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专利名称：一种共聚焦光学扫描仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种共聚焦光学扫描仪，特别涉及使用电荷耦合装置(charge coupled device, CCD)禾口互补型氧化半导体(Complementary Metal Oxide Semiconductor,CMOS)等面阵探测器作为检测器的多针孔共聚焦光学扫描仪。本发明主要 应用于生物医学显微成像领域，也可用于材料研究和集成电路芯片检测成像。
背景技术：
随着细胞生物学研究的深入，显微镜成像的应用越来越普遍，荧光显微成像更是 受到广泛的重视，尤其是活细胞荧光实时成像。但是，普通宽场荧光显微镜存在轴向分辨 率低的问题，尤其在观察一些较厚的样品时，此问题尤为明显，甚至限制了荧光显微镜的使 用。为了解决普通宽场荧光显微镜轴向分辨率低的问题，获得理想的轴向分辨率，获取清 晰的荧光图像，尤其是三维荧光图像，科学家设计、制造了很多装置，如目前应用较多的激 光扫描共聚焦显微镜。这类激光扫描共聚焦显微镜的特点是通过一个针孔形成点光源扫 描照明样品，样品发射的荧光穿过针孔被光电倍增管采集，并通过计算机还原图像。因此， 获得的图像具有很高的轴向对比度。但是E. Wang和K. W. Dunn (Journal of Microscopy, Vol. 218， Pt 2May 2005， pp. 148-159)指出，因为只有一个针孔用以形成照明光束，并通过 振镜驱动光束扫描照明样品，所以该类单点共聚焦激光扫描仪成像速度慢；同时光电倍增 管灵敏度相对较低，需要较强的激光照明，导致样品被激光伤害，所以无法应用于活细胞 共聚焦成像，尤其是活细胞实时共聚焦成像。科学家一直在寻找解决的方法，以使共聚焦 成像适用于活细胞成像。据文章Trueconfocal resonant scanning :a better solution for high-speed multifluorescence optical sectioning(Nature Methods Application Notes 2006)报道，目前最新的单点共聚焦激光扫描仪技术共振扫描在较低的分辨率，如 512X512下，可获得25赫兹的扫描速度。但对于高分辨率下的扫描速度，共振扫描技术仍 然无法提高，所以应用还是受到限制。而且由于未能改善检测灵敏度低的问题，共振扫描无 法从根本上解决单点共聚焦激光扫描仪在活细胞成像领域中面临的问题。
因为单点共聚焦激光扫描仪存在的问题无法得到根本解决，科学家采用了转盘式 共聚焦扫描仪，即Nipkow disk confocal scanner,以提高扫描仪的扫描速度，并使用CCD、 EMCCD和CMOS等检测器来提高检测灵敏度。转盘式共聚焦扫描仪最重要的特征是l) 一 个以恒定速度旋转的、不透光的圆盘，圆盘上按照一定的规则排列了很多针孔或夹缝，针孔 或夹缝可使来自光源的光形成很多相互独立的扫描照明光束，并通过物镜投射在成像焦面 的样品上；当转盘式共聚焦扫描仪工作时，圆盘高速旋转使扫描光束快速地、持续地扫描照 明成像焦面的样品，样品发射的荧光通过针孔或夹缝被检测器采集。2)使用CCD、EMCCD和 CMOS等面阵检测器作为图像采集单元，检测器的曝光时间跟据观察的样品、照明强度的不 同而改变。由于其本身的结构原因，转盘共聚焦光学扫描仪无法完全避免以下三个问题
—、光源发射的光只有2%左右可以透过针孔并照在样品上，其余98%的光会被 转盘的不透光部分反射，形成杂散光。当检测器曝光成像时，部分杂散光会被探测到，产生
4较高的背景噪声，降低图像质量。尤其当样品的荧光强度较弱时，高强度的照明光产生的杂 散光背景噪声甚至会掩盖样品的荧光信号，即使延长检测器的曝光时间也无法检测到样品 发出的信号。为了解决这个问题，专利US4927254通过改变转盘转轴方向，使转盘转轴与物 镜的光轴有一个夹角。当光源发射的光照到转盘时，转盘不透光部分反射的大部分入射光 就会偏离物镜的光轴，不被检测器探测，所以很好地降低了该背景噪声。但是，该专利也引 入了新的问题由于转盘转轴与物镜的光轴存在夹角，转盘上的针孔并不完全是处于物镜 的同一成像焦面，从而导致图像变形，即使通过光学配件纠正，也只能部分解决图像变形的 问题。专利EP0539691A2则通过在针孔转盘和光源之间增加一个微透镜转盘，将光源发射 的光分束、独立聚焦在各个针孔，避免了转盘反射光，较好地解决了转盘反射光的背景噪声 等问题。 二、转盘共聚焦光学扫描仪工作时，转盘以恒定的速度高速旋转，样品在一定时间 里被完整的扫描一遍。当检测器的曝光时间刚好是这个扫描时间的整数倍时，样品被均 匀的照明，检测器可获取高质量图像。但是，当出于实验要求需要改变检测器曝光时间， 使其不等于扫描时间的整数倍，而转速又无法调整到与曝光时间匹配的速度时，样品被不 均匀的照明，检测器获取的图像有明显的亮暗条纹。F. K. Chong和Noe 1. G. Mchale在文 章Optimization ofspi皿ing disk confocal microscopy -synchronization with the ultra-sensitive EMCCD(Proceedingsof the SPIE，Vol. 5324， 2004)中清楚地指出了这一 点。在多色荧光成像时，由于需要根据亮度不一的各色荧光设定长短不一的曝光时间，图像 的亮暗条纹干扰尤为严重。 三、转盘上针孔由内往外地螺旋排列，并且所有针孔具有相同的直径。当转盘旋 转时，外径区域的针孔比内径区域的针孔具有更快的速度，即外径针孔在某一点的停留 时间更短，造成外径区域的照明强度比内经区域的弱，样品被不均匀的照明。尽管专利 EP0539691A2宣称采用了一种新的针孔排列方式，解决了转盘共聚焦扫描仪的这一问题，但 针孔的直径由内而外地与旋转半径同时增大，导致外径区域的轴向分辨率低于内径区域的 轴向分辨率，降低了图像质量。

发明内容
本发明的目的是针对目前各种共聚焦光学扫描仪存在的不足之处进行改进，如单 点共聚焦激光扫描仪扫描速度慢、灵敏度低，转盘共聚焦扫描仪有较高的杂散光背景噪声、 亮暗条纹干扰、照明强度不均一等问题，提供一种新的共聚焦光学扫描仪，从而高速地获取 高质量的共聚焦图像。 本发明的目的是通过以下的技术方案实现的 如图1所示，本发明提供一种共聚焦光学扫描仪，包括光源1 ;照明滤色片2 ;照 明透镜3 ;不透光的照明滑块4，其上排列着多个透光针孔5 ;滑块驱动电机6 ;滑块连杆7 ; 针孔透镜组8 ;二色分光镜9 ;不透光的成像滑块10，其上排列着多个透光针孔11 ;成像透 镜12 ;成像滤色片13 ;控制器17 ;其特征在于 所述光源1可选择使用激光、发光二极管、汞灯或氙灯作为光源； 所述照明滑块4垂直放置在照明透镜3的光轴上，分为不透光的4a、4b和4c三部 分，其中4b和4c可分别完全覆盖4a，所述4a部分排列了多个所述透光针孔5 ;
所述成像滑块10垂直放置在成像透镜12的光轴上，分为不透光的10a、、10b和 10c三部分，其中10b和10c可分别完全覆盖10a，所述10a部分排列了多个所述透光针孔 11 ; 所述针孔透镜组8和二色分光镜9位于所述照明滑块4和成像滑块10之间；
所述透光针孔11和针孔5通过针所述孔透镜组8和二色分光镜9形成一一对应， 即所述照明滑块4上的所述针孔5和所述成像滑块10上的所述针孔11， 二者通过所述针孔 透镜组8、二色分光镜9和显微镜物镜15在样品16上的投影的中心一一重合；
所述针孔11按照以下规则排列，如图6所示平行于所述滑块滑动方向的排列定 义为行，垂直于所述滑块滑动方向的排列定义为列；当两个所述针孔的中心在同一条平行 于所述滑块滑动方向的直线时，定义为同一行的两个针孔；当两个所述针孔的中心在同一 条垂直于所述滑块滑动方向的直线时，定义为同一列的两个针孔；每一行的所述针孔的数 量相等，每一列的所述针孔的数量相等；穿过所述每一行针孔的中心画多条直线，相邻的两 条直线的距离为所述相邻两行针孔的行间距，称为I ;穿过所述每一列针孔的中心画多条 直线，相邻的两条直线的距离为所述相邻两列针孔的列间距，称为J ;同一行的相邻两个所 述针孔的中心距离为K ;同一列的相邻两个所述针孔的中心距离为L ;所述针孔的排列使I、 J、 K和L与所述针孔大小r有以下等式关系
0 < I《2r
L = nXI，
K2 = n2XL2_I2
J2 = L2-12 n为改变所述针孔间距离的系数，n为整数且1 < n《20 ;n越大，所述针孔间距离 越大，光源1发射的、照在样品16上的光越少； 所述针孔5和11可以是圆形或者多边形，如三角形、方形、矩形、四边形、五边形和 六边形等； 所述的针孔5和11为圆形时，所述针孔5和11的大小r定义为所述圆形的半径；
当所述针孔为多边形时，所述针孔的大小r定义为所述多边形的内切圆的半径； 所述针孔5通过所述针孔透镜组8、二色分光镜9和显微镜物镜15在样品16上的
投影小于或等于所述针孔11通过所述针孔透镜组8、二色分光镜9和显微镜物镜15在样品
16上的投影； 所述针孔5通过针孔透镜组8和针孔11 一一对应，因此有相似或相同的排列方 式； 所述照明滑块4和成像滑块10由所述滑动连杆7连接，所述滑动连杆7由所述滑 块驱动电机6驱动，带动所述照明滑块4和成像滑块10同时以设定的恒定速度滑动；
所述滑块驱动电机6由控制器17控制，当所述检测器14开始曝光，控制器17启 动所述电机6，曝光结束，滑块驱动电机6停止滑动； 所述二色分光镜9、成像透镜12和成像滤色片13组成旁支光路，使所述样品16发 射的荧光不再穿过照明滑块4上的针孔5。
本发明的优点如下 1、本发明属于多针孔共聚焦光学扫描系统，可实现高速扫描，可选择使用CCD和CMOS等高灵敏度面阵检测器，实现高速、高灵敏度共聚焦光学成像。 2、本发明使用照明、成像双滑块设计，两个滑块上的针孔一一对应，完全避免杂散 光背景噪声。 3、本发明的滑块运动方式为停一滑动一停一反向滑动，如此反复，由检测器和控 制器启动、停止电机驱动滑块滑动，易于与相机曝光控制同步化，完全避免扫描条纹干扰。
4、本发明的滑块为匀速滑动，所有的针孔也为匀速滑动，具有照明强度均一的优 点。


图1 :本发明和显微镜及检测器应用的结构示意图
图2 :本发明的第一种实施例的结构示意图
图3 :本发明的第二种实施例的结构示意图
图4 :本发明的第三种实施例的结构示意图
图5 :本发明的第四种实施例的结构示意图
图6 :照明滑块和成像滑块的结构示意图
图7 :本发明的第六种实施例的示意图
图面说明 1-光源 2-照明滤色片 3-照明透镜
6-滑块驱动电机7-滑块连杆 8-针孔透镜组 9-块 11-针孔 12-成像透镜 13-成像透镜 14 16-样品 17-控制器18-计算机 19-显示器
具体实施例方式
下面结合附图和实施例进一步描述本发明。
实施例1 图2是第一种与本发明相关的共聚焦光学扫描仪结构示意图，图6是本实施例使 用的照明滑块4和成像滑块10的结构示意图。 在本实施例中，汞灯、氙灯、发光二极管或激光等构成的光源1发射的照明光穿过 光路中依次放置的照明滤色片2、照明透镜3、照明滑块4上的针孔5、针孔透镜组8、 二色分 光镜9、成像滑块10上的针孔11和显微镜物镜15，照在显微镜物镜15成像焦面的样品16 上，其中只有特定波长的照明光可穿过照明滤色片2。被照明的样品16发射的荧光返回穿 过显微镜物镜15和成像滑块10上的针孔11，被二色分光镜9反射穿过成像透镜12和成像 滤色片13到达检测器14，而样品反射的照明光不能透过成像滤色片13到达检测器14。和 检测器14连接的计算器18(未画出)存储相关数据或通过显示器19(未画出)显示图像。
在检测器14曝光、控制器17(未画出)启动滑块驱动电机6前，照明滑块4的不 透光部分4b和成像滑块10的不透光部分10b同时在光路中，光源1发射的光经过照明滤 色片2得到特定波长的照明光，并通过照明透镜3汇聚停止在照明滑块4的不透光部分4b， 样品16不能被照明。当检测器14曝光、控制器17启动滑块驱动电机6，滑块驱动电机6以 设定的滑动速度驱动滑块连杆7以恒定速度滑动，滑块连杆7带动照明滑块4和成像滑块
4-照明滑块 5-针孔 二色分光镜 10-成像滑 -检测器 15-显微镜物镜
710同时滑动。照明滑块4的4a及4c先后进入光路；同时，成像滑块10的10a及10c也先 后进入光路。当照明滑块4的4a和成像滑块10的10a进入光路时，特定波长的照明光可 穿过针孔5，并经过透镜组8和二色分光镜9汇聚穿过与之一一对应的针孔11，最后由显微 镜物镜15聚焦，在成像焦面的样品16上形成多个点状照明。在4a和10a滑出光路，4c和 10c滑入光路的过程中，点状照明同时在样品16上移动，样品16扫描照明。由于针孔5和 11的排列方式，以及照明滑块4和成像滑块10以恒定速度滑动，样品16被均匀地照明。
被照明的样品16发射荧光，同时也反射照明光。显微镜物镜15的成像焦面的样 品16发射的荧光和反射的照明光经过显微镜物镜15汇聚穿过成像滑块10上的针孔11，非 焦面样品发射的荧光和发射照明光则被10a的不透光部分遮挡。穿过针孔11的荧光被旁 支光路的二色分光镜9反射离开光源1到显微镜物镜15的光路，经过旁支光路的成像透镜 12和成像滤色片13到达检测器14的感光芯片上，检测器14将探测的光信号转化为电信 号，存储在与之连接的计算机18上或显示在显示器19上。穿过针孔11的反射照明光则穿 过二色分光镜9或不能透过成像滤色片13，不能被检测器14探测到。所以，检测器14曝光 时，只能检测到显微镜物镜15成像焦面上的样品16发射的荧光。当显微镜物镜15沿光轴 移动时，检测器14可探测到不同层面的样品荧光，并经过与检测器14相连的计算机18运 算得到清晰的共聚焦三维图像，用于研究。 通过控制器17设定电机6的运行速度，使照明滑块4和成像滑块10从开始进入光 路到完全离开光路的时间刚好等于检测器14曝光时间，当检测器14曝光结束时，4c和10c 刚好停留在光路中，样品16被扫描照明一次，检测器14可获取一张完整的图像信息；或者 检测器14曝光时间等于使照明滑块4和成像滑块10从开始进入光路到完全离开光路的时 间的整数倍，在检测器14曝光时，照明滑块4和成像滑块10来回滑动，使4a和10a多次进 出光路，样品16被多次扫描照明，在检测器14结束曝光时，照明滑块4和成像滑块10分别 停留在4b、10b或4c、10c，检测器14也可获取一张完整的图像信息。
实施例2 图3是第二种与本发明相关的共聚焦光学扫描仪结构示意图，其照明滑块4和成 像滑块10的结构和扫描方式与实施例1相同，具体区别如下 二色分光镜9从针孔透镜组8和成像滑块10中间被移至针孔透镜组8中间，针孔 透镜组8和成像滑块IO之间的距离縮短。因此，针孔透镜组8可以使用短焦距的大数值孔 径透镜。 实施例3 图4是第三种与本发明相关的共聚焦光学扫描仪结构示意图，其照明滑块4和成 像滑块10的结构和扫描方式与实施例1相同，具体区别如下 照明滑块4和成像滑块10不在同一条直线上，而是分别位于相互垂直的两条直 线；二色分光镜9选择目前应用最多的普通二色分光镜，可透过经过照明滤色片2的照明 光，反射样品16发射的荧光。过光源1发射的照明依次光照明滤色片2、照明透镜3、照明 滑块4上的针孔5、针孔透镜组8后，被二色分光镜9反射穿过成像滑块10上的针孔11和 显微镜物镜15，照在显微镜物镜15成像焦面的样品16上，样品16发射的荧光经过显微镜 物镜15汇聚，依次透过成像滑块10上的针孔11、二色分光镜9、成像透镜12和成像滤色片 13到达检测器14。
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实施例4 图5是第四种与本发明相关的共聚焦光学扫描仪结构示意图，其照明滑块4和成 像滑块10的结构和扫描方式与实施例1相同，具体区别如下 成像滑块10位于旁支光路，和照明滑块4不在同一条直线上，而是分别位于相互 垂直的两条直线；光源1发射的照明光依次通过照明滤色片2、照明透镜3、照明滑块4上的 针孔5、针孔透镜组8后，被二色分光镜9反射经过显微镜物镜15汇聚，照在显微镜物镜15 成像焦面的样品16上；样品16发射的荧光经过显微镜物镜15汇聚，依次透过二色分光镜 9、成像滑块10上的针孔11、成像透镜12和成像滤色片13到达检测器14。
实施例5 本实施例可采用实施例1至4中的任意一种共聚焦光学扫描仪结构，具体区别如 下 照明滑块4的4a部分和成像滑块10的10a部分始终在光路里以设定的恒定速度 往复滑动，滑动的幅度为K与r的差值。检测器14不曝光时，关闭光源l，样品16不被照 明；检测器14曝光时，打开光源l，照明样品16。
实施例6 本实施例与实施例5的结构相似，照明滑块4和成像滑块10始终在光路里，具体 区别如下 如图7所示，照明滑块4和成像滑块10由不可滑动的液晶滤光片组成，通过控制 器17控制改变液晶滤光片的透光特性，形成透光针孔5和11，并使针孔5和11在液晶滤 光片上以设定的恒定速度移动，从而扫描样品。如图7a所示，检测器14不曝光时，照明滑 块4和成像滑块10完全不透光；如图7b至h所示，检测器14曝光时，针孔5和11形成并移动。
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权利要求
一种通过驱动排列了多个透光针孔的不透光滑块以设定的恒定速度往复滑动来扫描样品的共聚焦光学扫描仪，其特征在于，所述针孔在所述滑块上规则排列，任意相邻两行所述针孔的行间距相等，任意相邻两列所述针孔的列间距相等。
2. 根据权利要求1所述的共聚焦光学扫描仪，其特征在于，所述针孔在所述滑块上按 照以下规则排列平行于所述滑块滑动方向的排列定义为行，垂直于所述滑块滑动方向的 排列定义为列；当两个所述针孔的中心在同一条平行于所述滑块滑动方向的直线时，定义 为同一行的两个针孔；当两个所述针孔的中心在同一条垂直于所述滑块滑动方向的直线 时，定义为同一列的两个针孔海一行的所述针孔的数量相等，每一列的所述针孔的数量相 等；穿过所述每一行针孔的中心画多条直线，相邻的两条直线间的距离为所述相邻两行针 孔的行间距，称为I ;穿过所述每一列针孔的中心画多条直线，相邻的两条直线间的距离为 所述相邻两列针孔的列间距，称为J ;同一行的相邻两个所述针孔的中心距离为K ;同一列 的相邻两个所述针孔的中心距离为L ;所述针孔的排列使I、 J、 K和L与所述针孔大小r有 以下等式关系0 < I《2r L = nXI， K2 = n2XL2-I2 J2 = L2-I2n为改变所述针孔间距离的系数，n为整数且1 < n《20。
3. 根据权利要求1至2所述的共聚焦光学扫描仪，其特征在于，所述的针孔的形状为圆 形或多边形；当所述针孔为圆形时，所述针孔的大小r定义为所述圆形的半径；当所述针孔 为多边形时，所述针孔的的大小r定义为所述多边形的内切圆的半径。
4. 一种通过驱动排列了多个透光针孔的不透光滑块以设定的恒定速度往复滑动来扫 描样品的共聚焦光学扫描仪，其特征在于，同时驱动排列了多个透光针孔的不透光的照明 滑块和成像滑块以设定的恒定速度往复滑动；所述照明滑块上的所述针孔与所述成像滑块 上的所述针孔，二者通过针孔透镜组和显微镜物镜在样品上形成的投影的中心一一重合。
5. 根据权利要求1至3所述的共聚焦光学扫描仪，其特征在于，同时驱动排列了多个透 光针孔的不透光的照明滑块、成像滑块以设定的恒定速度往复滑动；所述照明滑块上的所 述针孔与所述成像滑块上的所述针孔，二者通过所述针孔透镜组和显微镜物镜在样品上形 成的投影的中心一一重合。
6. —种通过同时驱动排列了多个透光针孔的不透光的照明滑块、成像滑块以设定的恒 定速度往复滑动来扫描样品的共聚焦光学扫描仪，由以下部分组成光源(1);其上排列了多个透光针孔(5)和(ll)，其余部分不透光的照明滑块(4)和成像滑块 (10);使所述照明滑块上的所述针孔与所述成像滑块上的所述针孔一一对应的针孔透镜组；同时驱动所述照明滑块和所述成像滑块以设定的恒定速度滑动，使光源发射的光经过 所述针孔完整地、均匀的扫描样品的滑块连杆(7)、滑块驱动电机(6)和控制器(17);由二色分光镜(9)、成像透镜(12)和成像滤色片(13)组成的，使被照明的样品反射回来的光或发射的荧光穿过所述成像滑块上的所述针孔后，不再穿过所述照明滑块上的所述 针孔的旁支光路。
7. 根据权利要求1至5所述的，通过同时驱动排列了多个透光针孔的不透光的照明滑 块、成像滑块以设定的恒定速度往复滑动来扫描样品的共聚焦光学扫描仪，由以下部分组成光源(1);其上排列了多个透光针孔(5)和(ll)，其余部分不透光的照明滑块(4)和成像滑块 (10);使所述照明滑块上的所述针孔与所述成像滑块上的所述针孔一一对应的针孔透镜组；同时驱动所述照明滑块和所述成像滑块以设定的恒定速度滑动，使光源发射的光经过 所述针孔完整地、均匀的扫描样品的滑块连杆(7)、滑块驱动电机(6)和控制器(17);由二色分光镜(9)、成像透镜(12)和成像滤色片(13)组成的，使被照明的样品反射回 来的光或发射的荧光穿过所述成像滑块上的所述针孔后，不再穿过所述照明滑块上的所述 针孔的旁支光路。
8. 根据权利要求1至7所述的共聚焦光学扫描仪，使用液晶滤光片替代所述滑块，通过 改变液晶滤光片的透光特性来形成且移动针孔从而扫描样品。
全文摘要
本发明涉及一种共聚焦光学扫描仪，特别涉及多针孔共聚焦光学扫描仪。该共聚焦光学扫描仪的主要特征是同时驱动排列了多个透光针孔的不透光的照明滑块和成像滑块，以设定的恒定速度往复滑动来扫描样品；照明滑块上的针孔与成像滑块上的针孔，二者通过针孔透镜组和显微镜物镜在样品上形成的投影的中心一一重合；针孔在滑块上规则排列，任意相邻两行针孔的行间距相等，任意相邻两列针孔的列间距相等。由于使用的是排列了多个针孔的滑块以恒定速度往复滑动的扫描方法，所以，该共聚焦光学扫描仪具有高速、零杂散光背景噪声、易于与相机曝光控制同步化、照明强度均一等优点。
文档编号G01N21/01GK101795339SQ20101010038
公开日2010年8月4日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者赖博 申请人:赖博