从本发明公开的R0C曲线或阈值范围内选取适当的优选阈值。[0024]本发明还验证了肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌患者手术后血浆Hsp90a含量比手术前显著降低，因此该项检测指标可以作为手术治疗效果评价的手段。同时，临床获益的(CR+PR+SD)接受内科治疗的患者，在治疗后的检测值显著低于治疗前，说明该项指标可以用于上述癌症的内科治疗疗效评价。[0025]本发明的实施例中检测了胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌、前列腺癌等多种癌症患者血浆Hsp90a含量，发现与健康人相比均显著升高（具有统计显著性），并分别提供了上述不同癌种患者血浆Hsp90a含量的平均参考值。这说明肿瘤标志物Hsp90a可用于胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌、前列腺癌等多癌症的诊断。【专利附图】【附图说明】[0026]图1是Hsp90α检测结果的ROC曲线（基于所有检测Hsp90α的受试者）。[0027]图2是Hsp90α检测结果的R0C曲线AUC95%CI(0·788,0·829)。[0028]图3是Hsp90α检测结果的R0C曲线AUC95%CI(0·811，0·854)。[0029]图4是Hsp90α检测结果的R0C曲线AUC95%CI(0·804,0·850)。[0030]图5是Hsp90α检测结果的R0C曲线AUC95%CI(0·731，0·777)。[0031]图6是根据斜率判定肿瘤增大的R0C曲线。[0032]图7是根据变化百分比判定ro的R0C曲线。[0033]图8是根据变化值判定ro的R0C曲线。[0034]图9显示了EDTA-K2采血管样本和EDTA-K3采血管样本的对比。[0035]图10是肝癌患者相对于健康人的R0C曲线。[0036]图11是肝癌患者相对于非癌肝部相关疾病人群的R0C曲线。[0037]图12是结直肠癌患者相对于健康人及非癌结直肠相关疾病的R0C曲线。[0038]图13是乳腺癌患者相对于健康人的R0C曲线。[0039]图14是乳腺癌患者相对于非癌乳腺相关疾病人群的R0C曲线。[0040]图15是多种癌症患者血浆Hsp9〇a含量检测结果汇总。[0041]图中，"ROCCurveforModel"表不针对模型的R0C曲线，"AreaundertheCurve"表示曲线下面积，"Specificity"表示特异度，"Sensitivity"表示灵敏度。【具体实施方式】[0042]本文所用的术语"血液样本"是指由受试者的血液获得的样本。考虑到细胞内Hsp90a对检测的干扰，血液样本优选为血浆或血清样本，也可以是由血浆或血清稀释后的样本。本领域技术人员可以理解，由于在成分上的区别，当采用受试者的血浆样本和血清样本分别进行检测时，Hsp90a的浓度可能会略有不同。出于便于定量和比较的目的，在本发明中血浆样本是优选的。[0043]本文所用的术语"特异度"、"灵敏度"、"符合率"均与相对应的医学统计学术语具有相同的含义。[0044]"特异度"（specificity)是指诊断为"非癌症"的病例中经试剂盒检测为阴性的比例。[0045]"灵敏度"（sensitivity)是指病理学诊断为"癌症"的病例中，经试剂盒检测为阳性的比例。[0046]"符合率"(accuracy)是指真阳性样本量与真阴性样本量之和占总样本量的比例，反映试剂盒检测结果与受试者是否罹患癌症的真实情况相符合的程度。[0047]本文所用的术语"cut-off值"、"界值""参考值"和"阈值"可以互换使用，指的是用来判断检测结果的标准，即临界值，检测结果高于cut-off值即视为阳性，低于cut-off值即视为阴性。[0048]本文所用的术语"临床获益"，指经过某种治疗达到病情稳定或缓解的情况，其中CR、PR和SD具有与实体瘤疗效评价标准（RECIST标准）中相应术语完全相同的含义，即CR(Completeresponse)肿瘤完全缓解、PR(Partialresponse)肿瘤部分缓解和SD(Stabledisease)疾病稳定。CR、PR和SD这三项指标作为临床获益人群的界定，与此相反的是H)(Progressivedisease)即疾病进展。[0049]本文所用术语"非癌相关疾病"指经病理学诊断确诊为不是癌症但患有良性相关疾病的患者，如在肺癌试验中指确诊为不是肺癌但患有肺炎、肺结核等肺部良性相关疾病的患者，在肝癌试验中指确诊为不是肝癌但患有肝炎、肝硬化等肝部良性相关疾病的患者，在结直肠癌试验中指确诊为不是结直肠癌但患有炎症、结直肠息肉等结直肠良性相关疾病的患者，在乳腺癌试验中指确诊为不是肺、乳腺癌癌但患有乳腺炎、乳腺增生等乳腺良性相关疾病的患者。[0050]本文中所用的部分缩写及统计术语含义如下表所示：【权利要求】1.确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包括检测该受试者的血液样本中Hsp90α的浓度，如果该浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117叩/1111，且所述阈值±15%范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。2.用于对正在接受治疗的癌症患者进行病情监测和/或疗效评价或者用于对候选治疗药物进行疗效评价的方法，包括在治疗前及治疗后分别检测受试者的血液样本中Hsp90a的浓度，如果治疗后Hsp90a的浓度相对于治疗前Hsp90a浓度增加的百分比达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者病情进展和/或疗效较差，或者判定所述候选治疗药物疗效较差，其中所述阈值选自10%到50%的范围内，例如所述阈值可以为34%，且所述阈值±15%范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。3.确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包括联合检测该受试者的血液样本中Hsp90a的浓度以及至少一种其他肿瘤标志物的浓度，如果Hsp90a的浓度和所述至少一种其他肿瘤标志物的浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中Hsp90a的阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117叩/1111，且所述阈值±15%范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。4.权利要求1-3之任一项的方法，其中所述癌症选自由肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌构成的组。5.权利要求3-4之任一项的方法，其中所述至少一种其他肿瘤标志物选自由CEA、CYFRA21-1、AFP、CA19-9、CA125、CA15-3、PSA和CA72-4构成的组。6.权利要求1-5之任一项的方法，其中所述Hsp90a的浓度采用EDTA-K2作为抗凝剂进行检测。7.用于确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的试剂盒，包括：任选的人分泌型Hsp90a、人分泌型Hsp90a单克隆抗体、检测试剂以及说明书，其中所述说明书中标明了健康人血液样本中Hsp90a浓度的阈值，如果受试者的血液样本中Hsp90a的浓度达到或超过所述阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50叩/1111到1201^/1111的范围，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15%范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。8.权利要求7的试剂盒，其中所述癌症选自由肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌构成的组。9.权利要求7-8之任一项的试剂盒，其中所述试剂盒中包括用于采集血液样本的容器，并且该容器中包含EDTA-K2、EDTA-K3或肝素；优选地，所述容器为包含EDTA-K2的采血管。10.权利要求7-9之任一项的试剂盒，其中所述Hsp90a的浓度采用EDTA-K2作为抗凝剂进行检测。11.EDTA-K2作为抗凝剂在收集用于Hsp90α肿瘤标志物检测的血液样本中的用途。【文档编号】G01N33/574GK104251906SQ201410302717【公开日】2014年12月31日申请日期:2014年6月27日优先权日:2013年6月27日【发明者】罗永章,崔大伟,付彦,吴非,宋晓敏,李米川,常国栋,路春桃申请人:清华大学,烟台普罗吉生物科技发展有限公司,北京普罗吉生物科技发展有限公司