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快速鉴别乌天麻的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及中药材鉴别与品质评价【技术领域】，具体来说是一种快速鉴别乌天麻的方法及其应用，鉴别步骤包括(1)乌天麻样品处理；(2)乌天麻标准待测溶液的制备；(3)乌天麻生化指纹图谱的测定；(4)其它品种天麻生化指纹图谱的测定和(5)生化指纹图谱对比步骤；本发明操作非常简单，可从众多天麻品种中快速鉴别出乌天麻，相比较其他鉴别方法具有更高的灵敏性，解决了其他鉴别方法不能鉴别单一品种的技术缺陷，而且本发明方法所用试剂非常少，且试剂无毒。
【专利说明】快速鉴别乌天麻的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药材鉴别与品质评价【技术领域】，具体来说是一种快速鉴别乌天麻的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]天麻是古今医家常用的名贵中药，其入药已有2000多年历史，在东汉时期的“神农本草经”一书中就被列为上品。现在我国公布的34种名贵药材中，天麻已被列入《濒危动植物种国际贸易公约CITES》附录药用植物。从目前研究的情况来看，天麻中的主要成分天麻素，具有镇静、安神、促进受损脑组织恢复、缓解神经性头痛等作用，对于治疗高血压病、脑血栓、脑动脉硬化引起的头晕、头胀、头痛、目眩、肢体麻木以及心脑血管疾病引起的偏瘫等疗效明显。
[0003]天麻Gastrodia elsta B1.属于兰科(Orchidaceae)天麻属，多年生共生草本植物，别名赤箭、离母、离草、定风草、鬼督邮等。分布于热带、亚热带、温带及寒温带的山地。东起新西兰、新喀里多尼亚岛、西至马达加斯加。南由澳大利亚、新西兰北抵中国的东北、前苏联远东地区。全世界约有20多种，我国已报道发现6个种，即天麻、原天麻、细天麻、南天麻、疣天麻和北插天天麻。其中，物种还包括6个变型和2个杂交种:乌天麻、绿天麻、黄天麻、黄天麻、毛天麻、卵果天麻、乌红杂交天麻和红乌交杂天麻。根据中华人民共和国国家标准GB19776-2005的要求，乌天麻只有简单的感官指标(包括形状、颜色、气味等)、理化指标(包括天麻素含量、水分、灰分、酸不溶性灰分等)和卫生指标(包括农药残留、重金属和二氧化硫、亚硝酸盐含量等)，用这些指标我们根本无法判断出天麻之间的差异。
[0004]CN200710035693.8 一种天麻药材的鉴别方法，主要用于辨别天麻和天麻伪品，存在繁琐、耗时、费用高，应用的有机试剂多；CN201010106834.2天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术及其应用都是利用高效液相法建立天麻的化学或生化指纹图谱，设备要求高，鉴定技术流程和图谱结果分析复杂，给实践生产应用中带来不便，此外还存在有害试剂多的缺点。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种快速鉴别乌天麻的方法及其应用，该方法不但操作简单，而且可快速从各种品种的天麻样品中鉴别出乌天麻。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种快速鉴别乌天麻的方法，包括如下步骤:
[0007](I)乌天麻样品处理
[0008]①称取干天麻100g，研磨成粉过60目筛后，准确称取天麻样品0.05g ；
[0009]②称取鲜天麻100g，磨碎成浆后，准确称取天麻样品0.15g ；
[0010](2)乌天麻标准待测溶液的制备
[0011]在步骤I中称取的样品中加ImL纯净水，用超声提取20min后得到提取液，将提取液倒入离心管中后置于高速冷冻离心机中离心，转速为8800r/min，温度为4°C，时间5min，取离心后的上清液用0.45 μ m的微孔滤膜过滤，得到乌天麻标准待测过滤液；
[0012](3)乌天麻生化指纹图谱的测定
[0013]采用毛细管电泳仪将步骤2中得到的待测过滤液进行毛细管电泳，测定条件为:电压20KV ;重力进样IOcm高、40s ;检测波长230nm ;温度为室温，75 μ m未涂层弹性石英毛细管柱，得到乌天麻生化指纹图谱，并将测定的乌天麻生化指纹图谱中出现的面积大的4个峰顺序编号；
[0014](4)其它品种天麻生化指纹图谱的测定
[0015]按⑴~(3)步骤的方法,测定红天麻、绿天麻、黄天麻和乌红天麻生化指纹图谱，并将测定的每个天麻品种的生化指纹图谱中出现的面积大的4个峰顺序编号； [0016](5)生化指纹图谱对比
[0017]将每个天麻品种第4号峰面积与第I号峰面积进行相除得到面积比值，当比值为0.90 <比值≤I时，所测样品即为乌天麻，当比值为0.1≤比值≤0.9时，则为其他品种天麻;
[0018]在进行不同天麻品种生化指纹图谱测定时，每个天麻品种都会出现4个面积相对较大的峰，将每个天麻品种的第4号峰与第I号峰的面积，测算后利用第4号峰的面积比第I号峰的面积，当比值为0.90 <比值≤I时，所测样品即为乌天麻，当比值为0.1 (比值^ 0.9时，则为其他品种天麻。
[0019]本发明的另一目的是提供一种用于快速鉴别乌天麻的缓冲液，它是由磷酸二氢钠38.0g、磷酸氢二钠5.04g和蒸懼水1000mL配置而成。
[0020]电泳时,将缓冲液稀释5倍体积,利用0.45um滤膜过滤后使用。
[0021]与现有天麻的鉴别方法相比，本发明的有益技术效果是:本发明操作非常简单，可从众多天麻品种中快速鉴别出乌天麻，相比较其他鉴别方法具有更高的灵敏性，解决了其他鉴别方法不能鉴别单一品种的技术缺陷，而且本发明方法所用试剂非常少，且试剂无毒。
【专利附图】

【附图说明】
[0022]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1是本发明实施实例I中乌天麻生化指纹图谱；
[0024]图2是本发明实施实例2中绿天麻生化指纹图谱；
[0025]图3是本发明实施实例3中红天麻生化指纹图谱；
[0026]图4是本发明实施实例4中黄天麻生化指纹图谱；
[0027]图5是本发明实施实例5中乌红天麻生化指纹图谱。
【具体实施方式】
[0028]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029]实施实例I
[0030]一种快速鉴别乌天麻的方法，包括如下步骤:
[0031](I)乌天麻样品处理
[0032]①称取干天麻100g，研磨成粉过60目筛后，准确称取天麻样品0.05g ；
[0033]②称取鲜天麻100g，磨碎成浆后，准确称取天麻样品0.15g ；
[0034](2)乌天麻标准待测溶液的制备
[0035]在步骤I中称取的样品中加lmL，用超声提取20min后得到提取液，将提取液倒入离心管中后置于高速冷冻离心机中离心，转速为8800r/min，温度为4°C，时间5min，取离心后的上清液用0.45 μ m的微孔滤膜过滤，得到乌天麻标准待测过滤液；
[0036](3)乌天麻生化指纹图谱的测定
[0037]采用毛细管电泳仪将步骤2中得到的待测过滤液进行毛细管电泳，CL1020毛细管电泳仪(北京彩陆)；紫外检测器，未涂层弹性石英毛细管柱75 μ m IDX37/45cm(分离长度/总长，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；电泳条件:电压20KV ;重力进样IOcm高、40s ;检测波长230nm ;温度为室温；磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠38.0g,与磷酸氢二钠
5.04g，加水使成IOOOmL,稀释5倍，0.45 μ m滤膜过滤后使用)，实验前依次用0.1mol.L-1氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗10,10，20min，样品分析间隔依次用0.1mol.I71氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗3，2，3min，实验结束后用0.1mol.L—1氢氧化钠溶液、水冲洗lOmin，所用溶液使用前均用0.45 μ m的滤膜过滤，超声脱气3min，得到乌天麻生化指纹图谱，图谱中出现四个面积较大的峰(如图1所示)，将测定的乌天麻图谱中出现的面积较大的4个峰顺序编号为1、2、3、4，并用第4号峰面积比第I号峰面积；结果见附图1，经测算后第4号峰与第I号峰的面积比值为0.98。
[0038]实施实例2
[0039]一种快速鉴别乌天麻的方法，包括如下步骤:
[0040](I)绿天麻样品处理
[0041]①称取干天麻100g，研磨成粉过60目筛后，准确称取天麻样品0.05g ；
[0042]②称取鲜天麻100g，磨碎成浆后，准确称取天麻样品0.15g ；
[0043](2)绿天麻标准待测溶液的制备
[0044]在步骤I中称取的样品中加ImL纯净水，用超声提取20min后得到提取液，将提取液倒入离心管中后置于高速冷冻离心机中离心，转速为8800r/min，温度为4°C，时间5min，取离心后的上清液用0.45 μ m的微孔滤膜过滤，得到绿天麻标准待测过滤液；
[0045](3)绿天麻生化指纹图谱的测定
[0046]采用毛细管电泳仪将步骤2中得到的待测过滤液进行毛细管电泳，CL1020毛细管电泳仪(北京彩陆)；紫外检测器，未涂层弹性石英毛细管柱75 μ m IDX37/45cm(分离长度/总长，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；电泳条件:电压20KV ;重力进样IOcm高、40s ;检测波长230nm ;温度为室温；磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠38.0g,与磷酸氢二钠
5.04g，加水使成IOOOmL,稀释5倍，0.45 μ m滤膜过滤后使用)，实验前依次用0.1mol.L-1氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗10,10，20min，样品分析间隔依次用0.1mol.I71氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗3，2，3min，实验结束后用0.1mol.L—1氢氧化钠溶液、水冲洗lOmin，所用溶液使用前均用0.45 μ m的滤膜过滤，超声脱气3min，得到绿天麻生化指纹图谱，图谱中出现四个面积较大的峰(如图2所示)，将测定的绿天麻图谱中出现的面积较大的4个峰顺序编号为1、2、3、4，并用第4号峰面积比第I号峰面积；结果见附图2，经测算后第4号峰与第I号峰的面积比值为0.37。
[0047]实施实例3
[0048]一种快速鉴别乌天麻的方法，包括如下步骤:
[0049](I)红天麻样品处理
[0050]①称取干天麻100g，研磨成粉过60目筛后，准确称取天麻样品0.05g ；
[0051]②称取鲜天麻100g，磨碎成浆后，准确称取天麻样品0.15g ；
[0052](2)红天麻标准待测溶液的制备
[0053]在步骤I中称取的样品中加ImL纯净水，用超声提取20min后得到提取液，将提取液倒入离心管中后置于高速冷冻离心机中离心，转速为8800r/min，温度为4°C，时间5min，取离心后的上清液用0.45 μ m的微孔滤膜过滤，得到红天麻标准待测过滤液；
[0054](3)红天麻生化指纹图谱的测定
[0055]采用毛细管电泳仪将步骤2中得到的待测过滤液进行毛细管电泳，CL1020毛细管电泳仪(北京彩陆)；紫外检测器，未涂层弹性石英毛细管柱75 μ m IDX37/45cm(分离长度/总长，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；电泳条件:电压20KV ;重力进样IOcm高、40s ;检测波长230nm ;温度为室温；磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠38.0g,与磷酸氢二钠5.04g，加水使成IOOOmL,稀释5倍，0.45 μ m滤膜过滤后使用)，实验前依次用0.1mol.L-1氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗10、10、20min，样品分析间隔依次用0.1mol.L—1氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗3、2、3min，实验结束后用0.1mol.L—1氢氧化钠溶液、水冲洗IOmin,所用溶液使用前均用0.45 μ m的滤膜滤过；超声脱气3min,得到红天麻生化指纹图谱，图谱中出现四个面积较大的峰(如图3所示)，将测定的红天麻图谱中出现的面积较大的4个峰顺序编号为1、2、3、4，并用第4号峰面积比第I号峰面积；结果见附图2，经测算后第4号峰与第I号峰的面积比值为0.52。
[0056]实施实例4
[0057]一种快速鉴别乌天麻的方法，包括如下步骤:
[0058](I)黄天麻样品处理
[0059]①称取干天麻100g，研磨成粉过60目筛后，准确称取天麻样品0.05g ；
[0060]②称取鲜天麻100g，磨碎成浆后，准确称取天麻样品0.15g ；
[0061](2)黄天麻标准待测溶液的制备
[0062]在步骤I中称取的样品中加ImL纯净水，用超声提取20min后得到提取液，将提取液倒入离心管中后置于高速冷冻离心机中离心，转速为8800r/min，温度为4°C，时间5min，取离心后的上清液用0.45 μ m的微孔滤膜过滤，得到黄天麻标准待测过滤液；
[0063](3)黄天麻生化指纹图谱的测定
[0064]采用毛细管电泳仪将步骤2中得到的待测过滤液进行毛细管电泳，CL1020毛细管电泳仪(北京彩陆)；紫外检测器，未涂层弹性石英毛细管柱75 μ m IDX37/45cm(分离长度/总长，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；电泳条件:电压20KV ;重力进样IOcm高、40s ;检测波长230nm ;温度为室温；磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠38.0g,与磷酸氢二钠5.04g，加水使成1000mL,稀释5倍，0.45 μ m滤膜过滤后使用)，实验前依次用0.1mol.L-1氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗10、10、20min，样品分析间隔依次用0.1mol.L—1氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗3、2、3min，实验结束后用0.1mol.L—1氢氧化钠溶液、水冲洗lOmin，所用溶液使用前均用0.45 μ m的滤膜滤过；超声脱气3min，得到黄天麻生化指纹图谱，图谱中出现四个面积较大的峰(如图4所示)，将测定的黄天麻图谱中出现的面积较大的4个峰顺序编号为1、2、3、4，并用第4号峰面积比第I号峰面积；结果见附图2，经测算后第4号峰与第I号峰的面积比值为0.77。
[0065]实施实例5
[0066]一种快速鉴别乌天麻的方法，包括如下步骤:
[0067](I)乌红天麻样品处理
[0068]①称取干天麻100g，研磨成粉过60目筛后，准确称取天麻样品0.05g ；
[0069]②称取鲜天麻100g，磨碎成浆后，准确称取天麻样品0.15g ；
[0070](2)乌红天麻标准待测溶液的制备
[0071]在步骤I中称取的样品中加ImL纯净水，用超声提取20min后得到提取液，将提取液倒入离心管中后置于高速冷冻离心机中离心，转速为8800r/min，温度为4°C，时间5min，取离心后的上清液用0.45 μ m的微孔滤膜过滤，得到乌红天麻标准待测过滤液；
[0072](3)乌红天麻生化指纹图谱的测定
[0073]采用毛细管电泳仪将步骤2中得到的待测过滤液进行毛细管电泳，CL1020毛细管电泳仪(北京彩陆)；紫外检测器，未涂层弹性石英毛细管柱75 μ m IDX37/45cm(分离长度/总长，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；电泳条件:电压20KV ;重力进样IOcm高、40s ;检测波长230nm ;温度为室温；磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠38.0g,与磷酸氢二钠
5.04g，加水使成1000mL,稀释5倍，0.45 μ m滤膜过滤后使用)，实验前依次用0.1mol.L-1氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗10、10、20min，样品分析间隔依次用0.1mol.L—1氢氧化钠溶液、水、缓冲液依次冲洗3、2、3min，实验结束后用0.1mol.L—1氢氧化钠溶液、水冲洗IOmin,所用溶液使用前均用0.45 μ m的滤膜滤过；超声脱气3min,得到乌红天麻生化指纹图谱，图谱中出现四个面积较大的峰(如图5所示)，将测定的乌红天麻图谱中出现的面积较大的4个峰顺序编号为1、2、3、4，并用第4号峰面积比第I号峰面积；结果见附图2，经测算后第4号峰与第I号峰的面积比值为0.15。
[0074]上述实施实例生化指纹图谱第4号峰面积与第I号峰面积比值如下表
[0075]
【权利要求】
1.一种快速鉴别乌天麻的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)乌天麻样品处理 ①称取干天麻100g，研磨成粉过60目筛后，准确称取天麻样品0.05g ； ②称取鲜天麻100g，磨碎成衆后，准确称取天麻样品0.15g ； (2)乌天麻标准待测溶液的制备 在步骤I中称取的样品中加ImL纯净水，用超声提取20min后得到提取液，将提取液倒入离心管中后置于高速冷冻离心机中离心，转速为8800r/min，温度为4°C，时间5min，取离心后的上清液用0.45 μ m的微孔滤膜过滤，得到乌天麻标准待测过滤液； (3)乌天麻生化指纹图谱的测定 采用毛细管电泳仪将步骤2中得到的待测过滤液进行毛细管电泳，测定条件为:电压20KV ;重力进样IOcm高、40s ;检测波长230nm ;温度为室温，75 μ m未涂层弹性石英毛细管柱，得到乌天麻生化指纹图谱，并将测定的乌天麻生化指纹图谱中出现的面积大的4个峰顺序编号； (4)其它品种天麻生化指纹图谱的测定 按(1)~(3)步骤的方法,测定红天麻、绿天麻、黄天麻和乌红天麻生化指纹图谱,并将测定的每个天麻品种的生化指纹图谱中出现的面积大的4个峰顺序编号； (5)生化指纹图谱对比 将每个天麻品种第4号峰面积与第I号峰面积进行相除得到面积比值，当比值为0.90<比值≤1时，所测样品即为乌天麻，当比值为0.1≤比值≤0.9时，则为其他品种天麻。
2.一种用于快速鉴别乌天麻的电泳缓冲液，其特征在于，它是由磷酸二氢钠38.0g、磷酸氢二钠5.04g和蒸懼水1000mL配置而成。
【文档编号】G01N27/447GK103954672SQ201410188457
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】祁岑, 罗家刚, 程立君, 王德菊, 黄先敏, 熊汝琴, 杨顺强 申请人:昭通学院