专利名称：荧光分析法分析颗粒组合物的方法
技术领域：
本发明涉及通过对颗粒组合物进行荧光分析进而对含有生物活性化合物的颗粒组合物的性质进行分析的方法。本发明还涉及用于生产特定产物的方法，其中包括对产物进行荧光分析。此外本发明涉及适用于制备含生物活性化合物的颗粒组合物的制�：�/或包衣设备，所述设备包括荧光分析的装置。
背景技术：
利用某些化合物(荧光团)被光激发时发出荧光这一现象对样品中的化学化合物进行分析(荧光分析)是本领域熟知的。在成分非常确定的样品中荧光分析具有灵敏和精确的优势，但它也有严重的缺陷。例如，在复杂样品中，荧光团的荧光性常被荧光团周围环境中的其它化合物所改变(称作淬灭)，这使得难于定量地对复杂和/或成分不十分明确的样品进行荧光分析。这尤其符合非均相或固相样品中的情况，此时还必须考虑光的散射。
近年来随着电子学的发展，出现了利用摄像检测器进行荧光成像的更为成熟的方法，这使得能够拍摄到发荧光的样品的发射光，由此二维图象可以显示出样品中荧光团的空间分布。
对用于面粉精制的糊粉组织经紫外(UV)激发进行荧光成像的一个实例可从Dexter等.，Cereal Chemistry(谷物化学)，vol.70(1)，90-95，1993中了解到。
Kaufman等.，Powder Technology(成粉技术)，vol.78(3)，239-246，1994)利用荧光显微技术对液体流化床中煤微粒分布进行了原位显像。
更一般的成像分析的实例可在Buydens等.，Analytical Chimica Acta，vol.361(1-2)，161-176，1998找到，他报道了基于近红外线成像对废弃物中塑料的在线分类和多元成像分析。
Watano等.，Pharmaceutical Bulletin(药学公告)，vol.48(8)，1154-1159，2000报道了通过成像处理系统对高剪切力制粒过程中的颗粒生成进行在线监测。
在US5,497,232中Watano等报道了在流化床或锅式制粒机中利用照相机如用在摄像机中的CCD型照相机对颗粒生成进行成像。
发明概述本发明涉及通过对含有生物活性化合物的颗粒组合物进行荧光分析进而对此颗粒组合物的性质进行分析的方法。通常需要将化学化合物制成成品，尤其是制成颗粒，以改良产品的性能，这样可使它们更具有商业吸引力。然而，对于生物活性化合物来说，制粒通常是生产者必需进行的工作，因为活性化合物必须在意欲使用之前与周围环境分离以确保产品的安全操作。能够从粒化产品释放出来的如粉尘形式的生物活性化合物的量必须被减少到最少以保证产品的操作者不会由于接触生物活性化合物而受到不利影响。反之亦然，必须保护活性化合物防止其受到颗粒外界环境的影响，以便在其被使用时仍保持有稳定性和活性。一旦活性化合物被粒化，已知还可以利用包衣材料包被含有生物活性化合物的颗粒，这样可进一步抑制活性化合物从颗粒释放出来并进一步提高颗粒中活性化合物的稳定性。一般通过增加包衣层的厚度，有可能进一步改善颗粒性能。
本发明的一个目的是提供方法，尤其以成像系统的形式，用于测定含有纯化的生物活性化合物的颗粒组合物的性质参数。这样的参数可以是如在制备颗粒组合物的过程中或之后以活性粉尘形式从颗粒释放出来的活性化合物的量。另一个参数是如加在颗粒上以抑制粉尘形成和提高活性化合物稳定性的包衣层的厚度和/或完整性，本发明中可在给含生物活性化合物的颗粒加包衣的过程中或之后对此参数进行测定。本发明的另一目的是设计一种制粒设备和选择方法构成，以使此方法能够在线或串联地应用于此种颗粒组合物的生产中，并使该方法可以在颗粒组合物的加工过程中实时地提供有关含生物活性化合物的粉尘的量的信息。
我们发现对于含有纯化的生物活性化合物的颗粒组合物，不仅被限制在颗粒表面区域的活性化合物而且存在于组合物的尘粒(例如由于颗粒中活性化合物的释放或者由于制粒不充分产生的)中的活性化合物均可以通过以能够引起荧光标记，如生物活性化合物自身荧光激发的光照射组合物，并检测荧光标记的发射光来进行评价。因此，第一方面，本发明提供一种荧光分析的方法，该方法包括以能够对包含在颗粒组合物中的荧光标记进行荧光激发的光照射含有纯化的生物活性化合物的颗粒组合物，检测荧光标记的发射光，并预测颗粒组合物中受到荧光激发的荧光标记的量。可激发的荧光标记的量可以与颗粒组合物的性质如粉尘水平和/或包衣厚度或包衣完整性相联系。
此外，第二方面，本发明提供一种用于在制粒设备中制备包含纯化的生物活性化合物、荧光标记和任选地辅助制粒剂的颗粒的方法，所述方法包括执行本发明第一方面的荧光分析的步骤(见上)。
更进一步地，第三方面，本发明提供一种制粒或包衣设备，其包括(a)包含至少一个对材料进化粒化或对成粒材料进行包衣的室的制粒或包衣装置，(b)至少一个能够检测发射光的检测器，(c)将照射光源以光束形式投射到加工中的部分材料上的装置，(d)引导被照材料发射出的光达到检测器的装置以及(e)至少一个用于选择照射光或发射光波长的装置。
最后，第四方面，本发明提供了将荧光分析应用于含纯化的生物活性化合物的颗粒。
附图简要说明
图1光学装置的一个实例，其中1＝检测器(CCD照相机)，2＝光源，3＝带通滤波器，4＝分色镜光束分离器，5＝透镜，6＝漏斗，7＝通过照射光束的发荧光颗粒图2在线光学装置的一个实例，其中1＝CCD照相机记录下的颗粒发射光的照片，2＝CCD照相机，3＝光源，4＝传送带上的颗粒。
发明详述荧光分析如所述，本发明涉及对含有活性化合物的颗粒组合物进行荧光分析的方法。
此方法的第一步包括用能够激发颗粒组合物中的荧光标记的光束照射颗粒组合物。在此步骤中，照射光中的光子将被荧光标记吸收，从而荧光化合物中的电子获得能量并进入一个特定的升高能级。随电子返回其初始基态能级，受激发的荧光标记随后通过发射出特征波长的光子释放出至少部分获得的能量，所述波长由升高的能级和初始能级之间的能量差表征。
此方法的第二步包括利用能够将发射光转化为电信号的检测器，检测来自颗粒组合物的发射光。
此方法的第三步包括对电信号进行处理，通过预测受荧光激发的颗粒组合物中的荧光标记的量使发射光的量和颗粒组合物的一个或多个性质相关联。
对有关荧光分析基本原理的全部术语的说明和意义是本领域技术人员所已知的。
颗粒组合物的照射颗粒组合物的照射可以以任一种可放射能够激发颗粒组合物中荧光标记的光的适当光源来实行。光源可以是如普通的辉光灯，较专业的氙灯或频闪灯。
荧光标记化合物的光学性质可以是已知的并且为了优化已知荧光标记的激发，优选的光源是其发送的相当大部分光的波长适用于激发荧光标记的光源。如果想要(当使用已知荧光标记时这是可能的)避免或限制除荧光标记外的其它化合物的激发和发射(这可能会干扰分析)，那么就需要过滤光束，以使只有选定波长的光能够照射到颗粒组合物。这可以利用一个或多个分束器和一个或多个带通滤波器如高和/或低带通滤波器，或只允许特定波长的光通过的光栅单色仪来完成。这些部件通常被整合在商品化的，如来自美国Perkin Elmer的荧光分析仪中。带通滤波器和单色仪可使窄波长范围的(通常在几个nm，如0.5-10nm内)光通过，这是技术人员已知的。因此术语单色光应理解为由通带通滤波器和单色仪确定的窄波长范围内的光。
在一个特定实施方案中，照射颗粒组合物的光由1-10个不连续的单色波长，优选1-4个不连续的单色波长组成。尤其是，照射颗粒组合物的光可以由1个不连续的单色波长组成。在照射颗粒组合物的步骤中，可适宜地使用包括如反射镜，分束离(如分色镜)和/或光导纤维的光学装置以使照射光投射到颗粒组合物上。
发射光的检测发射光可以是荧光标记或包含在荧光标记中的化学基团或组分所特征性的。由于荧光标记通常仅发射一个或多个窄波长范围内的光，故优选对发射光进行过滤，以使只有在这些窄范围内的发射光才能达到检测器。这可以通过如上所述利用一个或多个带通滤波器或单色仪过滤发射光来完成，见上文。同时这可避免可能会干扰分析的除荧光标记外的其它化合物的发射光到达检测器或限制其到达的量。因此，在一个特定实施方案中，只有1-10个不连续单色波长的发射光被检测到，优选1-4个不连续的单色波长。尤其是，到达检测器的发射光可以由1个不连续的单色波长组成。
此外，与照射时一样，在检测发射光的步骤中可适宜地使用包括如反射镜、分束器(如分色镜)、光导纤维和/或聚焦发射光的手段(如透镜)的光学装置以使发射光投射到检测器上。
许多种检测器都可以应用于检测发射光。检测器可以是光电倍增型检测器，光电二极管或光电二极管阵列，行扫描照相机，CCD照相机，ICCD照相机或任一种适用于检测发射光的其它类型。特别是，检测器可以是照相机型检测器，如可以选自灰度照相机，行扫描照相机，光电二极管阵列，CCD(电荷耦合器件)照相机以及ICCD(增强CCD)照相机。尤其是，检测器可以是CCD照相机和ICCD照相机，因为它们更灵敏并且能够形成2维图像从而显示出发光颗粒或尘粒的空间分布。按照专业分析人员的术语这称为荧光成像。在一个特定实施方案中可使用两个或多个检测器以同时记录两个或多个所选波长或者两个或多个波长范围。如果测定一个以上的荧光标记或如果一个特定的荧光标记发射出不同波长的光，就需要这样的操作。这尤其可以利用包括一个或多个分束器和两个或更多个带通滤波器或单色仪的光学装置来完成。在一个最特别的实施方案中，利用的是如附图1中示意显示的包括CCD照相机、分色镜和带通滤波器及透镜的光学装置。
检测信号的处理由于进行荧光分析的荧光分析仪器的大量应用，在检测器中将发射光转化为电信号再将此信号转化为量值，如数值(由此可以预测出发射光的量和推断出受激发的荧光标记的量)，这是技术人员已知的。这种预测可适宜地通过比较未知颗粒组合物的发射光的量与性质已知的颗粒组合物的发射光的数据进行，进而预测出未知颗粒组合物中受激发的荧光标记量。大多数检测器，如基于光电倍增的类型或一些基于光电二极管的类型，输出的是模拟信号。大多数检测器如许多照相机(包括众多单光电二极管检测器)都有一个内置的模拟—数码转换器能够将模拟信号转变为更适用于计算机化数据处理的数字信号。为了将荧光标记和颗粒组合物的性质与发射光的量联系起来，可以对产生自发射光的数字数据进行处理。此处理适于在计算机系统中利用为此处理设计的软件来进行。这种软件有例如用于本文实施例中的LabView软件和具有处理所需数据使发射光的量和颗粒组合物的性质相联系的必备能力的任何其它软件。数据处理可包括的操作有微粒计数，测量，模式匹配(灰度和彩色)，统计，阈值，多元成像分析，AMT，点分析，面积计算，边缘检测，形态分析，卷积，折叠和展开，FFT，各种滤波技术如中值滤波—所有技术均为专业分析人员已知，是包括在商业化软件中的数据处理功能。在将数据传输到计算装置的过程中，计算装置通常需配备能够从检测器获得数据的硬件用于将数据存储在计算装置中。此种硬件，如数据采集卡，是众所周知的。当利用CCD或其它类型照相机产生荧光颗粒的2维图像时，在计算装置中，还优选使用能够以不连续的数码静止图像的形式记录2维图像的软件。这种软件称作帧获取程序。此软件记录图像的速率通常取决于计算装置的速率，对于多数荧光分析的用途来说，速率为每秒大约15帧就足够了。这表示每秒记录15幅二维图像。
颗粒组合物物理性质本发明的颗粒组合物是一种被加工成微粒或颗粒的含有生物活性化合物、本身可能就是此生物活性化合物的荧光标记以及任选地辅助制粒剂和包衣剂的组合物。因此，成品颗粒是实施本发明操作和方法的结果。术语“颗粒”可以理解为一种大分子尺寸的显著球形或近似球形的结构，其最长直径的平均尺寸优选在20-2000μm之间，更优选在100-1000μm之间，最优选在200-800μm之间。球形颗粒具有的比率(a)∶(b)，即颗粒的最短维的直径(a)和最长维的直径(b)之间的比率优选为1∶1到1∶5，更优选1∶1到1∶3。
颗粒的“粒径分布”(PSD)可以用各微粒的质量平均直径来表示。质量平均直径D50表示按质量计50％的颗粒具有比此直径较小的直径，而50％质量的颗粒具有较大直径。值D10和D90分别表示按质量计10％和90％的颗粒的直径比所提及的值小。“跨度”指PSD的宽度，可以表示为(D90-D10)/D50。为了本发明的目的，制粒之后颗粒的PSD通常越窄越好。在本发明中，利用荧光分析控制制粒过程可以有助于降低PSD，因此制粒之后颗粒组合物的跨度尤其可以小于约2.5，优选小于约2.0，更优选小于约1.5，最优选小于约1.0、尤其是可以以包衣剂形成一个，优选均质，一致且连续的层环绕颗粒来包被颗粒。本文所用的术语包衣剂可理解为单一的包衣化合物或包衣化合物的混合物。因此具包衣的颗粒由颗�：诵暮涂帕０伦槌�。尤其是，包衣层可以相对地厚以进一步减少粉尘化和增加生物活性化合物的稳定性。包衣厚度可通过具包衣的颗�：诵牡钠骄本逗臀窗碌目帕：诵牡钠骄本吨涞谋嚷�(以下简称DG/Dc)进行描述，也就是具包衣的颗粒的平均直径除以单独的颗�：诵牡钠骄本�。如果例如直径100μm的颗粒核心包被一层200μm厚的包衣，则颗粒的直径是(200+100+200)＝500μm而DG/Dc是500μm/100μm＝5。本发明具包衣的颗粒的DG/Dc优选至少为1.1，这意味着包衣的厚度至少为平均颗�：诵闹本兜�5％。更优选DG/Dc是至少1.5，更优选是至少2，更优选是至少2.5，更优选是至少3，最优选是至少4。但DG/Dc优选低于约100，优选低于约50，更优选低于25，最优选低于10。DG/Dc的最优选范围是约4到约6。
此外，在本发明中包衣基本上不含有酶，本文所用的有关包衣的术语“基本上不含有酶”是指每克包衣材料中含有少于5mg的酶。
对于构成本发明颗粒的材料(见下)，这些材料，与透明的材料如玻璃相反，一般不能透过可见光，举例来说，一个人通常不能透过该颗粒视物。然而，当含有本领域的生物活性化合物的颗粒接受激发光的照射时，我们发现此激发光可以穿透颗粒表面并且激发颗粒表面上或附近的适当荧光化合物，而且此荧光化合物的发射光可以逃逸出颗粒以致可以被检测器接受到。
此外，通�？帕Ｖ械乃趾啃∮�20(w/w)％，优选小于15(w/w)％，更优选小于10(w/w)％，如在4到8(w/w)％范围内。
构建可通过本领域已知的任一种制粒方法构建颗粒。
本发明颗粒的构建方法可分成下列非限制性类别a)喷雾干燥颗粒，其中在喷雾干燥器中将包含生物活性化合物的流体溶液进行雾化形成小液滴，小液滴在沿干燥器下落的途中干燥形成含有生物活性化合物的颗粒物质。这种方法可以生产非常小的颗粒(Michael S.Showell(编者)；粉末状去污剂；表面活性剂科学杂志(Surfactant ScienceSeries)；1998；vol.71；140-142页；Marcel Dekker)。对于这些颗粒，生物活性化合物可以紧密地与流体溶液中的任何其它辅助制粒剂相混合。
b)层式颗粒，其中围绕预成型的核心微粒包被一层生物活性化合物，在该技术中，通常在能够对预成型的核心微粒进行流化的流化床设备中，对包含生物活性化合物和优选地辅助制粒剂的溶液进行雾化，然后使含生物活性化合物的溶液粘附到核心微粒上并干燥直到在核心微粒表面形成一层干燥的生物活性化合物层。如果能够得到所需尺寸的有用核心微粒就能利用此方法获得所需尺寸的颗粒。对此类产品的说明参见如WO97/23606。
c)吸附核心颗粒，其中不是围绕核心包被一层生物活性化合物，而是使生物活性化合物吸附在核心表面之上和/或之内。对此方法的说明参见WO 97/39116。
d)压出或丸状颗粒，其中在模具中将含生物活性化合物的糊状物压制成颗粒，或在压力下将其挤压通过小的开孔并切成颗粒，随后进行干燥。通常此种颗粒的尺寸相当大，这是由于制备挤压孔的材料(通常是带有钻孔的板)限制了挤压孔上可允许施加的压力降。除此之外，如果使用小的开孔，很高的压出压力会使糊状物中的热生成量增加，这对生物活性化合物可能有害(Michael S.Showell(编者)；粉末状去污剂；表面活性剂科学杂志(Surfactant Science Series)；1998；vol.71；page 140-142；MarcelDekker)。
e)喷雾冷却颗粒，其中将生物活性化合物粉末悬浮于熔融蜡中，并例如经旋转式圆盘喷雾器，将所得悬浮液喷射进入冷却室，在冷却室中液滴迅速固化(Michael S.Showell(编者)；粉末状去污剂；表面活性剂科学杂志(Surfactant Science Series)；1998；vol.71；page 140-142；MarcelDekker)。对于这些颗粒，生物活性化合物紧密地与蜡相混合，而不是集中在其表面。文献US4,016,040和US4,713,245也涉及到这个技术。
f)高剪切力混合器颗粒，其中将含有生物活性化合物的液体添加到具有辅助制粒剂的干粉组合物中，液体和粉末以适当比例进行混合，并且随着液体中的水分被吸收到干粉中，干粉中的各成分开始粘合凝聚，颗粒增大，这样就形成了含生物活性化合物的颗粒。对于这些颗粒，活性化合物紧密地与辅助制粒剂进行混合。对此方法的说明见US4,106,991(NOVONORDISK)及相关文献EP 170360 B1(NOVO NORDISK)，EP 304332 B1(NOVO NORDISK)，EP 304331(NOVO NORDISK)，WO 90/09440(NOVO NORDISK)和WO 90/09428(NOVO NORDISK).
颗粒组合物中的尘�？赡艽嬖谟诳帕Ｗ楹衔镏械某玖＃涮卣魇峭暾帕５乃槠ǔ１瓤帕＞哂行〉枚嗟某叽缜也痪哂锌帕５奶赜星蛐涡巫�。尘粒一般具有不规则的非球形断裂结构如棒形或薄片形。尘粒一般远远小于颗粒的平均大�。莶煌目帕Ｗ楹衔铮蠖嗍玖Ｖ本缎∮�20μm。
作为完整颗粒的碎片，尘粒与完整颗粒具有同样的不透明性而且通�：写笤枷嗤暮浚衔摹�
颗粒组合物中的化合物生物活性化合物本发明的颗粒组合物包含生物活性化合物，尤其是纯化的生物活性化合物。本文所用的术语生物活性化合物可以理解为任一种在生物系统中具有活性的化合物，如能够干扰和/或改变生物学途径或生物学反应的化合物。本文所用的术语“纯化”可以理解为制粒之前为除去如多余物质和/或浓缩活性化合物经过一次或多次纯化的生物活性化合物。在利用微生物发酵方法制备活性化合物的情况下，纯化尤其包括选自如下的步骤过滤，超过滤，絮凝，沉降，蒸发，提取等，以除去生物量和其它不需要的物质(包括水)，进而产生富含生物活性化合物的混合物。
生物活性化合物包括尤其是有机化合物如生物催化剂，治疗剂，除草剂，杀虫剂和杀真菌剂。尤其此生物活性化合物可以通过发酵能生产此活性化合物的微生物来进行生产。
尤其是，化合物可以是蛋白质和肽，更优选催化蛋白质，即酶，因为蛋白质如酶被大量地应用于工业生产中，并且已知它们能够对暴露于这种蛋白质的人类和动物造成有害的过敏反应。此外，酶被广泛用于家用产品如用于除去生物源性污渍的去污剂中，而且许多工业过程也涉及酶的手工操作。所述酶可以是任一种需要通过酶的制粒过程使其与周围环境分离的酶。
应用于本说明书及权利要求书中的酶分类的依据是国际生物化学和分子生物学协会命名委员会的建议(1992)，(Recommendation(1992)of theNomenclture committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology Academic Press，Inc.，1992)。
因此，适于结合在本发明颗粒中的酶的类型包括氧化还原酶(EC1.-.-.-)，转移酶(EC2.-.-.-)，水解酶(EC3.-.-.-)，裂解酶(EC4.-.-.-)，异构酶(EC5.-.-.-)和连接酶(EC6.-.-.-)。
在本发明上下文中，氧化还原酶尤其可以是过氧化物酶(EC.1.11.1)，漆酶(EC1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)]，而优选的转移酶可以是属于下列任一个亚类的转移酶a)转移单碳基团的转移酶(EC2.1)；b)转移醛或酮残基的转移酶(EC2.2)；酰基转移酶(EC2.3)；c)糖基转移酶(EC2.4)；d)转移除甲基基团外的烷基或芳基基团的转移酶(EC2.5)；以及e)转移含氮基团的转移酶(EC2.6)。
本发明上下文中最优选的转移酶类型是转谷氨酰胺酶(蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶；EC2.3.2.13)。
适用的转谷氨酰胺酶的其它实例参见WO 96/06931(Novo NordiskA/S)的说明。
本发明上下文中优选的水解酶是羧酸酯水解酶(EC3.1.1.-)如脂肪酶(EC3.1.1.3)；植酸酶(EC3.1.3.-)，如3-植酸酶(EC3.1.3.8)和6-植酸酶(EC3.1.3.26)；糖苷酶(EC3.2，其属于此处所称的″糖酶″)，如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；肽酶(EC3.4，也称为蛋白酶)；及其它羰基水解酶。
本发明中，术语“糖酶”不仅用于指能够断裂具有尤其是5和6元环结构的糖链(如，淀粉)的酶(即糖苷酶，EC3.2)，而且还指能够使碳水化合物异构化的酶，例如将6元环结构如D-葡萄糖异构化为5元环结构如D-果糖。
适当的糖酶包括下列各项(括号中是EC编号)α-淀粉酶(3.2.1.1)，β-淀粉酶(3.2.1.2)，葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶(3.2.1.3)，纤维素酶(3.2.1.4)，内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)，内切-1，4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)，葡聚糖酶(3.2.1.11)，几丁质酶(3.2.1.14)，聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)，溶菌酶(3.2.1.17)，β-葡糖苷酶(3.2.1.21)，α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)，β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)，淀粉-1，6-葡糖苷酶(3.2.1.33)，木聚糖1，4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)，葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶(3.2.1.39)，α-糊精内切-1，6-α-葡糖苷酶(3.2.1.41)，蔗糖α-葡糖苷酶(3.2.1.48)，葡聚糖内切-1，3-α-葡糖苷酶(3.2.1.59)，葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶(3.2.1.74)，葡聚糖内切-1，6-β-葡糖苷酶(3.2.1.75)，阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)，乳糖酶(3.2.1.108)，脱乙酰壳多糖酶(3.2.1.132)和木糖异构酶(5.3.1.5)。
商品化的氧化还原酶(EC1.-.-.-)包括例如GLUZYMETM(来自NovoNordisk A/S)。商品化的蛋白酶(肽酶)的实例包括KANNASETM，EVERLASETM，ESPERASETMALCALASETM，NEUTRASETM，DURAZYMTM，SAVINASETM，PYRASETM，PANCREATIC TRYPSINNOVO(PTN)，BIO-FEEDTMPRO和CLEAR-LENSTMPRO(皆来自Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)。
其它商品化的蛋白酶包括MAXATASETM，MAXACALTM，MAXAPEMTM，OPTICLEANTM和PURAFECTTM(来自GenencorInternational Inc.或Gist-Brocades)。
商品化的脂肪酶的实例包括LIPOPRIMETM，LIPOLASETM，LIPOLASETMULTRA，LIPOZYMETM，PALATASETM，NOVOZYMTM435和LECITASETM(皆来自Novo Nordisk A/S)。
其它商品化的脂肪酶包括LUMAFASTTM(Genencor InternationalInc.的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)脂肪酶)；LIPOMAXTM(Gist Brocades/Genencor Int.Inc的类产碱假单胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)脂肪酶；以及Solvay Enzymes的芽孢杆菌属(Bacillus)脂肪酶。
商品化的糖酶的实例包括ALPHA-GALTM，BIO-FEEDTMALPHA，BIO-FEEDTMBETA，BIO-FEEDTMPLUS，BIO-FEEDTMPLUS，NOVOZYMETM188，CELLUCLASTTM，CELLUSOFTTM，CEREMYLTM，CITROZYMTM，DENIMAXTM，DEZYMETM，DEXTROZYMETM，FINIZYMTM，FUNGAMYLTM，GAMANASETM，GLUCANEXTM，LACTOZYMTM，MALTOGENASETM，PENTOPANTM，PECTINEXTM，PROMOZYMETM，PULPZYMETM，NOVAMYLTM，TERMAMYLTM，AMGTM(淀粉葡糖苷酶NOVO)，MALTOGENASETM，SWEETZYMETM和AQUAZYMTM(皆来自Novo Nordisk A/S)。其它糖酶可来自其它经销商。
结合在本发明颗粒中的酶量取决于颗粒的预定用途。对许多应用来说，酶含量应尽可能或可行地高。
本发明颗粒中的酶的含量(以纯的酶蛋白计算)一般占含酶颗粒重量的大约0.5％到50％。
辅助制粒剂本发明的颗粒尤其包含辅助制粒剂，目的是为了例如，帮助颗粒形成，调控颗粒的密度和体积，调控颗粒中活性化合物的含量，稳定活性化合物等。
辅助制粒剂可以包括但不限于a)填充剂如常规应用于制粒领域的填充剂，举例来说有水溶性的和/或不溶性的无机盐如磨得很细的碱金属的硫酸盐，碱金属的碳酸盐和/或碱金属的氯化物，粘土如高岭土(例如SPESWHITETM，英国的陶土)，膨润土，滑石，沸石，和/或硅酸盐。
b)粘合剂如常规应用于制粒领域的粘合剂，举例来说具有高熔点或完全无熔点的非蜡性质的粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮，糊精，聚乙烯醇，纤维素衍生物，例如羟丙基纤维素，甲基纤维素或CMC。适宜的粘合剂是糖粘合剂如可来自法国Roquette Freres的Glucidex 21D。
c)纤维材料如常规应用于制粒领域的纤维。纤维形式的纯或不纯的纤维素可以是锯屑、纯的纤维状纤维素、棉或其它形式的纯或不纯的纤维状纤维素。还可以使用基于纤维状纤维素的助滤剂。几种品牌的纤维状纤维素已投入市�。鏑EPO和ARBOCELL。在SvenskaTramjolsfabrikerna AB发表的“Cepo纤维素粉末(Cepo CellulosePowder)”一文指出对于Cepo S/20纤维素来说最大纤维长度大约是500μm，平均纤维长度是大约160μm，最大纤维宽度近似是50μm，平均纤维宽度近似是30μm。同样，还指出CEPO SS/200纤维素具有150μm的近似最大纤维长度，50μm的近似平均纤维长度，45μm的近似最大纤维宽度，以及25μm的近似平均纤维宽度。具有这些尺度的纤维素纤维非常适用于本发明的目的。单词″Cepo″和″Arbocel″是商标。优选的纤维状纤维素是ArbocelTMBFC200。此外可以使用如EP 304331 B1所述的合成纤维，并且典型的合成纤维可由聚乙烯，聚丙烯，聚酯，尤其是尼龙，聚甲酸乙烯酯，聚(甲基)丙烯酸化合物制成。
d)液态试剂如常规应用于制粒领域的液态试剂。液态试剂用于常规的混合制粒方法中使常规制粒成分的微粒增大或聚积形成颗粒。液态试剂是水和/或蜡样物质。在制粒过程中，液态试剂通常用于液相中，但稍后可以凝固；因此，如果有蜡样物质的话，既可以使其溶解或分散在水里，也可以使其融化。本文所用的术语“蜡样物质”是指具有所有下列特征的物质1)熔点位于30和100℃之间，尤其是位于40和60℃之间，2)此物质有韧性不易碎，以及3)此物质在室温下具有一定的可塑性。水和蜡样物质都可以作为液体试剂，即在颗粒的形成过程中二者都能起作用；蜡样物质作为一种组分留在成品颗粒中，而大部分水在干燥过程中被除去。蜡样物质的实例有聚二醇，脂肪醇，乙氧基化脂肪醇，高级脂肪酸的单，二和三甘油酯，例如单硬脂酸甘油酯，烷基芳基乙氧基化物和椰油单乙醇酰胺。
如使用高量的蜡样物质，则需加入相对少量的水，反之亦然。因此，液态试剂既可以是单独的水，单独的蜡样物也可以是水和蜡样物的混合物。如果使用水和蜡样物的混合物，水和蜡样物可以按照任意次序加入，例如先加水再加蜡样物，或先加蜡样物再加水或者形成蜡样物在水中的溶液或悬浮液。而且，使用水和蜡样物的混合物时，蜡样物在水中可以是可溶的或不可溶的(但是可分散的)。如果水用作液态试剂，水通常不会作为成品混合颗粒的一部分，因为大部分水会在随后的混合颗粒的干燥过程中被弄干。
e)酶稳定剂或保护剂如常规用于制粒领域的那些。稳定剂或保护剂可分成如下几类碱性或中性物质、还原剂、抗氧化剂和/或第一过渡系金属离子的盐。每一类都可以与同类或不同类的其它保护剂联合使用。碱性保护剂的实例有碱金属的硅酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐，它们通过活跃地中和如氧化剂提供化学清除作用。还原性保护剂的实例有亚硫酸盐、硫代亚硫酸盐或硫代硫酸盐，抗氧化剂的实例有甲硫氨酸、丁化羟基甲苯(BHT)、丁化羟基苯甲醚(BHA)。最优选的试剂是硫代硫酸盐，如硫代硫酸钠。酶稳定剂还可以是硼酸盐、硼砂、甲酸盐、二元和三元羧酸以及可逆的酶抑制剂如含有巯基基团的有机化合物或烷基化的或芳基化的硼酸。
f)交联剂如常规用于制粒领域的那些。交联剂可以是酶-相容性的表面活性剂，例如乙氧基化醇，尤其是带有10到80个乙氧基基团的乙氧基化醇。
此外，可以将悬浮剂、介质(用于在如洗涤应用中提高微粒溶解后的漂白作用的介质或酶的介质)和/或溶剂掺入作为辅助制粒剂。
包衣剂包衣包含一种或多种常规的如WO 89/08694，WO 89/08695，EP 270608 B1和/或WO 00/01793中记载的包衣剂成分。包衣剂的其它实例可在US4,106,991，EP 170360，EP 304332，EP 304331，EP 458849，EP 458845，WO 97/39116，WO 92/12645A，WO 89/08695，WO 89/08694，WO 87/07292，WO 91/06638，WO 92/13030，WO 93/07260，WO 93/07263，WO 96/38527，WO 96/16151，WO97/23606，US5,324,649，US4,689,297，EP 206417，EP 193829，DE 4344215，DE 4322229 A，DD 263790，JP 61162185 A和/或JP 58179492中找到。尤其是，WO 00/01793中记载的含盐包衣可以用于本发明的包衣。
包衣剂可选自上文列出的辅助制粒剂。其它包衣剂可选自如下非限制性列出物聚合物，氯清除剂、增塑剂、色素、润滑剂(如表面活性剂或抗静电剂)和芳香剂。
适用于包衣层中的聚合物包括乙烯聚合物或乙烯共聚物如聚乙烯醇(PVA)和/或聚乙烯吡咯烷酮或二者的衍生物。还包括间苯二甲酸聚合物。
本发明上下文中，适用于包衣层中的增塑剂包括，例如多羟基化合物如糖、糖醇、或分子量低于1000的聚乙二醇(PEG)；尿素，邻苯二甲酸酯如邻苯二甲酸的二丁酯或二甲酯；和水。
适宜的色素包括，但不限于，细碎的增白剂，如二氧化钛和高岭土，有色色素，水溶性着色剂，以及一种或多种色素和水溶性着色剂的组合。
如本文中所用，术语“润滑剂”是指任何能够减少表面摩擦、润滑颗粒表面、减少静电增加的倾向、和/或减少颗粒的脆性的试剂。润滑剂也可以通过减少包衣中粘合剂的粘性，在加包衣方法的改进中起到相关作用。因此，润滑剂可以用作抗凝聚剂和润湿剂。适宜的润滑剂的实例有聚乙二醇(PEGs)和乙氧基化脂肪醇。
在主要着眼于用于去污剂制剂的颗粒的实施方案中，可以将不同的“功能”组分如TAED，CMC，漂白剂，OBA，表面活性剂，香料以及其它本领域技术人员已知的用于去污剂制剂中的功能组分添加到包衣中。包衣还可以任选地包含为它们在制药业，农业，食品业，焙烤业，添加剂工业，饲料业，去污剂工业或其它能够使用含生物活性化合物颗粒的行业中的专门用途而选择的功能组分。
在一个本发明的特定实施方案中，本发明的颗粒被具有至少81％高恒定湿度的保护性包衣包封，说明参见并入此处作为参考的WO 89/08694。因此，在某些实施方案中，包衣可以充当水分和/或漂白剂的屏障以稳定核心中的生物活性化合物。此外，在另一些实施方案中，包衣部份在如配制和压片等机械加工过程中充当机械屏障。在一些实施方案中，包衣部份无论在结构意义上还是就活性化合物的生物活性来说具有足够的可压缩性和柔韧性从而使核心能经受压片加工。这一点潜在地最适用于去污剂制剂。
在一个特定实施方案中，包衣剂能够吸收来自激发光源的光和/或颗粒中荧光标记发射出的光，因此当颗粒表面的一个区域被此包衣剂包封时，从此区域检测到的发射光就会减少。
荧光标记包含在本发明颗粒组合物中的荧光标记可以是任一种受到照射后可发出荧光的化合物。荧光标记尤其可以是有机化合物并且在受到电磁波谱的X-射线、紫外线和/或可见区域的光(例如波长在10-700nm之间的光，更优选紫外区域，即10-380nm的光)照射时可以发出荧光。
此外，包含在本发明颗粒组合物中的荧光标记经过激发能够发射出位于电磁波频谱的紫外、可见和/或近红外区域中的光，即适宜地185-2600nm的光。
荧光标记可以属于生物活性化合物、辅助制粒剂和包衣剂的组群，或者荧光标记可以是仅为进行本发明的荧光分析而添加到颗粒组合物中的化合物。然而，从节省费用来看，优选荧光标记是生物活性化合物自身或是辅助制粒剂。
根据待由荧光分析评价的颗粒组合物的性质，举例来说如尘粒的性质或包衣厚度，可选择不同的荧光标记。对于尘粒性质的鉴定，例如更适于选择生物活性化合物作为荧光标记，因为评定颗粒组合物的尘粒中潜在有害活性化合物的量是必需的；而对于包衣厚度的评定，可以选择合适的辅助制粒剂作为荧光标记。
当生物活性化合物是荧光标记，尤其是荧光发射是由芳族氨基酸如酪氨酸和色氨酸引起的蛋白质和/或肽类荧光标记的情况下，在荧光分析中优选利用发紫外光(UV-光)的光源，尤其是发出的大部分光(UV-光)的波长位于10-380nm，更优选位于200-400um或200-300nm，最优选位于260-280nm的光源对颗粒组合物进行照射。在此种情况下，也优选仅检测在200-700nm范围，如400-700nm或300-400nm的发射光，尤其是280-360nm或325-375nm的光。在此种情况下，还需要选择能够检测具有这些波长的发射光的检测器，如CCD照相机。
如果荧光标记是辅助制粒剂之一，在荧光分析中，优选利用发出的光的波长位于350-550nm，更优选位于375-425nm之间的光源对颗粒组合物进行照射。同样此种情况下，也需要选择能够对具有这些波长的发射光进行检测的检测器，如CCD照相机。在制粒过程中，还可以添加仅用于荧光分析的荧光标记。大量的适宜荧光化合物可以例如从美国分子探针机构(Molecular Probes，USA)获得。
制�：桶鹿讨械挠夥治霰痉⒚骰拱ㄔ谥屏Ｉ璞钢欣蒙鲜鲇夥治龇椒ㄔげ饪帕Ｗ楹衔锏男灾什⒖刂坪透纳浦票阜椒ǎ票负锘钚曰衔锖腿窝〉馗ㄖ屏＜恋目帕Ｗ楹衔锏姆椒�。因此，本发明提供用于在制粒设备中制备含生物活性化合物和任选地辅助制粒剂的颗粒组合物的方法，所述方法包括步骤颗粒在制粒机中形成的时候，对包含在如上所述颗粒组合物中的荧光标记进行荧光分析。
在一个特定实施方案中，荧光分析是在制粒过程中在颗粒形成的期间进行的，优选地在线进行，这意味着以适当的重复速率在制粒过程中实时地进行一次以上的荧光分析。重复速率尤其取决于对来自检测器的数据进行的数据处理。在利用CCD或ICCD照相机的特定实施方案中，在制粒过程中以二维图像的形式每秒记录下来大约15个发射光测量值。术语“颗粒的形成”也包括了用包衣层包被颗粒。在此实施方案中，此方法尤其还可以包括步骤根据荧光分析的结果改变至少一个方法参数。待改变的方法参数可以是影响制粒过程和/或成型颗粒性质的任意参数。这些参数可以是制粒机中制粒材料，即生物活性化合物和/或辅助制粒剂和/或包衣剂的供给，制粒机中气体的供体，制粒机中的温度，制粒中的压力，制粒机中的pH以及施加给制粒材料的机械力。方法参数可以通过手动或自动化系统进行改变，参见，制粒设备。
在另一个实施方案中，本发明的荧光分析还适用于控制制粒之后成品颗粒组合物的尘化性质。因此，本发明还提供对含生物活性化合物的颗粒组合物中的活性粉尘进行荧光分析的方法。利用此种方法，可以将不满足有关尘粒的质量要求的颗粒组合物丢弃或进行再加工。
在另一个实施方案中，本发明的荧光分析也适用于调控制粒之后成品颗粒组合物的包衣的厚度和/或均质性。因此，本发明还提供对含生物活性化合物的包衣颗粒组合物中的包衣的厚度进行荧光分析的方法。用此种方法，可以将不满足有关包衣厚度的质量要求的颗粒组合物丢弃或进行再加工。
成像系统可以，如所述，用于品质参数如活性粉尘值或包衣厚度的评定。在一个实施方案中在例如包衣过程中进行在线评定。可通过记录(尤其通过摄像的方法)受到激发光源照射的颗粒的发射光图像，并将记录图像与品质参数值已知的样品(参照样品)的记录图像进行比较，以完成评定。参照样品的荧光图像和相应的品质参数可用于提供一个标准模型，如偏最小二乘方模型(PLS)或任何其它适用于构建图像数据的标准模型的建模系统。这样可利用模型从未知样品的荧光图像预测出品质参数的估算值。
因此，本发明还包括对含有纯化的生物活性化合物的颗粒组合物的品质参数进行估算的方法，步骤包括a)提供一个标准模型，方式是利用能够对含在颗粒组合物中的荧光标记进行荧光激发的光照射品质参数已知的含有纯化生物活性化合物的颗粒组合物，记录品质已知的颗粒组合物的一个或多个发射光图像并优选以偏最小二乘方数据处理形式对记录图像进行数据处理以产生一个标准模型，b)利用能够对含在颗粒组合物中的荧光标记进行荧光激发的光照射未知的含有纯化生物活性化合物的颗粒组合物，记录未知的颗粒组合物的至少一个发射光图像，c)将未知颗粒组合物的至少一个图像与标准模型进行比较并d)估算出未知颗粒组合物的品质参数。
制粒设备含有根据本发明对颗粒组合物进行荧光分析的手段的制�：�/或包衣设备同样也包括在本发明范围内。因此，本发明提供制粒或包衣设备，其包括(a)包含至少一个用于将材料加工成颗粒或包衣颗粒的加工室的制粒或包衣装置，(b)用于进行荧光分析的光学装置，其包括用于照射被加工材料的光源，至少一个能检测被加工材料的发射光的检测器，将照射光投射到部份被加工材料上的装置，将被照射材料的发射光投射到检测器的装置以及至少一个滤光装置。
制粒或包衣装置可以是任何常规制粒装置，尤其是此装置可以选自流化床制粒机或包衣机，高剪切力混合制粒机，喷雾干燥机，喷雾冷却机和压出机。
在光学装置中，光源尤其可以是普通的辉光灯、较专业的氙灯或频闪灯，优选能够发出波长10-700nm的光，更优选紫外区域，即10-380nm的光。
光学装置中，检测器尤其可以是摄像型检测器，更优选行扫描照相机、CCD或ICCD照相机。
光学装置可任选地包括聚焦发射光的装置，如透镜。
用于将照射光投射到被加工材料上的装置和将所述材料的发射光投射到检测器的装置包括一个或多个光导纤维，反射镜，透镜，分束器等。
光学装置包括至少一个用于过滤照射光和/或发射光的过滤装置。在一个特定的实施方案中，此装置是带通滤波器或光栅单色仪。在一个实施方案中，放置一个或多个滤光装置，以便仅对发射光进行过滤而且使发射光必须通过滤光器才能到达检测器。在另一个实施方案中，放置至少两个滤光装置，以便对照射光和发射光都进行过滤。最优选的是那些能够选择上文针对特定荧光标记时所述及的波长(见上文)的滤光器。如果使用两个检测器则光学装置还包括至少一个分束器如分色镜。
在一个最优选的实施方案中，光学装置包括一个频闪光源，两个CCD摄像检测器，一个用于过滤照射光的带通滤波器，两个用于过滤发射光的带通滤波器，透镜和两个分色镜分束器，如附图1所示。
在一个特定实施方案中，投射装置包括用于使照射光通过加工室的开孔投射到加工室内部份被加工的材料上的装置和用于将加工室内材料的发射光投射到检测器的装置。
在更优选的实施方案中，制粒设备还包括用于提供来自加工室的材料的清除流的装置。在此情况下光学装置被放置在可以对清除流中的材料进行荧光分析，而不是对加工室中的材料进行分析的位置上。优选此实施方案的一个原因是制粒过程通常涉及到制粒设备相当大程度的磨损。当粒化一种生物活性化合物如酶时，一些辅助制粒剂可能是粘土或其它无机物。这些物质对制粒设备具有明显的磨损作用。因此，在例如混合制粒机中进行制粒时，通常每年都可以观察到制粒设备内部部件表面铺满了几毫米的钢砂。这样的磨损度可能对光学装置的敏感器件是非常有害的。清除流中的颗�？梢允室说亟性傺范艺庋夥治霾换岣扇胖屏９�。清除流可适宜地引导颗粒通过清除流的透光部分(即光可以投射于此处)。例如，清除流可通过传送系统从制粒室被传送到光学装置，其中所述传送系统可以包括例如选自斜槽，泵，管道，传送带，旋流器等的一个或多个器件。可以将荧光分析适宜地放置在传送系统中的某一个位点上，在此位点粒化产品可被照射光激发，并且发射光可从此位点到达检测器。例如，此位点可以是例如这样的位点，在此处部分管道材料被更换为透明材料，如玻璃、石英或聚合材料。尤其是，在进行荧光分析的位置处，提供清除流的手段包括用于形成单层颗粒的手段，这样就不会或几乎不会出现因检测时颗粒的彼此重叠而导致的检测重叠。这可通过将成粒产品加载到一个倾斜(非水平)的振荡表面(如振荡斜槽)上来实现，其中对此表面的面积、颗粒加载的速率以及颗粒经振荡表面(倾斜角度)的传送速率进行调节以使振荡表面的面积总是大于存在于该表面上的颗粒的面积。这样颗粒经过表面传送就会基本上形成一个颗粒单层。荧光分析可以在此颗粒单层的任意位点进行。优选当颗粒从振荡表面的一个或多个边缘落下(像瀑布一样)时，颗粒还可以以一个单层离开振荡表面，而且为了避免振荡表面的反射，荧光分析优选在颗粒离开振荡表面后的某一点上进行，在此点上颗粒仍然保持为一个单层。由于测定是在形成单层的颗粒上进行的，因此可避免重叠，并且由于颗粒的分布主要仅为二维分布，故颗粒的发射光可以更精确地聚焦。这样，可利用二维检测器如CCD照相机获得通过此荧光分析位点的几乎所有单个颗粒的锐聚焦图像。
如上所述，光学装置适宜与制粒或包衣装置连接，以便能够在线(on-line)或串联(at-line)地对颗粒组合物进行荧光分析。在线(on-line)分析可以理解为对实际上正在进行粒化的颗粒进行分析，例如分析在制粒机或再循环的清除流中的颗粒。串联(At-line)分析可以理解为在制粒过程之后的下游(如在出口)进行分析或者对在制粒期间取自制粒机的非循环样品颗粒进行分析。
制粒设备可包括其它器件如用于处理来自检测器的数据的计算装置，其可任选地配备专业数据处理硬件和软件。制粒设备还可以包括与计算装置相连的控制装置用于根据荧光分析结果调控制粒方法。控制设备可以是PLC或其它设备，其能接受来自计算装置的数据并将这些数据转换成输出信号进而控制一个或多个硬件装置以影响制粒过程(如进料流、速度、温度、气流等)。
在下列实验中对实施本发明的方法进行例证。这些实验只是本发明一个实施方案的实施例，并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1对制备酶颗粒的原料的荧光分析在LS50B(Perkin Elmer)仪器上对用于制造酶颗粒的八种不同原材料和酶浓缩物进行荧光分析。以10nm为步长用230-500nm不同波长的内源光激发原材料，然后以1nm为步长记录波长270-700nm的材料发射光。LS50B(Perkin Elmer)仪器中用于激发和发射的狭缝间距均是4nm。按照仪器设计的要求通过照射置于石英容器(杯)中的原材料，然后在与照射光方向成22.5度的角度测定原材料发射的荧光以实现荧光测定。
几种原材料显著地发出荧光但酶浓缩物在大约350nm具有独特的非常强的发射。
实施例2酶颗粒的荧光分析在LS50B(Perkin Elmer)仪器上对未包衣的酶颗粒以及加包衣的颗粒进行荧光分析测定。以10nm步长用230-500nm不同波长的内源光激发颗粒，然后以1nm步长记录波长270-700nm的材料发射光。在此PerkinElmer仪器中用于激发和发射的狭缝间距均为4nm。按照仪器设计的要求通过照射置于石英容器(杯)中的原材料，然后在与照射光方向成22.5度的角度测定原材料的荧光发射以进行荧光测定。
结果显示在相应于酶浓缩物的大约350nm出现发射峰。另一个强峰发生在450-500nm之间，这是由制粒助剂中的荧光化合物引起的。结果表明，检测颗粒中的酶存在可行性。
实施例3颗粒的在线荧光分析利用如附图1所示的光学装置对未包衣的酶颗粒以及加包衣的颗粒进行荧光分析测定。利用两个Donpisha″逐行摄像组件″XC-8500CE1/2″ITCCD 782(H)×582(V)型的照像检测器，在样品传入位点具有一个CCIR附加35mm透镜。光源是Oriel氙气闪光灯60000w/Oriel附件60008和Oriel电源68826。照射光利用带通滤波器进行滤光以产生一束波长450nm的光。发射光在到达照像机之前被分色镜分束器分裂成两束，每束都经带通滤波器进行滤光。一个滤光器(绿色滤光片)允许530nm光通过而另一个滤光器(红色滤光片)允许620nm光通过。
照射和发射光的检测是通过将酶颗粒加载进出口比例允许颗粒通过的漏斗中，并分析刚从漏斗出口离开漏斗的颗粒来进行的。
来自检测器的信号被传送给配备有来自国家仪器(NationalInstruments)的数据采集硬件(DAQ和SCB-68实验电路板)和图象处理软件(Labview 4.1.1IMAQ视频以及通用Labview)的计算装置(普通个人计算机)，以产生荧光颗粒通过照射光束时的瞬时数字图像。
这些测量产生一系列图像，被记录后其能够像电影一样重放。未包衣的颗粒发出明亮的荧光并且颗粒的形式和形状被清晰地描绘出来，这证明在制备酶颗粒过程中利用荧光分析具有可行性。对于包衣颗粒，荧光明显减弱，表明包衣层降低了荧光标记的可接近性。因此记录的较暗的区域指示颗粒具有较厚的包衣，这证明了制备包衣颗粒时利用荧光分析具有可行性。
实施例4荧光分析具有各种酶浓缩物的酶颗粒此实验的实施是为了评价生物活性物质是否也可以作为荧光标记。在Lodge混合器中制成四批不同含量的纯化蛋白酶浓缩物。蛋白酶的含量分别是0(参照)、1、4和12 KPNU，其中KPNU是相对于标准蛋白酶测定的NOVO蛋白酶千单位的缩写，并且所述测定的基础是标准条件，即50℃，pH8.3，9分钟反应时间，3分钟测定时间下，蛋白水解酶对二甲基酪蛋白(DMC)溶液进行的消化。样品用Oriel氙气闪光灯60000w/Oriel附件60008和Oriel电源68826进行激发。利用带通滤波器对照射光进行滤过以产生300-400nm区的光束。利用JAI(M-90)的3-CCD照相机对发射光进行检测。此照相机配有一个Computar55远心镜头。来自检测器的信号被传送给配备有IFC51帧接受器和Image-Pro.Plus 4.5版的计算装置(普通个人计算机)。
记录的颗粒荧光图像从视觉上显示出随着纯化蛋白酶浓度增加，发射光平均强度也显著增加。
随后利用含有高岭土和二氧化钛的标准PEG-包衣(PEG4000)包被此四批颗粒。记录的包衣颗粒的荧光图像从视觉上显示出随着纯化蛋白酶浓度增加，发射光平均强度也增加。
这表明生物活性物质，即此实验中的蛋白酶，也可以作为荧光标记。
实施例5荧光分析具有各种不同包衣厚度的酶颗粒此实验的实施是为了研究包衣厚度与发射光的强度之间是否具有相关性。利用含有高岭土和二氧化钛的标准PEG-包衣(PEG4000)包被一批标准的含酶颗粒。将包衣喷雾加到颗粒(Huttlin)上，当分别加上10％，25％和50％的包衣时从加工过程中抽取出样品。样品用Oriel氙气闪光灯60000w/Oriel附件60008和Oriel电源68826进行激发。利用带通滤波器对照射光进行滤过以产生300-400nm区域的光束。利用JAI(M-90)的3-CCD照相机对发射光进行检测。此照相机配有一个Computar55远心镜头。来自检测器的信号被传送给配备有IFC51帧接受器和Image-Pro.Plus4.5版的计算装置(普通个人计算机)。记录的包衣颗粒的荧光图像从视觉上显示出随包衣浓度增加(即对于加上的10％，25％和50％包衣)，发射光平均强度减弱。
这表明发射光的荧光强度可以用于预测包衣厚度。
实施例6荧光分析具有不同含量的酶活性尘粒的酶颗粒此实验的实施是为了研究荧光分析是否可用于估计尘粒的量。先前已知在包衣上有斑痕的具包衣的酶颗粒会出现酶活性粉尘的问题。对蛋白酶活性粉尘值为每克尘粒中蛋白质酶29ng到2420ng的八个样品进行荧光分析。样品用Oriel氙气闪光灯60000w/Oriel附件60008和Oriel电源68826进行激发。利用带通滤波器对照射光进行滤过以产生300-400nm区域的光束。利用JAI(M-90)的3-CCD照相机对发射光进行检测。此照相机配有一个Computar55远心镜头。检测器的信号被传送给配备有IFC51帧接受器和Imag-Pro Plus4.5版的计算装置(普通个人计算机)。样品被传送给距离大约10cm内的成像系统。记录的颗粒组合物的荧光图像从视觉上显示随蛋白酶活性粉尘值的增加，组合物的发射光的平均强度增强。
这表明荧光发射光的强度可以用于估计颗粒组合物中生物活性粉尘的量。
权利要求
1.一种荧光分析的方法，包括利用能够荧光激发包含在颗粒组合物中的荧光标记的光照射含纯化的生物活性化合物的颗粒组合物，检测荧光标记的发射光并预测颗粒组合物中受荧光激发的荧光标记的量。
2.如权利要求1所述的方法，其中颗粒组合物用能够产生波长位于10-380nm之间的紫外光的光源进行照射。
3.如权利要求2所述的方法，其中紫外光由1-10个不连续的单色波长组成。
4.如权利要求3所述的方法，其中紫外光由1个不连续的，优选位于260-280nm之间的单色波长组成。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述检测荧光标记的发射光由检测1-10个不连续的，优选位于185-2600nm之间的单色波长发射光组成。
6.如权利要求5所述的方法，其中荧光标记是生物活性化合物，并且所述检测荧光标记的发射光由检测一个不连续的，优选位于300-400nm之间的单色波长发射光组成。
7.如权利要求1所述的方法，其中检测是利用至少一个能够将发射光转换为电信号的检测器进行的。
8.如权利要求7所述的方法，其中检测是利用能够将发射光转换为数码二维图像的CCD或ICCD照相机来进行的。
9.如权利要求8所述的方法，其中检测是利用至少两个能够将发射光转换为数码二维图像的CCD或ICCD照相机来进行的。
10.如权利要求1所述的方法，其中预测是通过将所述颗粒组合物的发射光与具有已知量的荧光标记的颗粒组合物的发射光进行比较来实行的。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述预测以实时的方式进行。
12.如权利要求1所述的方法，其中生物活性化合物选自生物催化剂、治疗剂、除草剂、杀虫剂和杀真菌剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中生物活性化合物选自蛋白质和肽。
14.如权利要求13所述的方法，其中生物活性化合物是一种酶，尤其选自水解酶和氧化还原酶。
15.如权利要求1所述的方法，其中颗粒组合物还包含辅助制粒剂。
16.如权利要求15所述的方法，其中辅助制粒剂选自纤维材料、粘合剂、填充剂、液态试剂、酶稳定剂、悬浮剂、交联剂、介质和/或溶剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中荧光标记是一种辅助制粒剂，并且对荧光标记的发射光的检测由检测1个不连续的，优选位于350-500nm之间的单色波长发射光组成。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒包含核心，在该核心中生物活性化合物与辅助制粒剂紧密混合。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒包含核心颗粒，在该核心颗粒上包被有一层含有生物活性化合物和优选地辅助制粒剂的包衣。
20.如权利要求1所述的方法，其中颗粒的平均大小为20-2000μm，优选为100-1000μm，更优选为200-800μm。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒用包衣剂加上包衣。
22.一种用于在制粒设备中制备含有纯化的生物活性化合物、荧光标记以及任选地辅助制粒剂的颗粒的方法，所述方法包括步骤对制粒机中形成的颗粒按权利要求1-21所述进行荧光标记的荧光分析。
23.如权利要求22所述的方法，其中荧光分析在制粒过程中在线并实时地进行，并且在制粒过程中重复一次以上。
24.如权利要求22所述的方法，其还包括步骤按照荧光分析的结果对至少一个方法参数进行改变。
25.如权利要求24所述的方法，其中方法参数选自生物活性化合物的供给、辅助制粒剂的供给、包衣剂的供给、气体的供给、温度、压力、pH以及施加给制粒材料的机械力。
26.如权利要求22-25所述的方法，其特征还在于其是包衣方法，其中含有生物活性化合物和任选地辅助制粒剂的颗粒用包衣剂进行包被，并且所述参数是制粒设备中的包衣剂供给。
27.如权利要求22所述的方法，其中荧光分析是在制粒过程之后串联和实时地进行的，并且被重复一次以上。
28.制粒或包衣设备，其包括(a)包含至少一个用于将材料加工成颗粒或包衣颗粒的加工室的制粒或包衣装置，(b)用于进行荧光分析的光学装置，包括用于照射被加工颗粒的光源，至少一个能检测被加工颗粒的发射光的检测器，将照射光投射到部分被加工颗粒上的装置，将被照射颗粒的发射光投射到检测器的装置以及至少一个滤光装置。
29.如权利要求28所述的设备，其中制粒或包衣设备选自流化床制粒机或包衣机、高剪切力混合制粒机、喷雾干燥机、喷雾冷却机、压出机。
30.如权利要求28所述的设备，其中光源选自辉光灯、氙灯或频闪灯，优选能够发出波长10-700nm的光的光源。
32.如权利要求28所述的设备，其中检测器是照像机，优选选自行扫描照像机、CCD或ICCD照相机。
33.如权利要求28所述的设备，其中用于将照射光投射到被加工颗粒上及将所述颗粒的发射光投射到检测器的装置选自一个或多个光导纤维、反射镜、透镜和分束器。
34.如权利要求28所述的设备，其中放置滤光装置，以便仅过滤发射光以及使发射光必须通过滤光器才能到达检测器。
35.如权利要求34所述的设备，其中放置至少两个滤光装置，以便对照射光和发射光都进行滤过。
36.如权利要求28所述的设备，其中光学装置包括一个频闪光源、两个CCD摄像检测器、一个用于过滤照射光的带通滤波器、两个用于过滤发射光的带通滤波器、一个透镜和两个分色镜分束器。
37.如权利要求28所述的设备，其中所述部分被加工颗粒存在于加工室中。
38.如权利要求28所述的设备，其还包括用于提供来自加工室的颗粒的清除流的装置，其中光学装置放置在可以对清除流中的颗粒进行荧光分析的位置。
39.如权利要求38所述的设备，其中用于提供清除流的装置包括用于形成单层颗粒的装置。
40.如权利要求39所述的设备，其中用于形成单层颗粒的装置包含一个倾斜的振动表面。
41.如权利要求40所述的设备，其中光学装置的放置位置使得可以对自振荡表面的一个或多个边缘落下后的单层颗粒进行荧光分析。
42.如权利要求28所述的设备，其还包括一个或多个选自计算装置和控制装置的器件。
43.荧光分析在含有纯化的生物活性化合物的颗粒上的应用。
44.如权利要求1所述的方法，其包括以下步骤a)提供一个标准模型，方式是利用能够对含在颗粒组合物中的荧光标记进行荧光激发的光照射品质参数已知的含有纯化生物活性化合物的颗粒组合物，记录品质已知的颗粒组合物的一个或多个发射光图像并优选以偏最小二乘方数据处理形式对记录图像进行数据处理以产生标准模型，b)利用能够对含在颗粒组合物中的荧光标记进行荧光激发的光照射未知的含有纯化生物活性化合物的颗粒组合物，记录未知的颗粒组合物的至少一个发射光图像，c)将未知颗粒组合物的至少一个图像与标准模型进行比较并d)估算出未知颗粒组合物的品质参数。
全文摘要
本发明涉及一种用于荧光分析的方法，包括利用能够对包含在颗粒组合物中的荧光标记进行荧光激发的光照射含有纯化的生物活性化合物的颗粒组合物，检测荧光标记的发射光并预测受荧光激发的颗粒组合物中荧光标记的量。
文档编号G01N21/85GK1613013SQ02804426
公开日2005年5月4日 申请日期2002年1月31日 优先权日2001年1月31日
发明者P·P·莫滕森 申请人:诺和酶股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
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