专利名称：不溶性载体颗粒的制造方法、不溶性载体颗粒、测定试剂、待测物分析用具和免疫比浊法的制作方法
技术领域：
本发明涉及不溶性载体颗粒的制造方法、不溶性载体颗粒、测定试剂、待测物分析 用具和免疫比浊法。
背景技术：
一直以来，作为免疫学测定方法，利用酶免疫分析法(EIA法)、免疫比浊法等。其 中，使用不溶性载体颗粒的免疫比浊法，由于能够利用自动分析仪器，因此近年来在临床检 查等中被广泛使用。所述免疫比浊法通常使用负载有作为测定对象的抗原或抗体的不溶性载体颗粒。 试样中含有测定对象时，通过使其与所述不溶性载体颗粒所负载的抗体或抗原结合，从而 所述不溶性载体颗粒凝集。因此，通过测定该凝集的程度，能够检测测定对象。在临床检查中，通过所述免疫比浊法，例如测定生物试样中所含的抗原或抗体的 浓度作为诊断指标来进行疾病的诊断。由于生物试样中所含的抗原或抗体的浓度根据疾患 的有无等而有很大差异，因此要求该检查方法能够在很宽的浓度范围内进行测定。在使用不溶性载体颗粒的免疫比浊法中，根据其测定原理，通过扩大能够反应的 抗体或抗原的量的上限，能够扩大测定对象的测定浓度范围。因此，不溶性载体颗粒需要负 载更多的抗体或抗原。但是，用于免疫比浊法的不溶性载体颗粒，通常在颗粒表面的官能团 负载抗体或抗原时，表面电荷减少。因此，存在如下问题容易产生颗粒自身的凝集反应、和 因抗原或抗体以外的物质所产生的凝集反应(非特异性凝集)，分散性降低，且测定灵敏度 降低。因而，在所述免疫比浊法中，为了抑制非特异性凝集，公开了以下方法使用对于 抗原为非特异性的蛋白质的方法(专利文献1)、使用表面活性剂的方法(专利文献2)和使 用盐类的方法(专利文献3)。然而，所述使用抗原非特异性蛋白质的方法中，若用于致敏不 溶性载体颗粒的抗体或抗原量增加，则非特异性凝集的抑制效果降低。此外，使用表面活性 剂的方法中，连物理性吸附的抗体或抗原也被除去或变性，可能会丧失反应性。进而，使用 盐类的方法中，抗体或抗原的反应性和灵敏度可能降低。并且，这些方法根据所负载的抗体 或抗原的种类、批次的不同，所得到的不溶性载体颗粒的品质容易产生不均。现有技术文献专利文献 专利文献1 日本特开2004-117068号公报专利文献2 日本特开平11-258239号公报专利文献3 日本特开2004-117022号公报
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于提供一种即使所负载的抗体或抗原量增加也能够抑制非 特异性凝集的不溶性载体颗粒的制造方法、不溶性载体颗粒、测定试剂、待测物分析用具和 免疫比浊法。用于解决问题的方案为了达成所述目的，本发明的不溶性载体颗粒的制造方法的特征在于，其为在颗 粒表面负载抗体或抗原的不溶性载体颗粒的制造方法，其具有下述㈧和⑶中的至少一个致敏反应工序。(A)该致敏反应工序为在致敏反应液中，在极性电荷侧链氨基酸的存在下，使所 述抗体或抗原与所述不溶性载体颗粒接触的致敏反应工序，所述致敏反应液中的所述极性电荷侧链氨基酸浓度为超过0. lmol/L且lmol/L以 下的范围。(B)该致敏反应工序为在致敏反应液中，在极性电荷侧链氨基酸的存在下，使所 述抗体或抗原与所述不溶性载体颗粒接触的致敏反应工序，作为所述不溶性载体颗粒，使用化学结合用胶乳颗粒。本发明的不溶性载体颗粒的特征在于，其为用于免疫比浊法的不溶性载体颗粒， 通过本发明的不溶性载体颗粒的制造方法来制造。本发明的测定试剂的特征在于，其为用于免疫比浊法的测定试剂，且含有本发明 的不溶性载体颗粒。本发明的待测物分析用具的特征在于，其含有本发明的测定试剂。本发明的免疫比浊法的特征在于，所述免疫比浊法具有如下工序凝集反应工序， 使在颗粒表面负载抗体或抗原的不溶性载体颗粒、与作为抗原或抗体的测定对象发生免疫 反应，使所述不溶性载体颗粒在免疫反应液中凝集；测定工序，测定因所述凝集反应而产生 的所述免疫反应液的浊度变化；作为所述不溶性载体颗粒，使用本发明的不溶性载体颗粒。发明的效果根据本发明的不溶性载体颗粒的制造方法，能够制造即使所负载的抗体或抗原量 增加也能够抑制非特异性凝集的不溶性载体颗粒。此外，本发明的制造方法中，抗体或抗原 的种类、抗体或抗原的批次间差异的影响很少。进而，本发明的制造方法只要在致敏反应时 存在极性电荷侧链氨基酸即可，工序也简便。本发明的不溶性载体颗粒由于能够抑制因抗 体或抗原量的增加所引起的非特异性凝集，因此能够负载充分量的抗体或抗原。因此，将本 发明的不溶性载体颗粒用于免疫比浊法时，测定浓度范围广，且测定灵敏度高。并且，本发 明的不溶性载体颗粒，由于所述极性电荷侧链氨基酸与不溶性载体颗粒结合，因此例如干 燥引起浓缩的影响低，也能够用于微芯片、属于干式免疫测定试剂的试验片等待测物分析 用具，能够应用于小型的自动分析装置。本发明的不溶性载体颗粒的非特异性凝集的抑制机理例如可以如下推定。S卩，若 用所述抗体致敏所述不溶性载体颗粒，则所述抗体物理性吸附在所述不溶性载体颗粒的表 面后，与其附近的所述不溶性载体颗粒表面的官能团(例如羧基)结合。因此，所述不溶性 载体颗粒表面的电荷减少。另一方面，由于所结合的所述抗体造成的位阻，所述表面的一部 分官能团无法结合所述抗体而直接残存。所述抗体致敏时，在极性电荷侧链氨基酸的存在 下，使抗体或抗原与所述不溶性载体颗粒接触。这样的话，水合性高的所述极性电荷侧链氨基酸与所述不溶性载体颗粒结合，进而，所述极性电荷侧链氨基酸和水分子产生氢键。因此 认为，所述不溶性载体颗粒的亲水性和电荷增高，分散性提高，其结果，抑制了非特异性凝 集。另外，所述机理是推定的，本发明不受其任何限定和限制。
图1是表示比较例和本发明的实施例的分散性的测定结果的图。图2是表示比较例和本发明的实施例的测定前后的分散性的变化率的图。图3是表示使用比较例和本发明的实施例的免疫比浊法的测定结果的图。图4是表示使用其它比较例和其它本发明的实施例的免疫比浊法的测定结果的 图。图5是表示使用其它比较例和其它本发明的实施例的免疫比浊法的测定结果的 图。图6是表示其它比较例和其它本发明的实施例的分散性的测定结果的图。图7是表示对其它比较例和其它本发明的实施例的测定前后的分散性的变化率 进行测定的结果的图。图8是表示使用其它比较例和其它本发明的实施例的免疫比浊法的测定结果的 图。
具体实施例方式本发明的不溶性载体颗粒的制造方法中，所述极性电荷侧链氨基酸优选为碱性氨
基酸或酸性氨基酸。本发明的不溶性载体颗粒的制造方法，在所述(A)的致敏反应工序中，所述不溶 性载体颗粒优选为胶乳颗粒。本发明的不溶性载体颗粒的制造方法，在所述(A)的致敏反应工序中，所述胶乳 颗粒优选为化学结合用胶乳颗粒。本发明的测定试剂包含含有多个不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群，所述不溶 性载体颗粒群包含平均粒径不同的两种不溶性载体颗粒群，所述两种不溶性载体颗粒群 中，至少一种不溶性载体颗粒群优选为含有多个本发明的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗 粒群。本发明的测定试剂优选的是，在所述两种不溶性载体颗粒群中平均粒径较大的不 溶性载体颗粒群为含有多个本发明的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群。本发明的测定试剂中，本发明的不溶性载体颗粒的平均粒径优选为例如0. 03 2. Oμm的范围，更优选为0. 08 2. 0 μ m的范围，进一步优选为0. 12 0. 5 μ m的范围。本发明的待测物分析用具可以为试验片、测试盒(cartridge)和微芯片中的任意 一种。本发明的免疫比浊法优选的是，在所述凝集反应工序中，使用包含多个不溶性载 体颗粒的不溶性载体颗粒群，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的两种不溶性载体 颗粒群，所述两种不溶性载体颗粒群中的至少一种为包含多个本发明的不溶性载体颗粒的 不溶性载体颗粒群。
在本发明的免疫比浊法中，所述两种不溶性载体颗粒群中，平均粒径较大的不溶 性载体颗粒群优选为包含多个本发明的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群。在本发明的免疫比浊法中，本发明的不溶性载体颗粒的平均粒径优选为例如 0. 03 2. Ομπι的范围，更优选为0. 08 2. Ομπι的范围，进一步优选为0. 12 0. 5μπι的范围。接着，举出例子对本发明进行说明。<制造方法>如前所述，本发明的制造方法为在颗粒表面负载有抗体或抗原的不溶性载体颗粒 的制造方法，其具有以下致敏反应工序在致敏反应液中，在极性电荷侧链氨基酸的存在 下，使所述抗体或者所述抗原与所述不溶性载体颗粒接触。如前所述，本发明的制造方法中，作为所述致敏反应工序，具有下述(A)和(B)中 的至少一种致敏反应工序。另外，以下，在本发明的制造方法中，将具有下述(A)的致敏反 应工序的制造方法称为“制造方法Α”，将具有下述(B)的致敏反应工序的制造方法称为“制 造方法B”。(A)该致敏反应工序为在致敏反应液中，在极性电荷侧链氨基酸的存在下，使所 述抗体或者所述抗原与所述不溶性载体颗粒接触的致敏反应工序，所述致敏反应液中的所述极性电荷侧链氨基酸浓度为超过0. lmol/L且lmol/L以 下的范围，(B)该致敏反应工序为在致敏反应液中，在极性电荷侧链氨基酸的存在下，使所 述抗体或者所述抗原与所述不溶性载体颗粒接触的致敏反应工序，作为所述不溶性载体颗粒，使用化学结合用胶乳颗粒。在本发明的制造方法中，所述致敏反应液包含所述极性电荷侧链氨基酸、和负载 抗体或抗原的所述不溶性载体颗粒。本发明中，所述极性电荷侧链氨基酸是指侧链具有极性和电荷的氨基酸。因此，所 述极性电荷侧链氨基酸为亲水性，并且在水溶液中具有正或负的电荷。所述极性电荷侧链 氨基酸中， 具有正的电荷的氨基酸为碱性氨基酸，具有负的电荷的氨基酸为酸性氨基酸。所 述碱性氨基酸包括例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸。此外，所述酸性氨基酸包括例如天门冬氨 酸和谷氨酸。所述极性电荷侧链氨基酸只要在水溶液中具有正或负的电荷即可，也包括例 如极性电荷侧链氨基酸的盐等。作为所述盐，没有特别限定，可以列举例如钠盐或钾盐等， 具体而言，可以例示天门冬氨酸钠等酸性氨基酸盐。此外，作为所述盐，可以列举例如盐酸 盐，具体而言，可以例示精氨酸盐酸盐、赖氨酸盐酸盐等碱性氨基酸盐。作为本发明的制造 方法中使用的所述极性电荷侧链氨基酸，其中，优选为天门冬氨酸钠、谷氨酸钠。在本发明的制造方法A中，如前所述，所述致敏反应液中的所述极性电荷侧链氨 基酸浓度为超过0. lmol/L且lmol/L以下的范围，优选为0. 2mol/L 0. 8mol/L的范围。在本发明的制造方法B中，所述致敏反应液中的所述极性电荷侧链氨基酸浓度没 有特别限定，例如可以为超过0. lmol/L且lmol/L以下的范围，优选为0. 2mol/L 0. 8mol/ L的范围。在本发明的制造方法A中，作为所述不溶性载体颗粒，没有特别限定，可以举出例 如合成高分子颗粒、无机化合物颗粒、多糖类颗粒等。所述合成高分子颗粒没有特别限定，可以举出例如胶乳颗粒、聚乳酸颗粒等，优选为胶乳颗粒。所述胶乳颗粒的材质没有特别限 定，可以列举例如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-马 来酸共聚物、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯等，优选为聚苯乙 烯。所述无机化合物颗粒没有特别限定，可以列举例如多孔性玻璃颗粒、硅石颗粒等。所述 多糖类颗粒没有特别限定，可以举出例如琼脂糖颗粒、葡聚糖颗粒、壳聚糖颗粒等。 在本发明的制造方法A中，所述不溶性载体颗粒例如可以为化学结合用不溶性载 体颗粒，也可以为物理吸附用不溶性载体颗粒。作为所述化学结合用不溶性载体颗粒，没有 特别限定，可以列举例如颗粒表面附加有官能团的不溶性载体颗粒等。作为所述官能团，没有特别限定，可以列举例如羧基、氨基、磺基、甲醇基、氨基甲 酰基、三甲基氨基、聚乙烯亚胺基、酚性羟基、甲醇基等醇性羟基、聚乙二醇基、羧基末端聚 乙二醇基、羧基末端聚乙二醇基、辛基、十八烷基、三甲基甲硅烷基等，优选为羧基。在本发明的制造方法A中，所述不溶性载体颗粒也可以与制造方法B同样地为后 述化学结合用胶乳颗粒。本发明的制造方法B中，作为所述不溶性载体颗粒，使用所述化学结合用胶乳颗 粒。作为所述化学结合用胶乳颗粒，可以列举例如颗粒表面附加有官能团的胶乳颗粒等。 所述胶乳颗粒的材质，没有特别限定，可以列举例如前述的材质等，优选为聚苯乙烯、苯乙 烯_ 丁二烯共聚物、苯乙烯_丙烯酸酯共聚物等，更优选为聚苯乙烯。作为所述官能团，没 有特别限定，可以列举例如前述的官能团等，优选为羧基、氨基、磺基、甲醇基、酰基氨基，更 优选为羧基。本发明的制造方法中，所述不溶性载体颗粒的平均粒径没有特别限定，例如为 0. 03μπι 2. Ομ 的范围，更优选为0. 05μπι 1. O μ m的范围，进一步优选为0. 07μπι 0. 5μπ 的范围。本发明的制造方法中，所述致敏反应液中的所述不溶性载体颗粒的浓度没有特 别限定，例如为0. lw/v% 10 八％的范围，优选为0. 3w/v% 8w/v%的范围，更优选为 0. 5w/v% 范围。本发明中，所述不溶性载体颗粒所负载的抗原没有特别限定，例如可以根据分析 对象适当决定。作为具体例子，可以列举例如CRP(C反应性蛋白)、ASO(抗链球菌溶血素 0)、AFP (甲胎蛋白)、FDP (纤维蛋白降解产物)、CEA (癌胚抗原)、HCG β (人绒毛膜促性腺 激素-β )、SCC(鳞状上皮细胞癌相关抗原)、类风湿因子、HbAlc、肌酐、纤维蛋白原、各种病 毒(肝炎病毒、HTLV-I、HIV、HCV、HBs、HBe)抗原、各种酶等。本发明中，所述不溶性载体颗粒所负载的抗体没有特别限定，例如可以根据分析 对象适当决定。所述抗体的种类没有特别限定，可以列举例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等免 疫球蛋白分子，Fab、Fab’、F(ab’)2等抗体片段等。所述抗体可以通过以往公知的方法由例 如小鼠、兔子、山羊、绵羊、鸡等来源的血清进行制备，也可以利用市售的各种抗体，没有特 别限定。作为所述抗体的具体例子没有特别限定，可以列举例如针对所述各种抗原的抗体等。所述不溶性载体颗粒所负载的抗体，例如可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗 体。所述致敏反应工序中，所述不溶性载体颗粒上例如可以负载所述两种抗体，也可以只负 载所述两种抗体中的一种。
本发明的制造方法中，所述致敏反应液中的所述抗体的浓度没有特别限定，例如 为0. 01mg/mL 20mg/mL的范围，优选为0. 05mg/mL 10mg/mL的范围，进一步优选为 0. lmg/mL 5mg/mL的范围。此外，作为所述抗体，用所述多克隆抗体和所述单克隆抗体 这两种抗体致敏所述不溶性载体颗粒时，所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度 比(多克隆抗体单克隆抗体的比)没有特别限定，例如为1 9 7 3的范围，优选为 1 9 5 5的范围。另外，所述致敏反应液中的所述多克隆抗体和单克隆抗体的比率， 例如可以是重量比，也可以是抗体分子数的比。本发明的制造方法中，所述致敏反应液包含所述极性电荷侧链氨基酸、所述抗体 或抗原、和所述不溶性载体颗粒，还可以进一步包含其它成分。所述其它成分没有特别限 定，可以列举例如缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)等。作为所述缓冲液，没有特别限定，可以使用例如MES(2-(N_吗啉代)乙磺酸)缓冲 液、磷酸缓冲液、Tris (三羟甲基氨基甲烷)缓冲液等。所述缓冲液的pH例如为pH5 9的 范围，优选为PH6. O 7. 5的范围。本发明的制造方法中，所述致敏反应工序可以使用例如化学结合法等以往公知的 方法而适当实施，没有特别限定。本发明的制造方法除了所述致敏反应工序以外没有特别限定，还可以进一步具有 例如官能团活化工序、清洗工序、封闭工序等。所述官能团活化工序为，例如在所述致敏反应工序前，将所述不溶性载体颗粒表 面所附加的氨基或羧基等所述官能团活化的工序。所述官能团活化工序没有特别限定，例 如可以使所述不溶性载体颗粒在包含NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)和EDAC (1-乙基-3-(3-二 甲氨基丙基)碳二亚胺)的缓冲液中反应。作为所述官能团，没有特别限定，可以列举例如 前述的官能团等。所述清洗工序为，例如将所述不溶性载体颗粒用缓冲液等进行清洗的工序。所述 清洗工序优选为例如在所述致敏反应工序之后进行。所述清洗工序没有特别限定，可以采 用以往公知的方法而实施。作为所述缓冲液，没有特别限定，可以列举例如所述的MES缓冲 液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。所述封闭工序优选为例如在所述清洗工序之后进行。所述封闭工序为，为了抑制 作为测定对象的抗原或抗体的非特异性结合，通过例如BSA等包覆所述不溶性载体颗粒表 面的工序。所述封闭工序可以通过例如以往公知的方法而适当实施，例如将所述不溶性载 体颗粒在包含所述封闭剂的缓冲液中静置一夜。作为所述封闭剂，没有特别限定，可以列举 例如B SA等。作为所述缓冲液，没有特别限定，可以列举例如前述的缓冲液等。<不溶性载体颗粒>如前所述，本发明的不溶性载体颗粒为用于免疫比浊法的不溶性载体颗粒，为通 过本发明的制造方法而制造的不溶性载体颗粒。所述本发明的不溶性载体颗粒除了通过所 述本发明的制造方法而制造以外，没有任何限定。另外，本发明中，负载抗体或抗原的不溶 性载体颗粒、所述不溶性载体颗粒所负载的抗体或抗原如前所述。通过本发明的制造方法而制造的不溶性载体颗粒，例如所述极性电荷侧链氨基酸 与所述颗粒表面结合。作为所述结合的方法，没有特别限定，例如所述极性电荷侧链氨基酸 可以与所述不溶性载体颗粒如前所述直接结合，也可以间接性结合。后者的情况下，所述极性电荷侧链氨基酸残基可以与例如在所述不溶性载体颗粒的表面化学结合的官能团结合。<测定试剂>如前所述，本发明的测定试 剂包含本发明的不溶性载体颗粒。本发明的测定试剂 中，作为所述本发明的不溶性载体颗粒，可以使用通过本发明的制造方法A和制造方法B中 的任意一种制造方法而制造的不溶性载体颗粒，也可以组合使用通过所述各制造方法分别 制造的不溶性载体颗粒。 本发明的测定试剂可以包含例如不溶性载体颗粒群。另外，本发明中，所述不溶性 载体颗粒群是指，例如包含多个具有一定的性能和形状的所述不溶性载体颗粒的不溶性载 体颗粒群。所述不溶性载体颗粒群例如可以包含一种不溶性载体颗粒群，也可以包含多种 不溶性载体颗粒群，没有特别限定。前者的情况下，所述不溶性载体颗粒群为包含多个本发 明的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群。此外，后者的情况下，所述不溶性载体颗粒群可 以包含一种或两种以上例如所述含有多个本发明的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群。所述不溶性载体颗粒群没有特别限定，优选的是，例如包含两种以上平均粒径不 同的不溶性载体颗粒群，其中，至少一种不溶性载体颗粒群为包含多个本发明的不溶性载 体颗粒的不溶性载体颗粒群。所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的两种以上的不 溶性载体颗粒群时，所述包含多个本发明的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群没有特 别限定，可以为例如平均粒径不同的多种不溶性载体颗粒群中平均粒径最大的不溶性载 体颗粒群。本发明的测定试剂通过包含所述平均粒径不同的两种以上的不溶性载体颗粒 群，能够在更宽的浓度范围内进行测定，此外，能够得到充分高的测定精度。所述平均粒径 的种类没有特别限定，可以列举例如数均粒径、长度平均粒径、平均(体积_面积)粒径 (Volume-Surface meandiameter)、质量平均粒径、体积平均粒径、表面积平均粒径、比表面 积等价粒径(equivalent specific surface diameter)、中值粒径、众数径等。本发明中，“不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的两种以上的不溶性载体颗粒 群”可以指例如，在通过以往公知的规定的方法求出平均粒径时，所述不溶性载体颗粒群 包含显示不同的平均粒径的两种以上的不溶性载体颗粒群；也可以指在测定所使用的全 部不溶性载体颗粒的粒径分布时，直方图中显示2个以上的峰。后者的情况下，本发明中， “包含平均粒径不同的两种以上的不溶性载体颗粒群的不溶性载体颗粒群”也可以指例如 “其粒度分布具有2个以上的峰的不溶性载体颗粒群”。作为所述粒度分布的测定方法，可 以列举例如使用光学显微镜或电子显微镜的显微镜法、光散射法、遮光法、激光衍射法、电 阻法、电感带法(electric sensing zone method)、筛分法、液相沉降法、离心沉降法、惯性 碰撞法等。所述平均粒径也可以从通过这种测定方法得到的粒度分布算出。本发明中，所 述平均粒径不同的两种以上的不溶性载体颗粒群也可以是能够通过网眼大小不同的两种 以上的筛子进行分类的两种以上的不溶性载体颗粒群。此外，分别以各平均粒径作为基准，所述不溶性载体颗粒群中所含有的平均粒径 不同的两种以上的不溶性载体颗粒群例如可以含有粒径为平均粒径士 15%的颗粒，优选含 有粒径为平均粒径士 5 %的颗粒。所述平均粒径不同的不溶性载体颗粒群的种类只要为两种以上，则没有特别限 定，例如为2 5种，优选为2 3种，更优选为两种。所述不溶性载体颗粒群包含例如平均粒径不同的两种不溶性载体颗粒群时，平均粒径大的不溶性载体颗粒(以下，称为“大颗粒”。)群的所述平均粒径没有特别限定，例如 为0. 08 μ m 2. 0 μ m的范围，优选为0. 1 μ m 1. 0 μ m的范围，更优选为0. 12ym~0. 5ym 的范围。此外，此时，平均粒径小的不溶性载体颗粒(以下，称为“小颗粒”。)群的平均粒 径也没有特别限定，例如为0. 03 μ m 0. 2 μ m的范围，优选为0. 05 μ m 0. 15 μ m的范围， 更优选为0. 07μπι 0. 12 μ m的范围。所述不溶性载体颗粒群包含所述平均粒径不同的两种不溶性载体颗粒群时，没有 特别限定，但优选例如所述大颗粒和小颗粒中的至少任意一者负载有多克隆抗体和单克隆 抗体。这样负载有抗体的测定试剂，例如能够以很少的颗粒量和抗体量，高灵敏度地测定从 低浓度到高浓度的测定对象，且能够将待测物的稀释率设定为较低。本发明的测定试剂中的所述不溶性载体颗粒浓度没有特别限定，例如为0. Ollw/ ν % 15w/v %的范围，优选为0. 06w/v % 6w/v %的范围，更优选为0. 15w/v % 1. 5w/v % 的范围。本发明的测定试剂包含例如所述平均粒径不同的两种不溶性载体颗粒群时，所述 测定试剂中的所述大颗粒的浓度例如为0. 001w/v% 5 八％的范围，优选为0. 01w/v% lw/v%的范围，更优选为0. 05w/v% 0.范围。本发明的测定试剂包含例如所述平均粒径不同的两种不溶性载体颗粒群时，所述 测定试剂中的所述小颗粒群的所述颗粒浓度例如为0.01w/v% 10 八％的范围，优选为 0. 05w/v% 5w/v%的范围，更优选为0. lw/v% 范围。本发明的测定试剂中，作为除了所述不溶性载体颗粒以外的其它成分，还可以包 含例如缓冲液、糖类、蛋白质、糖苷、高分子化合物、防腐剂等。作为所述缓冲液，没有特别限 定，可以列举例如所述的MES缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。作为所述糖类，没有特 别限定，可以列举例如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等。作为所述蛋白质，没有特别限定，可以列举 例如牛血清白蛋白(BSA)、明胶等。作为所述糖苷，没有特别限定，可以列举例如皂角苷、洋 地黄皂苷等。作为所述高分子化合物，没有特别限定，可以列举例如聚乙二醇、聚乙烯基吡 咯烷酮等。作为所述防腐剂，没有特别限定，可以列举例如叠氮化钠、Kathon(商标)等。〈待测物分析用具〉如前所述，本发明的待测物分析用具，其特征在于含有本发明的测定试剂。本发明 的待测物分析用具只要含有本发明的测定试剂，则其它构成和条件没有任何限制。本发明 的待测物分析用具中，所述测定试剂例如根据其形态，可以以干燥体形式进行配置，也可以 以分散液或者悬浮液等液体形式进行配置。本发明的待测物分析用具的形态没有任何限定，可以列举例如测试盒、试验片、微 芯片等。这些待测物分析用具，优选能够连接到例如用于检测抗原抗体反应的凝集程度的 通用测定仪器上。作为所述测试盒，没有特别限定，例如可以列举以下形态基板具备配置有所述测 定试剂的试剂槽。作为所述测试盒，可以是如下形式等具有填充有用于免疫反应的试剂的 存储槽(试剂槽)或进行免疫反应的反应槽，组装入自动分析装置中，对待测物中所含的成 分进行测定。这种情况下，本发明的测定试剂例如可以填充到所述存储槽(试剂槽)中，也 可以填充到所述反应槽中，没有特别限定。所述测试盒中，例如所述测试盒在连接到例如所 述测定仪器之前或之后，将测定试样导入配置有所述测定试剂的所述试剂槽，在抗原抗体反应之后，通过所述测定仪器，可以测定所述试剂槽内的凝集程度。此外，关于所述测试盒， 例如，所述基板可以进一步具有通过流路而与所述试剂槽连接的反应槽。此时，可以向所述 试剂槽导入测定试样，使所述测定试样与所述测定试剂的混合液通过所述流路而移动到所 述反应槽中，从而测定所述反应槽内的凝集程度。关于所述测试盒，根据所述凝集程度，能 够测定例如待测物中所含的成分或者其浓度。配置于所述测试盒的所述试剂槽的所述本发 明的测定试剂，例如可以是液体(分散液)，也可以是干燥体。作为所述试验片，例如可以列举在长方形等的基板上配置有具有本发明的测定试 剂的试剂部的形态。作为所述试剂部的材质，可以列举例如滤纸或各种聚合物制的多孔质 体。这样的试验片，例如，将测定试样添加到配置有所述测定试剂的所述试剂部，在抗原抗 体反应后，通过所述测定仪器，可以测定所述试剂部中的凝集程度。作为所述试验片，可以 是例如在长方形的支持体上具有含有所述测定试剂(免疫反应用试剂)或检测用试剂的 试剂层的试验片等。这样的试验片，例如将测定试样添加到含有本发明的不溶性载体颗粒 的所述试剂层，在抗原抗体反应后，通过所述检测用试剂，可以测定所述试剂部中的凝集程 度。所述检测用试剂的组成没有特别限定，可以列举例如着色色素、荧光色素、缓冲液等。在 所述试验片中，所述本发明的测定试剂优选例如以干燥状态进行配置。例如，在将所述多孔 质体等配置到所述基板之前或之后，向所述多孔质体等供给分散液状的所述测定试剂，然 后将其干燥即可。所述微芯片等芯片例如可以列举以下形态所述基板具有试样的导入口、试剂部 和流路，所述导入口和所述试剂部通过所述流路而连结。这种芯片，例如，从所述导入口导 入测定试样，使所述测定试样通过所述流路向所述试剂部移动，在所述试剂部进行抗原抗 体反应后，通过所述测定仪器，可以测定所述试剂部内的凝集程度。配置于所述芯片的所述 试剂部的所述本发明的测定试剂，例如可以为液体，也可以为干燥体。所述微芯片等芯片， 可以是例如具有试样的导入和分离用的流路和试剂槽等的芯片。这种芯片，例如可以在所 述分离用的流路含有本发明的不溶性载体颗粒。此外，关于这些待测物分析用具，例如所述试剂部或试剂槽根据需要可以进一步 含有用于检测凝集体的检测试剂。〈免疫比浊法〉如前所述，本发明的免疫比浊法，其特征在于，具有以下工序凝集反应工序，使颗 粒表面负载抗体或抗原的不溶性载体颗粒与作为抗原或抗体的测定对象发生免疫反应，使 所述不溶性载体颗粒在免疫反应液中凝集；测定工序，对由所述凝集反应带来的所述免疫 反应液的浊度变化进行测定；作为所述不溶性载体颗粒，使用本发明的不溶性载体颗粒。 本发明的免疫比浊法除了具有所述工序且使用本发明的不溶性载体颗粒以外，没有特别限 定，例如可以是胶乳免疫凝集法。本发明的免疫比浊法中，作为所述测定对象，没有特别限定，可以列举例如前述的 抗体或抗原等。本发明的免疫比浊法中，包含所述测定对象的待测物没有特别限定，可以列举例 如临床检查中的一般的待测物。作为所述待测物，可以列举例如全血、血细胞、血清、血浆、 溶血试样、尿等生物试样。本发明中，例如，可以将所采集的所述待测物直接作为测定试样使用，也可以将在抗原抗体反应之前预先对待测物实施了稀释处理、过滤处理、加热处理等的待测物作为测 定试样使用。作为用于所述稀释处理的溶剂，没有特别限定，可以列举水、生理盐水、缓冲液等。作为所述缓冲液的缓冲剂，例如，只要不妨碍所述反应即可，可以列举例如 MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、磷酸、Tris(三羟甲基氨基甲烷)等。所述缓冲液中例如还 可以添加其它成分，例如，为了稳定反应，可以添加牛血清白蛋白(BSA)等。所述稀释处理中的所述待测物的稀释率没有特别限定，例如，在使用所述的待测 物分析用具测定的情况下，也可以为低稀释率。所述凝集反应工序中，作为使所述负载有抗体或抗原的不溶性载体颗粒与所述测 定对象发生免疫反应(抗原抗体反应)的方法，没有特别限定，例如可以使用公知的方法。 作为所述反应方法，例如可以向所述测定试样中添加分散有所述不溶性载体颗粒群的分散 液而进行反应，也可以向所述不溶性载体颗粒群中添加所述测定试样而进行反应。作为前 者的方法，例如可以应用如前所述的测定试剂。后者的情况下，所述不溶性载体颗粒群例如 可以是分散液，也可以是干燥状态。作为所述后者的方法，例如可以应用如前所述的试验 片、微芯片、测试盒(cartridge)等待测物分析用具。具体而言，将所述不溶性载体颗粒群 例如以分散液或者干燥状态预先配置在基板的试剂部，向所述试剂部添加所述测定试样， 从而能够进行免疫反应。所述免疫反应液，除了所述不溶性载体颗�：退霾舛ǘ韵笠酝猓箍梢院欣� 如所述的缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)等。所述免疫反应液中的所述不溶性载体颗粒浓度没有特别限定，优选为0. Ollw/ v% lw/v%的范围，更优选为0. 033w/v% 0. 5w/v%的范围，进一步优选为0. 055w/ v% 0. 3 八％的范围。此外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述小颗粒群的所述颗粒浓度 优选为0. 0 lw/v % 0. 5w/v %的范围，更优选为0. 03w/v % 0. 3w/v %的范围，进一步优选 为0. 05w/v% 0. 2 八％的范围。此外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述大颗粒群的颗粒 浓度优选为0. 00lw/v% 0. 05w/v%的范围，更优选为0. 003w/v% 0. 04w/v%的范围，进 一步优选为0. 005w/v% 0.范围。所述免疫反应液中，所述小颗粒群的颗粒与所述大颗粒群的颗粒的比例没有特 别限定。作为具体例子，所述小颗粒群的颗粒与所述大颗粒群的颗粒的重量比优选为 100 1 1 100的范围，更优选为10 1 1 10的范围，进一步优选为5 1 1 5的范围。本发明的免疫比浊法中，测定所述免疫反应液的浊度变化的测定工序，例如可以 使用通用的测定装置等，通过测定所述免疫反应液的吸光度的变化来实施。作为具体例子，以血液作为待测物，将用于通过免疫比浊检测CRP的免疫反应液 的条件示于以下，但本发明不限于此。所述免疫反应液中的所述不溶性载体颗粒浓度没有特别限定，优选为0. Ollw/ v% lw/v %的范围，更优选为0. 033w/v% 0. 5w/v%的范围，进一步优选为0. 055w/ v% 0. 3 八％的范围。此外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述小颗粒群的所述颗粒浓度 优选为0. 01w/v% 0. 5w/v%的范围，更优选为0. 03w/v% 0. 3w/v%的范围，进一步优选 为0. 05w/v% 0. 2 八％的范围。此外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述大颗粒群的颗粒浓度优选为O. 001w/v% 0. 05w/v%的范围，更优选为0. 003w/v% 0. 04w/v%的范围，进 一步优选为0. 005w/v% 0.范围。接着，测定由于 所述凝集反应而产生的浊度变化。即，例如，根据浊度变化，来检测 由于所述免疫反应而产生的所述不溶性载体颗粒的凝集程度。由此，可以间接地定量所述 测定对象。作为所述免疫反应的测定方法，没有特别限定，例如可以列举通过光学方法测定 免疫反应后的所述免疫反应液的吸光度或散射光等的方法。所述光学方法中，例如，可以使 用通用的光学测定仪器。此外，测定结果的评价方法也没有特别限定，例如，可以将所述免 疫反应的反应开始后一定时间内的吸光度变化量作为指标。此时，作为所述反应开始后一 定时间，没有特别限定，优选为反应开始后O 5分钟的范围，更优选为30 180秒钟的范 围，进一步优选为30 150秒钟的范围。所述定量，例如，可以基于含有已知浓度的测定对象的标准试样的标准曲线而进 行。作为具体例子，首先，准备多个设定为目标浓度范围的标准试样，使它们在同样的条件 下发生免疫反应，根据浊度变化检测其凝集程度。然后，由表示所述浊度的吸光度等测定值 的变化和所述已知浓度制作标准曲线，并将待测物的测定值代入所述标准曲线，从而能够 定量所述待测物中的测定对象。实施例接着，结合比较例而对本发明的实施例进行说明。另外，本发明不受以下的实施例 和比较例的限定或限制。(实施例1-1)本例中，作为极性电荷侧链氨基酸，使用赖氨酸盐酸盐，通过下述方法，调制测定 试齐LUA.不溶性载体颗粒的调制本例中，使用平均粒径为0.096μπι的羧基改性聚苯乙烯胶乳颗粒(10%溶液， ceradyne, inc.制)作为所述小颗粒，使用0. 213 μ m的羧基改性聚苯乙烯胶乳颗粒(10% 溶液，ceradyne, inc.制)作为所述大颗粒。首先，向下述表1所示的组成的活化液中添 加所述小颗粒，在室温(25°C )下反应1小时，使所述小颗粒表面的官能团活化。另外，向 500mmol/L的MES缓冲液(pH6. 1)中添加所述MES缓冲液以外的成分后，添加蒸馏水达到该 表所示的最终浓度，调制所述活化液。下述组成所示的浓度为所述活化液中混合了所述小 颗�：蟮娜恳禾逯懈鞒煞值淖钪张ǘ龋垢萌恳禾逯械乃鲂】帕５淖钪张ǘ任狪w/ v%。反应结束后，离心分离(60000rpm，15分钟)，除去上清，将所述活化了官能团的小颗 粒悬浮于50mmol/L MES缓冲液(pH6. 1)中，用超声波使其再分散，然后清洗。再次进行该 清洗工序后，离心分离(60000rpm，15分钟)，并除去上清。将得到的所述小颗粒用所述MES 缓冲液悬�。贸ㄊ蛊湓俜稚ⅲ玫浇喝橐�(小颗粒)。另外，使所述胶乳液(小颗粒) 中的所述小颗粒的浓度为。此外，除了代替所述小颗粒而使用所述大颗粒以外，与所 述胶乳液(小颗粒)的调制同样地，调制胶乳液(大颗粒)。[表1](活化液的组成) 试剂
最终浓度
MES ( pH6.1,同仁化学研究所制) NHS水溶液※1 EDAC水溶液※2
50mmol/L
1 .Ommol/L
100mmol/L※！ NHS(N_羟基琥珀酰亚胺，少力，4歹义夕公司制)※？ :EDAC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，Sigma公司制)接着，向下述表2所示的组成的小颗粒用致敏反应液中混合所述胶乳液(小颗 粒)，在室温(25°C)下反应1小时，用多克隆抗体和单克隆抗体致敏所述小颗粒。另外，向 500mmol/L的MES缓冲液(pH6. 1)中添加所述MES缓冲液以外的成分后，添加蒸馏水达到 该表所示的浓度，调制所述小颗粒用致敏反应液。下述表2所示的组成所示的浓度为在所 述小颗粒用致敏反应液中混合了所述胶乳液(小颗粒)后的全部液体中的各成分的最终浓 度，使该全部液体中的小颗粒的最终浓度为lw/v%。另外，所述小颗粒用致敏反应液中，用 于致敏所述小颗粒的多克隆抗体和单克隆抗体的抗体浓度比(重量比)为多克隆抗体单 克隆抗体=1 9。[表2]
(小颗粒用致敏反应液的组成)
组成__MES ( pH6.1,同仁化学研究所制) 50mmol/L BSA ( Sigma公司制)lmg/mL
单克隆抗体液※10.36mg/mL多克隆抗体液※20.04mg/mL※！兔来源的抗人CRP单克隆抗体液(抗体浓度 10. 5mg/mL,克隆号 No. 8，Immuno Probe Co.，Ltd.制)※？兔来源的抗人CRP多克隆抗体液(蛋白质浓度 12. 2mg/mL, Oriental Yeast Co.，ltd.制)将致敏反应后的所述小颗粒离心分离(60000rpm，15分钟)后，悬浮于50mmol/L MES缓冲液(pH6. 1)中，用超声波分散后，清洗。再次离心分离(60000rpm，15分钟)，除去上 清后，将清洗后的所述小颗粒悬浮于所述MES缓冲液中。将悬浮后的所述小颗粒与封闭缓 冲液(50mmol/L MES缓冲液(pH6. l),4w/v% BSA)混合，达到1 八％的浓度。通过超声波使 所述小颗粒分散后，在4°C下静置一夜，进行封闭处理。封闭处理后，离心分离(60000rpm， 10分钟)，回收所述小颗粒，使用下述表3所示组成的分散液分散所述小颗粒，使小颗粒的 分散浓度为3. 33w/v%，调制小颗粒分散液。[表3]
权利要求
1. 一种不溶性载体颗粒的制造方法，其为在颗粒表面负载抗体或抗原的不溶性载体颗 粒的制造方法，其具有下述(A)和(B)中的至少一个致敏反应工序(A)该致敏反应工序为在致敏反应液中，在极性电荷侧链氨基酸的存在下，使所述抗 体或抗原与所述不溶性载体颗粒接触的致敏反应工序，所述致敏反应液中的所述极性电荷侧链氨基酸浓度为超过0. lmol/L且lmol/L以下的 范围；(B)该致敏反应工序为在致敏反应液中，在极性电荷侧链氨基酸的存在下，使所述抗 体或抗原与所述不溶性载体颗粒接触的致敏反应工序，作为所述不溶性载体颗粒，使用化学结合用胶乳颗粒。
2.根据权利要求1所述的不溶性载体颗粒的制造方法，其中，所述极性电荷侧链氨基 酸为碱性氨基酸或酸性氨基酸。
3.根据权利要求1所述的不溶性载体颗粒的制造方法，在所述(A)的致敏反应工序中， 所述不溶性载体颗粒为胶乳颗粒。
4.根据权利要求3所述的不溶性载体颗粒的制造方法，在所述(A)的致敏反应工序中， 所述胶乳颗粒为化学结合用胶乳颗粒。
5. 一种不溶性载体颗粒，其为用于免疫比浊法的不溶性载体颗粒，且通过权利要求1 所述的不溶性载体颗粒的制造方法而制得。
6. 一种测定试剂，其特征在于，其为用于免疫比浊法的测定试剂，且含有权利要求5所 述的不溶性载体颗粒。
7.根据权利要求6所述的测定试剂，其包含含有多个不溶性载体颗粒的不溶性载体颗 粒群，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的两种不溶性载体颗粒群，所述两种不溶性载体颗粒群中，至少一种不溶性载体颗粒群为包含多个权利要求5所 述的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群。
8.根据权利要求7所述的测定试剂，在所述两种不溶性载体颗粒群中，平均粒径较大 的不溶性载体颗粒群为包含多个权利要求5所述的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群。
9.根据权利要求6所述的测定试剂，其中，权利要求5所述的不溶性载体颗粒的平均粒 径为0. 03 2. Oym的范围。
10.根据权利要求6所述的测定试剂，其中，权利要求5所述的不溶性载体颗粒的平均 粒径为0. 08 2. Ομπι的范围。
11.根据权利要求6所述的测定试剂，其中，权利要求5所述的不溶性载体颗粒的平均 粒径为0. 12 0. 5μπι的范围。
12.一种待测物分析用具，其含有权利要求6所述的测定试剂。
13.根据权利要求12所述的待测物分析用具，其中，所述待测物分析用具为试验片、测 试盒和微芯片中的任意一种。
14.一种免疫比浊法，其特征在于，所述免疫比浊法具有以下工序凝集反应工序，使在颗粒表面负载抗体或抗原的不溶性载体颗粒与作为抗原或抗体的 测定对象发生免疫反应，使所述不溶性载体颗粒在免疫反应液中凝集；测定工序，对所述凝集反应所产生的所述免疫反应液的浊度变化进行测定；作为所述不溶性载体颗粒，使用权利要求5所述的不溶性载体颗粒。
15.根据权利要求14所述的免疫比浊法，在所述凝集反应工序中，使用包含多个不溶 性载体颗粒的不溶性载体颗粒群，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的两种不溶性载体颗粒群，所述两种不溶性载体颗粒群中的至少一种为包含多个权利要求5所述的不溶性载体 颗粒的不溶性载体颗粒群。
16.根据权利要求15所述的免疫比浊法，在所述两种不溶性载体颗粒群中，平均粒径 较大的不溶性载体颗粒群为包含多个权利要求5所述的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗 粒群。
17.根据权利要求14所述的免疫比浊法，其中，权利要求5所述的不溶性载体颗粒的平 均粒径为0. 03 2. O μ m的范围。
18.根据权利要求14所述的免疫比浊法，其中，权利要求5所述的不溶性载体颗粒的平 均粒径为0. 08 2. 0 μ m的范围。
19.根据权利要求14所述的免疫比浊法，其中，权利要求5所述的不溶性载体颗粒的平 均粒径为0. 12 0. 5 μ m的范围。
全文摘要
提供一种测定试剂、使用了该测定试剂的免疫比浊法及该测定试剂的制造方法，所述测定试剂即使所负载的抗体量增加，也能够抑制非特异性凝集，测定浓度范围很宽，且测定灵敏度高。本发明的不溶性载体颗粒的制造方法为颗粒表面负载抗体或抗原的不溶性载体颗粒的制造方法，其具有以下致敏反应工序在致敏反应液中，在极性电荷侧链氨基酸的存在下，使所述抗体或抗原与所述不溶性载体颗粒接触。通过本发明的制造方法得到的本发明的不溶性载体颗粒由于能够抑制非特异性凝集，因此分散性优异，如图3的实施例1-1～1-4所示，通过免疫比浊法进行测定时，测定浓度范围很宽，测定灵敏度高。
文档编号G01N33/543GK102007412SQ20098011378
公开日2011年4月6日 申请日期2009年4月21日 优先权日2008年5月9日
发明者高木英纪 申请人:爱科来株式会社
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
