专利名称：栉孔扇贝血细胞的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种应用单克隆抗体定量检测栉孔扇贝(Chlamys farreri)血细胞的酶联免疫(ELISA)检测试剂盒及其制备方法，属于贝类分子免疫学技术领域。
背景技术：
贝类缺乏免疫球蛋白和特异性免疫，其免疫防御过程是由血细胞和血淋巴中的体 液因子协同完成。血细胞通过自溶、聚集、吞噬、包囊、胞吐、氧化杀伤等方式，达到识别、包 裹和清除外来异物的目的；血细胞还能通过释放溶菌素、凝集素、调理素等物质来调理辅 助体液因子免疫，其在贝类抵御外界环境刺激及外来病原微生物侵袭的过程中起着关键作用。栉孔扇贝是我国北方沿海贝类养殖的重要经济种类。近年来病害频发，已逐渐成 为限制栉孔扇贝养殖业可持续发展的因素之一。目前栉孔扇贝多采用海上筏式笼养等养殖 方式，但在广阔的水域中对病害的发生、预防和流行的控制困难较大，因而对贝类健康状况 的监测显得尤为重要。已有研究发现，环境因子的变化和病原的侵袭可引起扇贝血细胞数 量的显著变化。本课题组研究发现，扇贝经饥饿、高温或病原刺激后，其血细胞数量要明显 低于未刺激的正常扇贝；此外，马洪明等[高技术通讯，2006 16 (7)，745-751]也报道扇贝 经盐度突降或细菌感染后，其血细胞数量会骤减；一些国外学者也在其他贝类研究中发现 贝类经Cu2+、Pb2+，干露，缺氧等刺激后，血细胞数量会明显低于某一正常值，有些甚至死亡。 因此，血细胞数量的变动可以作为一个评估扇贝受病原感染或环境胁迫等的检测指标。目前检测血细胞数量变动的方法主要有血球计数板法和流式细胞仪法。血球计数 板法误差大、主观性强、不适用于大规模样品检测；流式细胞仪法价格昂贵，耗材费用高，需 专门的技术人员操作、且对样品的针对性不强，易将杂质碎片误认为血细胞。单克隆抗体 (以下简称单抗)具有特异性强、灵敏度高等特点常被应用于免疫细胞的定位和病原的定 量研究中。
发明内容
针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种特异性强、精确度高、灵敏度高、重 复性好的应用抗栉孔扇贝血细胞单抗来检测血细胞数量变化的酶联免疫(ELISA)检测试 剂盒，以期评估养殖扇贝受病原感染或环境胁迫等的可能，为监测扇贝健康状况提供依据。本发明的另一个目的是提供上述栉孔扇贝血细胞ELISA检测试剂盒的制备方法。本发明的ELISA检测试剂盒包括酶标板，封闭液，洗涤液，酶标记抗体，pNPP底物 显色液，磷酸盐缓冲液(PBS)，血细胞抗凝剂，其特征在于所述的试剂盒还包括抗栉孔扇贝 血细胞单抗，血细胞标准样品。其中所述的抗栉孔扇贝血细胞单抗是通过收集抗栉孔扇贝血细胞的单克隆杂交 瘤细胞1F7的培养上清液，过Protein G-琼脂糖亲和层析柱，浓缩、透析、纯化制得，其特征 在于所述的单抗能与栉孔扇贝各种类型血细胞(透明血细胞、颗粒血细胞)特异性结合；
所述的血细胞标准样品是通过收集健康扇贝的血细胞，经重悬、超声波破碎后制 得；所述的封闭液为含3.0% (w/v)牛血清白蛋白的PBS ；所述的洗涤液为含0. 1 % (v/v) Tween-20的PBS ；所述的酶标记抗体为碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗小鼠IgG抗体；所述的血细胞抗凝剂为含0. 02M EDTA的PBS。本发明的ELISA检测试剂盒的制备方法包括下列步骤1.制备血细胞标准样品取健康的栉孔扇贝，定量抽取血淋巴，离心后，所得血细 胞沉淀用等量的血细胞抗凝剂重悬，经超声波破碎，作为本试剂盒的血细胞标准样品；2.制备抗栉孔扇贝血细胞的单抗以血细胞标准样品为抗原免疫小鼠，细胞融 合，经间接免疫荧光法筛�。寺。玫娇硅慰咨缺囱赴牡タ寺≡咏涣鱿赴渑嘌� 清液即含单抗；选取1株免疫荧光反应结果为强阳性，且能与栉孔扇贝各种类型血细胞特 异性结合的单抗作为本试剂盒的栉孔扇贝血细胞单抗；3.确定抗原与抗体的最佳使用比例将上述血细胞标准样品和血细胞单抗分别 用磷酸盐缓冲液进行梯度稀释，通过ELISA棋盘滴定法获取抗原抗体的适宜反应比例，进 而确定抗原与抗体的最佳使用比例；4.建立检测结果评估标准分别通过高温和病原的刺激，应用血细胞单抗的 ELISA法检测各刺激条件下血细胞的数量变化；根据统计学分析方法，以常温和高温刺激 实验组的结果制定扇贝健康状态与受环境胁迫的临界范围；以对照和病原感染实验组的结 果制定扇贝受环境胁迫与病原感染的临界范围；在二者之间即为受环境胁迫的范围；从而 建立评估标准。本发明的优点是将血细胞作为抗原包被于酶标板，应用血细胞单抗通过高效率的 酶标记抗体显色的方法将待检样品的血细胞含量直观表达出来，特异性强，精确度高，灵敏 度高，可用于少量样品、多个样品的平行检测，重复性和稳定性好。检测结果能够评估扇贝 受病原感染或环境胁迫等的可能，起到提前预警的作用，方便养殖户及早采取防控措施。
图1为本发明的栉孔扇贝血细胞悬液与单抗1F7反应间接免疫荧光检测的结果。图2为本发明的水温为15°C和25°C时栉孔扇贝血细胞样品的ELISA检测结果。图3为本发明的水温为25°C，受病原感染时栉孔扇贝血细胞样品ELISA检测结果。图4为本发明的2009年3 12月青岛地区养殖的栉孔扇贝血细胞样品的ELISA 检测结果。图1所示A为暗视野下荧光检测的结果；B为明视野下原位微分干涉检测的结 果；其中G为颗粒血细胞；H为透明血细胞。
具体实施例方式下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1 栉孔扇贝血细胞ELISA检测试剂盒的制备1.制备血细胞标准样品
取30 40只活力健康、体质正常(适宜的生活环境水温15°C，盐度31ppt，饵料 充足，无病原微生物等)的栉孔扇贝，从闭壳肌抽取血淋巴50ml，按体积比为1 1与预冷 的血细胞抗凝剂(含 0. 02M EDTA 的 PBS 0. 02M EDTA，0. 14M NaCl, 3mM KCl,8mM Na2HPO4, 1. 5mM KH2PO4,pH 7.4)混勻，混合液经3000r/min，4°C离心lOmin，所得血细胞沉淀，用50ml 抗凝剂重悬，再经超声波破碎，即为血细胞标准样品，分装，-80°C冻存。2.制备抗栉孔扇贝血细胞的单抗 (1)动物免疫取100 μ 1血细胞标准样品作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂混 勻，完全乳化后，从BALB/c小鼠的腹腔多点注射乳化液共100 μ 1 ；首次免疫两周后进行加 强免疫(佐剂改用弗氏不完全佐剂，免疫剂量和部位同首次免疫)；一周后，进行二次加强 免疫(无佐剂的血细胞标准样品ΙΟΟμ 1，尾静脉注射)；一周后，进行扩增免疫(免疫物质， 剂量和部位同二次加强免疫)；三天后，融合；(2)细胞融合和血细胞阳性杂交瘤的筛选将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞按 常规方法[朱立平，陈血清等.免疫学常用试验方法[Μ].北京人民军医出版社，2000， 23-74]进行细胞融合、培养、及间接免疫荧光法(以未经固定的扇贝血细胞悬液为抗原)筛 选，得到抗扇贝血细胞的阳性杂交瘤细胞；再用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克�。� 到抗扇贝血细胞的阳性单克隆杂交瘤细胞。收集阳性单克隆杂交瘤细胞的培养上清液(即 含单抗)，通过间接免疫荧光法进一步筛选出1株免疫荧光结果为强阳性的单抗1F7，其能 与栉孔扇贝透明血细胞和颗粒血细胞均特异性结合(图1)。单抗1F7经免疫组化检测后， 结果表明其与栉孔扇贝其它组织细胞无交叉反应；(3)血细胞单抗的收集与纯化收集杂交瘤细胞1F7的培养上清液250ml，过 AmershamPhamacia Biotech 公司的亲禾口层析柱(HiTrap Protein G Sepharose Column), 浓缩、透析、冻干，PBS重悬，分装，-80°C冻存。3.确定抗原与抗体的最佳使用比例血细胞标准样品用PBS按2°，2—1，2_2，2_3，2_4，2_5，2_6和2_7的梯度稀释包被于酶标 板孔内，每孔100μ 1，每个梯度的样品加样6孔，4°C过夜；加封闭液(用PBS配制的3.0% 牛血清白蛋白溶液)封闭Ih ；将血细胞单抗(一抗)用PBS按2° J-1I2J-3I4和2_5的梯 度稀释，按棋盘滴定法加入到相应的抗原孔中，每孔100μ 1，37°C孵育1. 5h ；再加入酶标记 抗体(AP 二抗)100μ 1，37 °C孵育Ih ；最后加pNPP底物显色液100μ 1，37°C孵育30min，用 酶标仪于405nm处读数。结果表明(表1)血细胞标准样品浓度与血细胞单抗浓度组合为 2°2°，^1,^0, Π2，2_22°，2_224时的OD4tl5nm值普遍高于其他各种组合，为抗原抗体的适宜 反应比例。考虑实际用量、节约成本等问题，选择2、_2(即抗原稀释2倍，单抗稀释4倍) 作为试剂盒抗原抗体的最佳使用比例。表1 各个抗原、抗体梯度组合的OD4tl5nm值，粗体为OD4tl5nm值彡0. 5600。 4.建立检测结果评估标准(1)高温和病原刺激实验的设计取100只扇贝分别在水温15°C (常温)和 250C (高温)的条件下(每组50只)，养殖7天；取100只扇贝分别注射扇贝急性病毒性坏 死病毒(AVNV)粗提液，每只100 μ 1，另取100只扇贝注射2%的灭菌生理盐水作为对照组， 在水温为25°C的条件下各养殖15天。每天观察各实验组扇贝的健康状况，每组采样5 6只扇贝，定量抽取血淋巴，离心后，所得血细胞沉淀用等量抗凝剂重悬，经超声波破碎，分 装，-80°C冻存，待用；(2)ELISA检测分别将经温度和病原刺激的各天样品和血细胞标准样品以2_1稀 释作为抗原，包被于酶标板孔中，每孔100 μ 1，4°C过夜；加封闭液于37°C孵育Ih ；加2-2稀 释的血细胞单抗，每孔100 μ 1，37°C孵育1. 5h ；加酶标记抗体(AP 二抗)，每孔100 μ 1,37°C 孵育Ih ；最后加pNPP底物显色液，每孔100μ 1，37°C孵育30min，于405nm处读数。待血细 胞标准样品的OD4tl5nm值达到0. 6时，即可停止读数，读取各组样品的OD4tl5nm值；(3)ELISA结果水温为15°C的实验组7天内的OD4tl5nm值位于0. 591 0. 625，各值 之间无显著差异；水温为25°C的实验组7天内的OD4tl5nm值位于0. 489 0. 586，各值与15°C 组的最低值(0. 591)相比，除第7天的值(0. 586)无显著差异外，第1 6天的各值均显著 低于0. 591 (图2)。在25°C水温条件下，对照组(注射生理盐水)15天内的OD4tl5nm值位于 0. 486 0. 621 ；病原感染组在第2 9天内扇贝急剧死亡，最终存活率为44% ；15天内的 OD4tl5nm值位于0. 261 0. 571，其中第3 9天的各值(0. 261 0. 446)特别低，显著低于 对照组的最低值(0. 486)(图3)；(4)分析检测结果，建立评估标准结合图2的结果，在25°C实验组的第1 6天 各值中选取最大值(0. 549),0. 549与0. 591之间即为环境胁迫与健康状态的临界范围；结 合图3的结果，在病原感染组的第3 9天各值中选取最大值(0. 446)，0. 446与0. 486之 间即为环境胁迫与病原感染的临界范围。经差异显著性以及统计学结果分析，本试剂盒的 环境胁迫与健康状态的临界范围为0. 57士0. 025，高于本范围时扇贝为健康状态；环境胁 迫与病原感染的临界范围为0. 47士0.019，低于本范围时扇贝为病原感染状态。位于二者之 间的范围时扇贝为环境胁迫状态。实施例2 栉孔扇贝血细胞ELISA检测试剂盒的具体使用方法1.待检样品前处理用灭菌注射器从闭壳肌中定量抽取血淋巴，立即与预冷血细 胞抗凝剂按体积比为1 1混勻。混合液于3000r/min，4°c离心lOmin，所得血细胞沉淀用 与血淋巴等量的抗凝剂重悬，经超声波破碎后，即为待检样品；
2.包被抗原将上述待检样品和血细胞标准样品用PBS以2—1稀释，加到酶标板孔 中，每孔100μ 1，4°C包被过夜；3.封闭弃去孔内液体，每孔中加200 μ 1洗涤液(PBST)，轻轻摇晃5min，倒掉洗 涤液，反复3次。洗完后，在每孔中加入200 μ 1封闭液，37°C孵育Ih ；4. 一抗孵育弃去孔内液体，每孔中加200 μ 1洗涤液，5min/次，洗3次。洗完后， 每孔中加入100μ 1用PBS以2_2稀释的血细胞单抗，37°C孵育1. 5h ； 5. 二抗孵育弃去孔内液体，每孔中加200 μ 1洗涤液，5min/次，洗3次。洗完后， 每孔中加入100 μ 1酶标记抗体，37°C孵育Ih ；6.显色读数弃去孔内液体，每孔中加200 μ 1洗涤液，5min/次，洗3次。洗完后， 每孔中加入100μ 1 ρΝΡΡ底物显色液，于37°C孵育30min后用酶标仪于405nm波长下读数。 待血细胞标准样品的OD4tl5nm值达到0. 6时，即可停止读数，读取待检样品的OD4tl5nm值；7.检测结果的判定按试剂盒所附的评估标准，当待检样品的OD4tl5nm值低于 0. 47士0. 019时判定为受病原感染状态；位于0. 47士0. 019与0. 57士0. 025之间时判定为 受环境胁迫状态；高于0. 57士0. 025时判定为健康状态。实施例3.应用本试剂盒检测青岛地区养殖的栉孔扇贝其血细胞的季节性变化1.样品采集和处理选取山东省青岛市沙子口地区，2009年3至12月份间每月中 旬随机采集扇贝100只，每次取样后从所采集的扇贝中又随机取20只扇贝按实施例2中待 检样品前处理的方法处理样品；2.样品检测按实施例2中所提供的本试剂盒的具体使用方法对每月份所采集的 血细胞样品进行ELISA检测；3.结果分析(图4) :2009年3至12月份沙子口养殖地区的栉孔扇贝其血细 胞 ELISA 检测的 OD4tl5nm 值分别为 0. 623，0. 648，0. 598，0. 685，0. 634，0. 402，0. 385，0. 476， 0. 487和0. 542。其中3 7月份的各值均高于0. 57士0. 025 (环境胁迫与健康状态的临界 范围)，该时期水温适宜，饵料充足，扇贝生长快速，性腺饱满，尤其是6月份，扇贝处于健康 状态；8，9月份的各值均低于0. 47士0. 019 (环境胁迫与病原感染的临界范围)，该时期扇 贝繁殖期结束，体质较为虚弱，加之水温升高，病原增殖加快，极易处于受病原感染的状态； 10 12月份的各值均位于0. 47士0. 019与0. 57士0. 025之间，该时期扇贝处于一个病原感 染后的恢复期，加之饵料食物的日渐缺乏，基本处于环境胁迫状态。本发明通过对栉孔扇贝 血细胞季节性变化的检测，其检测结果与实际生产的扇贝状况基本吻合，适用于生产实践 中扇贝健康状况的评估。
权利要求
一种栉孔扇贝血细胞的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板，封闭液，洗涤液，酶标记抗体，pNPP底物显色液，磷酸盐缓冲液，血细胞抗凝剂，其特征在于所述的试剂盒还包括抗栉孔扇贝血细胞单克隆抗体，血细胞标准样品。
2.根据权利要求1所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的 抗栉孔扇贝血细胞单克隆抗体是通过收集抗栉孔扇贝血细胞的单克隆杂交瘤细胞1F7的 培养上清液，过Protein G-琼脂糖亲和层析柱，浓缩、透析、纯化制得。
3.根据权利要求1所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的 栉孔扇贝血细胞标准样品是通过抽取健康栉孔扇贝的血淋巴，离心得到血细胞，重悬，超声 波破碎制得。
4.根据权利要求1所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的 封闭液为含3.0% (w/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的 洗涤液为含0. 1% (v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的 酶标记抗体为碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体。
7.根据权利要求1所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的 血细胞抗凝剂为含0. 02M EDTA的磷酸盐缓冲液。
8.—种权利要求1所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在 于所述的方法包括以下步骤制备栉孔扇贝血细胞标准样品；以血细胞标准样品为抗原 免疫小鼠，制备血细胞单克隆抗体；选取1株免疫荧光反应结果为强阳性，且能与各种类型 血细胞特异性结合的单克隆抗体作为权利要求1所述的试剂盒的抗栉孔扇贝血细胞单克 隆抗体；优化抗原与抗体的最佳使用比例；建立检测结果的评估标准。
9.根据权利要求8所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在 于所述的1株免疫荧光反应结果为强阳性，且能与各种类型血细胞特异性结合的单克隆 抗体是单抗1F7。
10.根据权利要求8所述的栉孔扇贝血细胞酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征 在于所述的检测结果评估标准是通过高温和病原的刺激，采集各刺激条件下的血细胞样 品，酶联免疫吸附法检测其血细胞的数量变化，所得结果通过统计学方法分析，获得受病原 感染和环境胁迫的临界范围确定而成。
全文摘要
本发明公开了一种栉孔扇贝血细胞的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括酶标板、封闭液、洗涤液、酶标记抗体、pNPP底物显色液、磷酸盐缓冲液、血细胞抗凝剂、栉孔扇贝血细胞单克隆抗体、血细胞标准样品；所述试剂盒的制备方法包括以下步骤栉孔扇贝血细胞标准样品的制备，血细胞单抗的制备，抗原与抗体最佳使用比例的优化，以及检测结果评估标准的建立。本发明的检测结果可通过所建立的评估标准的判定，评估待检扇贝受病原感染或环境胁迫等的可能，从而为监测扇贝健康状况提供依据。
文档编号G01N33/531GK101846685SQ20101019109
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者战文斌, 林听听, 绳秀珍, 邢婧 申请人:中国海洋大学
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