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专利名称：一种橙皮甙含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及生物测试领域，尤其涉及维生素C和柑橘生物类黄酮复合制剂中橙皮甙含量的測定方法。
背景技术：
柑橘生物类黄酮是从柑橘果实中提取出来的一系列具有显著生物活性的黄酮类化合物，柑橘类黄酮具有独特的芳香性、良好的水溶性和显著的药理作用。柑橘类黄酮功能有:1、调节血脂，降低血液粘稠度，改善血清脂质，延长红血球寿命并增强造血功能，预防心脑血管疾病。2、抑制HL-60白血病细胞生长和溶解癌细胞的作用。3、能够有效清除体内的自由基及毒素，预防、減少疾病的发生。4、消炎、抗过敏、广谱抗菌、抗病毒作用。维生素C具有抗氧化性，能保护人体免受自由基的伤害，有助巩固细胞组织，強健骨骼和牙齿，增强免疫力，预防感冒等疾病及促进钙、铁的吸收，帮助胶原蛋白合成。在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏它可引起坏血病。柑橘生物类黄酮可以防止维生素C被氧化破坏，而维生素C能促进柑橘生物类黄酮的生物活性，以适当的配比将两者组成复合制剂，能产生协调作用，更好地发挥柑橘生物类黄酮和维生素C的保健作用。
柑橘生物类黄酮和维生素C复合制剂尚未有正式的国家标准，在主要活性成分橙皮甙定量检测方面没有系统、完善的检测方法。《中国药典》2010版中陈皮的橙皮甙测定方法为:色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:醋酸:水(35:4:61)为流动相，供试品提取:在索氏提取器中，加石油醚(60 90°C )80ml，加热回流2 3小时，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇80ml，再加热回流至提取液无色，放冷，滤过，滤液置IOOml量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。该方案如用于柑橘生物类黄酮混合物中橙皮甙的測定，一是供试品溶液杂质太多，等度洗脱不能将杂质完全清除，ニ是索氏提取样品前处理复杂，前处理时间过长，三是没有考虑到维生素C对于橙皮甙提取的干扰，该方法并不完全适用于柑橘生物类黄酮和维生素C复合制剂中橙皮甙的測定。因此，有必要针对该产品的特点制定橙皮甙的检测方法。

发明内容
本发明的目的是提供ー种橙皮甙含量的測定方法，它操作简便快捷、专属性好和重复性好、回收率高、能够准确测定橙皮甙的含量，便于柑橘生物类黄酮和维生素C复合制剂质量控制。本发明是这样实现的:ー种橙皮甙含量的測定方法，其特征在于包括以下步骤:
(I)稀释溶液的制备:取20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.5 1.5:1.5
0.5比例混合均匀；(2)萃取溶液的制备:取75mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按
0.9 1.1:1.1 0.9比例混合均匀；(3)对照品溶液的制备:精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.05mg/ml的对照品溶液；(4)供试品溶液的制备:精密称取550-650mg样品于IOOml容量瓶中，加入80ml萃取溶液，60 70°C超声提取10 20min，取出，冷却至室温后，用萃取溶液定容至刻度，取部分溶液用微孔滤膜过滤后备用；
(5)确定色谱条件:色谱柱:C18色谱柱,4.6mmX 250mm, 5 u m ;流动相A:0.1%三氟こ酸水溶液；流动相B:0.1%三氟こ酸的甲醇-こ腈1:1溶液；柱温:35°C;流速:lml/min ;进样量:20 ii 1 ；检测波长:292nm ;按流动相A:流动相B=90% 10% 90%:10% 90% 10%进行梯度洗脱，梯度洗脱时间见图1 ;保留时间:柚皮甙约17.6min 橙皮甙约18.0min ；
(6)检测程序:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 u 1，注入液相色谱仪，測定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙皮甙的保留时间；系统适应性条件:完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到:理论塔板数大于2000，橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5 ；通过测得数据计算橙·皮甙含量橙皮甙mg/g=A# XC对X IOOA5itXWt^式中:C对:橙皮甙标准工作溶液浓度mg/ml ；A#:样品峰面积:橙皮甙标准工作溶液峰面积平均值:样品的质量mg。本发明操作简便快捷、专属性和重复性好、回收率高、能够准确測定橙皮甙的含量，便于柑橘生物类黄酮和维生素C复合制剂质量控制。


图1是本发明的梯度洗脱时间。
具体实施例方式—种橙皮甙含量的測定方法，其特征在于包括以下步骤:(1)稀释溶液的制备:取20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.5 1.5:1.5 0.5比例混合均匀；(2)萃取溶液的制备:取75mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.9 1.1:1.1 0.9比例混合均匀；(3)对照品溶液的制备:精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.05mg/ml的对照品溶液；(4)供试品溶液的制备:精密称取550-650mg样品于IOOml容量瓶中，加入80ml萃取溶液，60 70°C超声提取10 20min，取出，冷却至室温后，用萃取溶液定容至刻度，取部分溶液用微孔滤膜过滤后备用；(5)确定色谱条件:色谱柱:C18色谱柱，4.6mmX250mm，5iim ;流动相A:0.1%三氟こ酸水溶液；流动相B:0.1%三氟こ酸的甲醇-こ腈1:1溶液；柱温:35°C ;流速:lml/min ;进样量:20iil；检测波长:292nm ;按流动相A:流动相B=90% 10% 90%: 10% 90% 10%进行梯度洗脱，梯度洗脱时间见图1 ;保留时间:柚皮甙约17.6min橙皮甙约18.0min ; (6)检测程序:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 yl，注入液相色谱仪，測定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙皮甙的保留时间；系统适应性条件:完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到:理论塔板数大于2000，橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5 ;通过测得数据计算橙皮甙含量橙皮甙11^/^=八#\(:对\100/^对\胃# 式中:( :橙皮甙标准工作溶液浓度mg/ml ；A#:样品峰面积:橙皮甙标准工作溶液峰面积平均值;W#:样品的质量mg。具体实施吋，(1)根据橙皮甙易溶于稀碱液以及样品中含有大量的呈酸性的维生素C的特点，以20mmol/L的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液混合溶液作为对照品的稀释溶剤，以75mmol/L的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液混合溶液作为样品的萃取溶剤。使得对照品、供试品溶液保持在PH值8 9，兼顾了橙皮甙的提取和样品峰的柱效。(2)碱溶液有效地提高了橙皮甙的提取效率，50%甲醇溶液改善橙皮甙峰形的対称性。(3) 50 90°C超声提取5 20分钟，较传统的索氏提取法脱脂回流几个小时，效率极大提高。(4)流动相加入0.1%三氟こ酸既调节了流动相PH值，三氟こ酸本身也是离子对试剂。(5 )梯度洗脱通过改善流动相比例，最短时间内完成了所有成分的洗脱。(6)橙皮甙和柚皮甙的分离度、柱效测试，有效地监测了色谱条件。本发明专属性好、重复性好、回收率高，对柑橘生物类黄酮橙皮甙的检测更为有效。下面用实验例进ー步说明本发明:
实施例1.维生素C和柑橘生物类黄酮复合制剂
(1)稀释溶液的配制:20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按1:1比例混合均
匀；
(2)萃取溶液的配制:75mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按1:1比例混合均
匀；
(3)对照品溶液的制备:精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.05mg/ml的对照品溶液；
(4)供试品溶液的制备:精密称取600mg样品于IOOml容量瓶中，加入80ml萃取溶液，65°C超声15min，取出，冷却至室温后，用萃取溶液定容至刻度，取部分溶液用0.45 y m微孔滤膜过滤后备用；
(5)色谱条件:
色谱柱:C18 色谱柱，4.6mmX 250mm, 5 u m ；
流动相和梯度:流动相用0.45 ii m微孔滤膜过滤后，脱气；
流动相A:0.1%三氟こ酸水溶液；
流动相B:0.1%三氟こ酸的甲醇-こ腈1:1溶液；
梯度洗脱时间见图1 ; 柱温:35°C流速:lml/min检测波长:292nm ;
(6)检测程序:
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 yl，注入液相色谱仪，測定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙皮甙的保留时间；
系统适应性条件:完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到:理论塔板数大于2000，橙皮甙和柚皮苷的分离度大于1.5。通过测得数据计算橙皮甙含量:橙皮甙mg/g=A# XC对X 100/A# Xff#测定结果:橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5，理论塔板数大于2000。本品含橙皮甙8.51mg/g。实施例2.维生素C和柑橘生物类黄酮复合制剂批号:CT4Y123002
(1)稀释溶液的配制:20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按1.5:0.5比例混合均匀；
(2)萃取溶液的配制:75mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.9:1.1比例混合均匀；
(3)对照品溶液的制备:精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.05mg/ml的对照品溶液；
(4)供试品溶液的制备:精密称取550mg样品于IOOml容量瓶中，加入80ml萃取溶液，60°C超声20min，取出，冷却至室温后，用萃取溶液定容至刻度，取部分溶液用0.45 y m微孔滤膜过滤后备用；
(5)色谱条件:
色谱柱:C18 色谱柱，4.6mmX 250mm, 5 u m ；
流动相和梯度:流动相用0.45 ii m微孔滤膜过滤后，脱气；
流动相A:0.1%三氟こ酸水溶液；
流动相B:0.1%三氟こ酸的甲醇-こ腈1:1溶液；
梯度洗脱的时间见图1 ;
柱温:35°C流速:lml/min检测波长:292nm ;
(6)检验程序:
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 yl，注入液相色谱仪，測定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙皮甙的保留时间；
系统适应性条件:完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到:理论塔板数大于2000，橙皮甙和柚皮苷的分离度大于1.5。通过测得数据计算橙皮甙含量:橙皮甙mg/g=A# XC对X 100/A# Xff#测定结果:橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5，理论塔板数大于2000。

本品含橙皮甙8.62mg/g。实施例3.维生素C和柑橘生物类黄酮复合制剂批号:CT4Y123003
(1)稀释溶液的配制:20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.5:1.5比例混合均匀；
(2)萃取溶液的配制:75mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按1.1:0.9比例混合均匀；
(3)对照品溶液的制备:精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.05mg/ml的对照品溶液；
(4)供试品溶液的制备:精密称取650mg样品于IOOml容量瓶中，加入80ml萃取溶液，70°C超声15min，取出，冷却至室温后，用萃取溶液定容至刻度。取部分溶液用0.45 y m微孔滤膜过滤后备用；
(5)色谱条件:
色谱柱:C18 色谱柱，4.6mmX 250mm, 5 u m ；
流动相和梯度:流动相用0.45 ii m微孔滤膜过滤后，脱气；
流动相A:0.1%三氟こ酸水溶液；
流动相B:0.1%三氟こ酸的甲醇-こ腈1:1溶液；
梯度洗脱的时间见图1 ;
柱温:35°C ；流速:lml/min ；检测波长:292nm ；
(6)检验程序:
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 yl，注入液相色谱仪，測定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙皮甙的保留时间；
系统适应性条件:完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到:理论塔板数大于2000，橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5。通过测得数据计算橙皮甙含量:橙皮甙mg/g=A# XC对X 100/A# Xff#测定结果:橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5，理论塔板数大于2000。
本品含橙皮甙8.55mg/g。方法学考察
I)、线性与范围
取标准储备溶液，分别稀释五个浓度，读取峰面积；以峰面积和浓度作线性回归方程，相关系数RS ≥0.999。2)、专属性试验
准确称取样品600mg于IOOml棕色容量瓶中，配成溶液过滤后进样，注入液相色谱仪进行測定，受用DAD记录全光谱，进行峰纯度检查，纯度因子≥980。3)、溶液稳定性试验:取样品溶液进行稳定性试验，分别测定放置0、4、8、12、16、20、24、28小时后的含量，峰面积RSD≤2.0%。4)、系统适用性试验
取对照品溶液连续进样六针，分别计算橙皮甙和柚皮苷色谱峰的峰面积和理论塔板数以及二色谱峰的分离度，峰面积的RSD≤2.0% ;理论塔板数均≥2000 ;分离度均1.5。5)、重复性试验:称取样品6份，按上述色谱条件分别进样，计算样品的含量，含量RSD ≤ 2.0%。6)、加样回收率
试验称取维生素C和柑橘生物类黄酮复合制剂适量溶解配成高中低三种不同浓度的溶液，分别加入样品中，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行測定，回收率在95.0% 105.0% 之间。
权利要求
1.一种橙皮甙含量的測定方法，其特征在于包括以下步骤: (1)稀释溶液的制备:取20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.5 1.5:.1.5 0.5比例混合均匀； (2)萃取溶液的制备:取75mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.9 1.1:.1.1 0.9比例混合均匀； (3)对照品溶液的制备:精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.05mg/ml的对照品溶液； (4)供试品溶液的制备:精密称取550-650mg样品于IOOml容量瓶中，加入80ml萃取溶液，60 70°C超声提取10 20min，取出，冷却至室温后，用萃取溶液定容至刻度，取部分溶液用微孔滤膜过滤后备用； (5)确定色谱条件: 色谱柱:C18色谱柱,4.6mmX 250mm, 5 u m ;流动相A:0.1%三氟こ酸水溶液；流动相B:.0.1%三氟こ酸的甲醇-こ腈1:1溶液；柱温:35°C ;流速:lml/min ;进样量:20iil ；检测波长:292nm ;按流动相A:流动相B=90% 10% 90%: 10% 90% 10%进行梯度洗脱，梯度洗脱时间见图1 ;保留时间:柚皮甙约17.6min橙皮甙约18.0min ； (6)检测程序: 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 u 1，注入液相色谱仪，測定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙 皮甙的保留时间； 系统适应性条件:完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到:理论塔板数大于2000，橙皮式和柚皮式的分离度大于1.5 ； 通过测得数据计算橙皮甙含量橙皮甙mg/g=A# XC对X IOOA5itXWt^式中:C对:橙皮甙标准工作溶液浓度mg/ml ；A#:样品峰面积A5it:橙皮甙标准工作溶液峰面积平均值;W样:样品的质量mg。
全文摘要
一种橙皮甙含量的测定方法，包括以下步骤(1)稀释溶液的制备；(2)萃取溶液的制备；(3)对照品溶液的制备；(4)供试品溶液的制备；(5)确定色谱条件；(6)检测程序。本发明操作简便快捷、专属性好、重复性好、回收率高、能够准确测定橙皮甙的含量，便于柑橘生物类黄酮和维生素C复合制剂质量控制。
文档编号G01N30/88GK103091437SQ20121045012
公开日2013年5月8日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者朱伟, 薛红芬 申请人:江苏艾兰得营养品有限公司