专利名称：赤羽病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明所属的领域为生物技术领域。
背景技术：
赤羽病是由布尼病毒属辛波病毒群的阿卡斑病毒(Akabane virus, AKV)引起的牛、绵 羊、山羊和其它多种野生动物的以流产、早产、死产、畸形产以及先天性关节弯曲一积水性 无脑综合征(AH综合征)为特征的病毒性传染病。此病给畜牧业造成巨大经济损失，是国际动 物贸易中检疫的重点疫病之一。AKV的基因组由三个负链RNA环状分子所组成，g卩大 RNA(LRNA)、中RNA(M RNA)、小RNA(SRNA)。 M RNA编码Gl和G2两种蛋白；L RNA 可能编码L蛋白，S RNA编码核衣壳(N)蛋白，N是核衣壳的大蛋白，为群的特异性抗原,赤 羽病于20世纪30年代在澳大利亚的牛、绵羊、山羊群中流行。1959年首次在日本群马县阿 卡斑村分离病毒。1972 1973年，在日本关东以西的牛群中发生原因不明的流产、早产、死 产以及先天性关节弯曲一积水性无脑综合征(AH综合征)。1973-1975年又出现两次同样的流 行，因发生异常产而损失犊牛5万头以上。同年在澳大利亚的流行，损失犊牛在数千头以上。 中村孝次等(1987拨现5家专门饲养绵羊农户的30头临产母羊中，21头发生了异常流产或死 产。2002年以色列一奶年场由AKV 0BE-1株引起54头奶牛流产。Horikita等2005年对11 个奶牛场感染过AKV的33头奶牛进行了研究，奶产量下14.9% 26.6%。澳大利亚在2004 年至2005年对7个州的血清学调査表明，牛群中的血清阳性率在6% 19.54%之间。曾对国 内一些奶牛场进行过血清学调査,抗体阳性率为12%。 AKAV可能广泛分布于热带和温带的广 大地区。AKV的血清学诊断方法有补体结合试验(CF)、间接免疫荧光(IF)、血凝抑制试验 (HI)、琼脂扩散试验(AGDP)、微量血清中和试验(VN)和ELISA。最常用的方法是VN 和ELISA,应用间接ELISA可快速和准确地进行血清群定群(SG-ELISA)和进行辛波(Simbu) 群中血清型定型(ST-ELISA)。已有报道用PCR和基因芯片方法进行病原检测。AKVN核蛋 白上存在抗原表位，具有群特异性，可刺激机体产生抗体，通过检测核蛋白抗体来诊断此病。 由于核衣壳蛋白是AKV与辛波群中的其他成员的共同的群抗原，而中和试验具有很高的特 异性，不出现交叉反应。因此,在确诊时ELISA试验和中和试验联合应用于此病血清抗体的检 测。研究并制备高特异性、可与相关病毒区别的快速检测方法仍是AKV检疫中急待解决的问题，按规范程序生产相应的标准化试剂盒是当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种用竞争酶联免疫吸附试验检测赤羽病抗体的试剂盒。 本发明的另一目的是提供这种试剂盒的制备方法。
本发明所述的赤羽病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒由以下组分分装后组成AKV抗原包 被ELISA板、羊抗鼠IgG-HRP酶结合物、单克隆抗体、阳性血清、阴性血清、20倍浓缩洗 漆液、IO倍浓縮稀释液、底物I、底物II、底物III、终止液，所述的羊抗鼠IgG-HRP酶结合 物为辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(IgG);所述的单克隆抗体为鼠抗赤羽病病毒 的特异性单克隆抗体(McAb);所述的20倍浓縮洗涤液为20倍浓缩的含0.05%Tween-20的 O.01mol/L pH7.4 PBS (PBST);所述的10倍浓縮稀释液为10倍浓缩的含1%明胶的PBST; 所述的底物I为pH6.0的乙酸一柠檬酸缓冲液；所述的底物II为3.3，一5.5，一四甲基联苯胺 (TMB)溶液；所述的底物III为双氧水(H202)溶液；所述的终止液为lmo1/ L H2S04硫酸 溶液。
本发明所述的赤羽病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒的制备方法由以下步骤组成
一、 赤羽病病毒ELISA包被抗原的制备BHK-21细胞长成单层后接种AKV，无血清 的基础培养基继续培养，3 4d后细胞病变达75%以上时，收获病毒，反复冻融3次，以 8000r/min离心30 min，取上清液，加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒。采用20%、 60%
(w/v)不连续蔗糖密度梯度20000r/min 4'C超速离心3h，收获提纯的病毒条带作为AKV抗 原；
二、 AKV抗原包被ELISA板的制备将纯化后的AKV抗原，用包被缓冲液稀释成4.0 Hg/mL，以50laL/孔包被ELISA板；以200pL/孔加入封闭液封闭，所述的封闭液为含1%BSA、 2%明胶、0.0P/o硫柳汞的0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS);
三、 羊抗鼠IgG-HRP酶结合物的制备利用常规方法从健康的BALB/c小鼠血清中提取 IgG,与等体积弗氏完全佐剂乳化，充分混匀后经背部皮下注射健康的18个月以上的山羊，2 mL/只；首免后第2周和第4周分别用相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂(FIA)进行二免和 三免后，无菌采血分离血清，分别经1次50%和2次33%饱和硫酸铵沉淀提纯羊抗鼠&0， 透析除盐；用改良的过碘酸氧化法将辣根过氧化物酶(HRP)标记于羊抗鼠IgG， lmL/管分 装，-80。C保存;四、 单克隆抗体的制备用提纯的赤羽病病毒抗原分别加等体积弗氏完全佐剂乳化和弗氏不完全佐剂乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇(MW4000)融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗AKV的阳性孔，获得能稳定传代并分泌抗AKV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，利用BALB/c小鼠制备抗赤羽病病毒单克隆抗体腹水；
五、 阳性血清的制备挑选体格健壮的18个月以上的山羊2 3只，将纯化后AKV与等体积弗氏完全佐剂乳化，充分混匀后经背部皮下注射，2mL/只；首免后第2周和第4周分别用AKV相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂(FIA)进行二免和三免后，无菌采血分离血清；用血清保存液配方I按1: 2稀释，lmL/管分装，-S(TC保存；
六、 阴性血清的制备选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血检测确认无赤羽病的抗体，无菌采血分离血清，用血清保存液配方I按1: 2稀释，lmL/管分装，-8(TC保存；
七、 2o倍浓縮洗涤液、io倍浓縮稀释液、底物i、底物n、底物m、终止液的优选-
通过试验选定20倍浓縮洗涤液为20倍浓縮的含0.05%Tween-20的O.01mol/L pH7.4 PBS(PBST); 10倍浓缩稀释液为10倍浓縮的含1%明胶的PBST;底物I为pH6.0的乙酸一柠檬酸缓冲液；底物II为3.3'—5.5' —四甲基联苯胺(TMB)溶液；底物III为双氧水(H202)溶液；终止液为lmol/LH2S04硫酸溶液；
八、 试剂盒的组装将按上述方法制备好的ELISA抗原包被板封闭于铝簿/簿锡纸中，内置2g硅胶干燥剂，封口，羊抗鼠IgG-HRP酶结合物、单克隆抗体、10倍浓缩稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液I、底物液II、底物液ffl、终止液、阳性血清、阴性血清定量分装，分别贴上标签与说明，装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。
本发明涉及一种用竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)检测赤羽病病毒抗体试剂盒，经实验数据表明，本发明的c-ELISA试剂盒特异性强，敏感性高，适用于赤羽病的快速诊断、检测、检疫和流行病学调査。
具体实施例方式
实施例
1、赤羽病病毒ELISA包被抗原的制备BHK-21细胞长成单层后接种AKV， 37'C反应lh。加入无血清的基础培养基继续培养，3 4d后细胞病变(CPE)达75%以上时，收获病毒。将收获的病毒液反复冻融3次，以8000r/min离心30 min,取上清液，加入终浓度为1 / 3000
的甲醛灭活病毒。以28000r/min 4'C超速离心3h。沉淀用1/100原体积的PBS溶解，然后采
6用20%、 60% (w/v)不连续蔗糖密度梯度20000r/min4'C超速离心3h，收获提纯的病毒条带作为抗原，用DU800核酸蛋白分析仪测定蛋白含量，-20'(:保存备用。
2、赤羽病病毒ELISA包被抗原安全性检定将纯化的病毒抗原用维持液作适当稀释(1:10 1:100)接种到已长成单层的BHK21细胞上，同时作正常细胞对照。37。C培养6d，接种细胞与正常细胞相同，无CPE出现；取培养液上清(包括正常细胞培养液上清)包被酶标板，用阳性血清进行检测，病毒培养液和正常细胞培养液显色情况一致，均为无色，表明作为包被抗原用的病毒已灭活彻底，不具感染性，ELISA包被抗原是安全的。
3、 抗赤羽病病毒单克隆抗体的制备首先进行赤羽病病毒的培养和纯化，用AKV病毒接种BHK-21细胞长成单层，收获的细胞培养病毒液反复冻融3次，以8000r/min离心30 min，取上清液，超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心，收获提纯的病毒条带，用核酸蛋白分析仪测定蛋白含量为2.85g/L， -20°。保存备用；用提纯的赤羽病病毒抗原分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50X聚乙二醇(MW4000)融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗AKV的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克�。浣覧LISA筛选阳性克�。竦媚芪榷ù⒎置诳笰KV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,*将获得的分泌抗AKV的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔制备单抗腹水；采集单克隆抗体腹水，测定抗体效价、蛋白含量和亲和力，腹水ELISA效价高达为l: 1024000，用核酸蛋白分析仪测定纯化腹水IgG的含量为1.56g/L。亲和力分常数高达6.12xl07mol/L。用间接ELISA方法鉴定制备的单克隆抗体仅与赤羽病病毒及其N蛋白有特异性免疫反应，而与其它相关病毒(如BTV、 EHDV、 VSV、 PPRV 、 BVDV等)没有任何免疫反应。
4、 羊抗鼠IgG-HRP酶结合物的制备与鉴定利用常规方法从健康的BALB/c小鼠血清中提取IgG，与等体积弗氏完全佐剂乳化，充分混匀后经背部皮下注射健康的18个月以上的山羊，2mL/只；首免后第2周和第4周分别用相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂(FIA)进行二免和三免后，无菌采血分离血清，分别经1次50%和2次33%饱和硫酸铵沉淀提纯羊抗鼠IgG，透析除盐；用改良的过碘酸氧化法将辣根过氧化物酶(HRP)标记于羊抗鼠IgG。标记程序如下将5mgHRP溶于0.5mL0.1mol/LNaHCO3溶液中；力卩0.5mL 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h。加0.75mL O.lmol/L Na2C03混匀。加入0.75mL
7纯化的羊抗鼠IgG (15mg/mL),混匀。称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃 棉的5mL注射器外筒内随后将上述交联物移入注射器外套，盖紧，4'C过夜。用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积的新鲜配制的5mg/mLNaBH4溶液，混匀，室 温作用30min;再加入3/20体积的NaBH4溶液，混匀，室温作用lh (或4'C过夜)。将交联 物过S邻hadex G200或S邻harose 6B (2.6x50cm)层析纯化，分管收集第一峰。测定克分子 比值和标记率，鉴定酶结合物质量，用ELISA法测定酶活性和抗体活性。HRP抗体酶结合物 的保存时，加入等量甘油(或ie/。BSA和50^甘油)后，小量分装-2(TC存放。
5、 阳性血清的制备挑选体格健壮的18个月以上的山羊2 3只，将纯化后AKV与等 体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化，充分混匀后经背部皮下注射，2mL/只；首免后第2周和第 4周分别用AKV相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂(FIA)进行二免和三免；待山羊血清中 抗赤羽病病毒IgG抗体酶联免疫吸附试验效价达1:500以上，无菌采血分离血清，离心或过 滤除去沉淀，进行56'C加热30min灭活，用血清保存液配方I按1: 2稀释(能用正常的山 羊血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本)，抽滤除菌，lmL/管分装，贴上标签，-80°C 保存。不可反复冻融，解冻后只能在4'C保存一周。
6、 阴性血清的制备:选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血用行业标准SNT1128-2002 《赤羽病微量血清中和试验操作规程》和SNT1128-2007《赤羽病检疫技术规范》检测方法确
认血清中是否有赤羽病的抗体，证实无赤羽病抗体的山羊，无菌采血分离血清。用血清保存 液配方I按1: 2稀释，lmL/管分装，贴上标签，-80"保存。
7、 包被缓冲液的优化包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，采用了碳酸盐缓冲液 (0.05mol/LpH9.6 )、磷酸盐缓冲液(0.05mol/LpH7.6)和Tris盐酸缓冲液(0.05mol/LpH7.6)
三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ng/ml和2.5Hg/ml,酶标抗体工作浓度为1:1000 及1:500，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统。同时为了保证缓冲液能够长期保 存，在包被液中添加了 0.01%的硫柳汞作为防腐剂。结果获得以下最佳的包被液的配方 0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液(NaHC03 1.465g、 Na2C03 0.795g或Na2CO3.10H2O 1.2g、水 500mL)中含0.01%的硫柳汞、lng/ml两性霉素B、谷氨酸钠1%、 1% BSA、 30pg/mL蛋白 酶抑制剂(胰凝乳蛋白酶)等，溶解后过滤除菌，置于4'C冰箱， 一周内使用。
8、最适抗原包被浓度的优化抗原纯化后要准确测定蛋白质浓度，用优化好的上述包被 缓冲液，将包被抗原稀释成0.1lJg/inL， 1.0pg/mL， 2.0pg/mL， 4.0 |Jg/mL， 6.0|Jg/mL, 8.0(Jg/mL' 10.01Jg/mL等6个浓度，包被ELISA板，每孔100|JL，进行ELISA测定。经孵育、显色、终止后，用自动酶标仪分析。显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，选择浓度最低而OD值最大的包被抗原量作为最适抗原包被浓度(测得蛋白质的最适包被浓度为2.0pg/mL 4|jg/mL)。
9、酶标抗体稀释度的优化抗原包被浓度为4pg/mL，将酶标抗体做系列稀释1: 100、1: 200、 1: 400、 1: 800、 1: 1600、 1: 3200、 1: 6400、 1: 12800，经孵育、洗涤后、显色终止后，用自动酶标仪分析，选择OD值为1 1.5左右的酶标抗体稀释度为最适工作浓度。结果表明，将酶标抗体做l: 1000稀释时，OD值为l 1.5左右。
10、 抗原抗体反应时间和McAb竞争反应时间的优化以反应时间短、效果最好、背景值最低为原则，反应时间采用20min、 25min、 30min、 35min、 40min、 45min、 50min、 60min等8个点进行比较，结果表明，抗原抗体反应时间为45min、 McAb竞争反应时间为40min时，效果最好，背景值低。
11、 底物作用时间的优化在其它条件相同的情况下，采用5min、 10min、 15min、 20min、25min、 30min、 35min等7个时间点进行比较，获得15min为最佳的底物作用时间。
12、 20倍浓縮洗涤液、10倍浓縮稀释液、底物液、终止液的优选本发明通过试验，选定如下最佳的洗涤液、稀释液、底物液配方。
12.1 20倍浓縮洗涤液配方NaCL160g， KH2P044g， Na2HP04.12H20 58g， KCL4g,Tween-20 10mL，蒸馏水lOOOmL，充分溶解，另加0.01%的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌后分装。用时作20倍稀释。
12.2 10倍浓縮稀释液配方NaCL80g， KH2P04 2g， Na2HP04.12H20 29g， KCL 2g，Tween-20 5mL,明胶100g，蒸镏水1000mL，充分溶解，另加0.01%的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌后分装。用时作10倍稀释。
12.3底物液的优选底物液I配方乙酸一柠檬酸缓冲液(pH6.0):乙酸钠(A液)—一乙酸钠1.64g、水200mL，溶解后置于4'C冰箱备用；柠檬酸(B液)——拧檬酸2.1g、水100mL，溶解后置于4。C冰箱备用。配制取B液约2mL至A液中调pH值至6.0,置于4'C冰箱备用。另加0.01%的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌分装。底物液II配方TMB溶液TMB350mg、甲醇100 mL,加温溶解后保存于不透光的棕色瓶中，保存于室温或在2'C 7。C保存。底物液III配方每个ELISA试剂盒配一管0.5mL的30% 11202,临用时再按每10ml底物液10pL。工作底物液配制临用前配制。取底物液I (37。C)9.7mL、底物液II 300pL、底物液III lOpL混合。12.4终止液的优选采用lmol/L H2S04、 1.5%NaF、 0.1%叠氮钠和1%十二垸基硫酸钠 (SDS)作为终止液，进行优�。峁詌mol/LH2S04的终止效果最好。
13、封闭液和封闭方法的优选本发明通过试验，选定0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液 (PBS)中含1%牛血清白蛋白(BSA)、 2%明胶、0.01%硫柳汞、两性霉素B (lng/ml)、庆 大霉素(20pg/ml)，过滤除菌。进行4'C冰箱中封闭过夜与37'C 2小时封闭效果比对试验， 封闭和不封闭比对试验，封闭后洗板和封闭后不洗板比对试验。结果4'C冰箱中封闭过夜、 封闭后不洗板的方法获得了最佳的试验结果。
14、 血清、抗体、单克隆抗体保存液的优选配方I: 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) 中含0.01%的硫柳汞、两性霉素B (lpg/ml)、 20^ig/ml庆大霉素、谷氨酸钠1%、 1% BSA、 1%乳糖(或山梨醇甘油)、含蛋白酶抑制剂(如胰凝乳蛋白酶3(Hig/mL)，过滤除菌。配方II: 将对乙酰氨基酚1.5g，聚乙二醇(MW20000) 10g，小牛血清2g，吐温(Tween) —201mL，硫 柳汞0.2g和0.02mol/L、 pH7.2的盐酸缓冲盐水1000mL配制而成，过滤除菌。结果以配方I 作为保存液的保存效果最好。
15、 包被ELISA板制备、保存以及保存期限的测定选择进口优质的可拆96孔ELISA 板，将纯化后的AKV，用优化好的上述包被缓冲液稀释成4.0 jJg/mL，以50hL/孔加入ELISA 板，置4'C冰箱中过夜包被，拍干ELISA板；以200nL/孔加入优化好的封闭液，置4'C冰箱 中封闭过夜；彻底拍干ELISA板。将已包被好的ELISA板置于铝簿或簿锡纸中，内置2g硅 胶干燥剂，封口，置4'C保存，定期用ELISA测定效果，以测定保存期。结果表明，包被ELISA 板4'C下保存至8个月，与新包被的ELISA板检测效果完全一致。
16、 试剂盒检测操作程序
(1) 、将试剂盒中的AKV抗原包被ELISA板、20倍浓縮洗涤液、10倍浓縮稀释液、底 物液、终止液取出，放置室温至少30min。
(2) 、用双蒸水配制稀释液、洗涤液。如工作稀释液10mL10倍稀稀液+90mL双蒸水， 工作洗涤液25mL20倍洗漆液+475mL双蒸水。
(3) 、配制1:10的阳性、阴性对照血清和所有被检血清，如方法l(HiL血清+90pL稀释 液，混匀。
(4) 、 MeAb和羊抗鼠IgG-HRP的稀释(均按1:1000稀释)，如McAb稀释20pL McAb+20mL稀释液，混匀；羊抗鼠IgG-HRP稀释20pL羊抗鼠IgG-HRP+20 mL稀释液混 匀。
10(5) 、加样
——在酶标板上设立稀释液空白对照、阴性血清对照、阳性血清对照(每孔做两孔)。——每份被检血清样品做两孔。
——取100nL稀释液入空白对照孔，取50nL阴性、阳性血清入相应的对照孔，取50^L被检血清样品入相邻横行孔内，37'C湿盒感作45min。
——每孔加50jaLMcAb (空白对照孔不加)，轻轻混匀。
(6) 、酶标板置37'C湿盒感作40min。
(7) 、加酶结合物除空白对照孔外，其它所有孔每孔加50pL羊抗鼠IgG-HRP，轻轻混匀，酶标板置37t)湿盒中感作40min。
(8) 、配制底物液，.取出9.7mL底物液I于棕色瓶中，分别加入底物液Il300pL和底物液ni7pL，充分混匀。
(9) 、先用洗涤液洗酶标板孔5次，每次2min。
(10) 、加底物液所有板孔加100nL底物液，酶标板置湿盒暗盒15min。
(11) 、加终止液加入50^iL/孔终止液。
(12) 、用酶标仪在波长450nm下测定光密度值(OD值)，按下式计算抑制百分率(PI)。
被检血清平均OD值
抑制百分率(PI) = (100 - -) X100
阴性血清平均OD值
(13) 、试剂盒阳性判定值的确定按照上述试剂盒的检测程序，采用行业标准SNT1128-2002《赤羽病微量血清中和试验操作规程》和SNT1128-2007《赤羽病检疫技术规范》检测方法确认的136份阴性血清和87份阳性血清，进行c-ELISA试验后，结果所有阴性血清的百分抑制率250，。，所有阳性血清的百分抑制率<50%。因此，获得c-ELISA阳性判定值
(cut-offvalue)为PI^50%被检血清AK抗体阳性；PI<50%被检血清AK抗体阴性。
17、试剂盒的组装将按上述方法制备好的ELISA抗原包被板(封闭于铝簿/簿锡纸中，内置2g硅胶干燥剂，封口)、酶结合物、单克隆抗体、IO倍浓縮稀释液、20倍浓缩洗涤液、
底物液i、底物液n、底物液ni、终止液、阳性血清、阴性血清定量分装，分别贴上标签与说明。1份详细的试剂盒使用操作说明书。装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。18、试剂盒中各种试液的配制与分装:
试剂盒中试液的配制分装表
试液名称体积(ml)和检测样品数标识
(T)
AKV抗原包被ELISA板2板96孔酶标板(96T)铝簿密封
羊抗鼠IgG-HRP酶结合物0. 5mllml黑盖冻存管
单克隆抗体0. 5mllml红盖冻存管
阳性血清lml2ml蓝盖冻存管
阴性血清lml2ml黄盖冻存管
20倍浓缩洗涤液50ml白色平底瓶
IO倍浓缩稀释液30ml白色平底瓶
底物I20ml黑色平底瓶
底物II2ml2ml棕色冻存管
底物mlml2ml白色冻存管
终止液20ml红盖滴瓶
使用说明书l份
19、试剂盒的临床样品检测与应用以及试剂盒敏感性、特异性的评价按照上述试剂盒的检测程序，采用行业标准SNT1128-2002《赤羽病微量血清中和试验操作规程》和SNT1128-2007《赤羽病检疫技术规范》检测方法确认的136份阴性血清和87份阳性血清，进行c-ELISA试验。统计获得试剂盒的特异性为97% (阴性结果数/阴性样品总数=132/136)，敏感性为94% (阳性结果数/阳性样品总数=82/87)，本试剂盒的特异性、敏感性为良好。
上述具体实施例的实验数据表明，本发明的c-ELISA试剂盒特异性强，敏感性高，适用于赤羽病的快速诊断、检测、检疫和流行病学调査。
1权利要求
1、一种赤羽病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒，其特征在于是由以下组分分装后组成AKV抗原包被ELISA板、羊抗鼠IgG-HRP酶结合物、单克隆抗体、阳性血清、阴性血清、20倍浓缩洗涤液、10倍浓缩稀释液、底物I、底物II、底物III、终止液，所述的羊抗鼠IgG-HRP酶结合物为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体IgG；所述的单克隆抗体为鼠抗赤羽病病毒的特异性单克隆抗体McAb；所述的20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％Tween-20的0.01mol/LpH7.4PBS；所述的10倍浓缩稀释液为10倍浓缩的含1％明胶的PBST；所述的底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液；所述的底物II为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺溶液；所述的底物III为双氧水溶液；所述的终止液为1mol/L H2SO4硫酸溶液。
2、 如权利要求1所述的赤羽病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒，其特征在于其各组分的数量为AKV抗原包被ELISA板 2板96孔酶标板羊抗鼠IgG-HRP酶结合物 0.5ml单克隆抗体 0.5ml阳性血清 1ml阴性血清 1ml20倍浓縮洗涤液 50mlIO倍浓縮稀释液 30ml底物I 20ml底物II 2ml 底物III 1ml终止液 20ml。
3、如权利要求1和2任意一项所述的赤羽病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒的制备方法， 其特征在于由以下步骤组成--一、赤羽病病毒ELISA包被抗原的制备BHK-21细胞长成单层后接种AKV，无血清 的基础培养基继续培养，3 4d后细胞病变达75%以上时，收获病毒，反复冻融3次，以 8000r/min离心30min，取上清液，加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒。采用20%、 60% (w/v)不连续蔗糖密度梯度20000r/min 4。C超速离心3h,收获提纯的病毒条带作为AKV抗原；二、 AKV抗原包被ELISA板的制备将纯化后的AKV抗原，用包被缓冲液稀释成4.0 |jg/mL，以50pL/孔包被ELISA板；以200nL/孔加入封闭液封闭，所述的封闭液为含1%BSA、 2%明胶、0.01%硫柳汞的0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液；三、 羊抗鼠IgG-HRP酶结合物的制备利用常规方法从健康的BALB/c小鼠血清中提取 IgG，与等体积弗氏完全佐剂乳化，充分混匀后经背部皮下注射健康的18个月以上的山羊，2 mL/只；首免后第2周和第4周分别用相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂FIA进行二免和三 免后，无菌采血分离血清，分别经1次50%和2次33%饱和硫酸铵沉淀提纯羊抗鼠IgG,透 析除盐;用改良的过碘酸氧化法将辣根过氧化物酶HRP标记于羊抗鼠IgG， lmL/管分装，-80°C 保存；四、 单克隆抗体的制备用提纯的赤羽病病毒抗原分别加等体积弗氏完全佐剂乳化和弗 氏不完全佐剂乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞 在50X聚乙二醇MW4000融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA 方法检测分泌抗AKV的阳性孔，获得能稳定传代并分泌抗AKV的特异性单克隆抗体的杂交 瘤细胞，利用BALB/c小鼠制备抗赤羽病病毒单克隆抗体腹水；五、 阳性血清的制备挑选体格健壮的18个月以上的山羊2 3只，将纯化后AKV与 等体积弗氏完全佐剂乳化，充分混匀后经背部皮下注射，2mL/只；首免后第2周和第4周分 别用AKV相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂FIA进行二免和三免后，无菌采血分离血清； 用血清保存液配方I按1: 2稀释，lmL/管分装，-SO'C保存；六、 阴性血清的制备选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血检测确认无赤羽病的 抗体，无菌采血分离血清，用血清保存液配方I按1: 2稀释，lmL/管分装，-SO'C保存；七、 2o倍浓縮洗漆液、io倍浓缩稀释液、底物i、底物n、底物in、终止液的优选通过试验选定20倍浓縮洗涤液为20倍浓缩的含0.05%Tween-20的0.01mol/LpH7.4 PBS; 10 倍浓縮稀释液为10倍浓縮的含1%明胶的PBST;底物I为pH6.0的乙酸一拧檬酸缓冲液； 底物11为3.3'—5.5' —四甲基联苯胺溶液；底物III为双氧水溶液；终止液为lmol/LH2S04硫 酸溶液；八、 试剂盒的组装将按上述方法制备好的ELISA抗原包被板封闭于铝簿/簿锡纸中，内 置2g硅胶干燥剂，封口，羊抗鼠IgG-HRP酶结合物、单克隆抗体、10倍浓縮稀释液、20 倍浓縮洗涤液、底物液I、底物液II、底物液III、终止液、阳性血清、阴性血清定量分装， 分别贴上标签与说明，装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。
全文摘要
本发明所属的领域为生物技术领域。本发明所述的赤羽病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒由以下组分分装后组成AKV抗原包被ELISA板、羊抗鼠IgG-HRP酶结合物、单克隆抗体、阳性血清、阴性血清、20倍浓缩洗涤液、10倍浓缩稀释液、底物I、底物II、底物III、终止液，所述的羊抗鼠IgG-HRP酶结合物为辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(IgG)；所述的单克隆抗体为鼠抗赤羽病病毒的特异性单克隆抗体(McAb)；所述的20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％Tween-20的0.01mol/L pH7.4 PBS(PBST)；所述的10倍浓缩稀释液为10倍浓缩的含1％明胶的PBST；所述的底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液；所述的底物II为3.3′-5.5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述的底物III为双氧水(H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)溶液；所述的终止液为1mol/L H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>硫酸溶液。本发明的c-ELISA试剂盒特异性强，敏感性高，适用于赤羽病的快速诊断、检测、检疫和流行病学调查。
文档编号G01N33/577GK101625362SQ20091009481
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者吕建强, 卉 宗, 曹琛福, 曾少灵, 杨俊兴, 林庆燕, 秦智锋, 花群义, 詹爱军, 阮周曦 申请人:花群义
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