专利名称：广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种广东凉茶颗粒的质量评价和来源区分方法，具体涉及广东凉茶颗粒的直接电喷雾质谱指纹图谱的构建方法和标准指纹图谱。
背景技术：
广东凉茶是岭南人民根据本地的气候和水土特性，在长期预防疾病与保健过程中以中医养生理论为指导，以中草药为基础，研制总结出来的具有清热解毒、生津止渴等功效的一类植物饮料。广东凉茶颗粒是著名的广东凉茶之一，由岗梅、山芝麻、五指柑、淡竹叶、 木蝴蝶、布渣叶、火炭母、金沙藤、广金钱草和金樱根10味药材组成，具有清热解毒、祛湿生津、凉血排毒等功效，用于四时感冒、发热喉痛、湿热积滞、口干尿黄等症。现已有王老吉广东凉茶无糖颗粒、王老吉广东凉茶含糖颗粒、香雪广东凉茶含糖颗粒、观鹤广东凉茶含糖颗粒、龙马广东凉茶含糖颗�：退儆揽倒愣共韬强帕５燃列驮谑谐∩舷�。
目前国内还没有文献报道对广东凉茶颗粒的质量评价和来源区分的研究。中药指纹图谱技术是一种表征中药所含成分与其质量关系的有效手段，已成为国内外广泛认可的重要质量评价模式。常规的指纹图谱方法为色谱法，由于需要很长的色谱分离时间，无法满足快速和高通量的要求。直接电喷雾质谱指纹图谱可在常压条件下直接进行指纹图谱分析，不需要色谱分离，因此，分析时间大大缩短，一个完整的指纹谱图分析仅仅需要不到30 秒的时间，满足了快速分析和高通量的要求。因此，建立广东凉茶颗粒的快速、高效、高通量直接电喷雾质谱指纹图谱方法，从整体上全面反映制剂的内在质量，为其质量控制提供一种提供直观、简便、有效的手段。发明内容
本发明的目的在于为广东凉茶颗粒的质量评价、来源区分和真伪鉴别提供一种新的快速、可靠、高通量指纹图谱方法，通过建立广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的方法， 并由此方法得到广东凉茶颗粒的标准指纹图谱。
为达到本发明的目的所采用的技术方案用直接电喷雾质谱法建立广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的方法，具体包括如下步骤
(I)供试品溶液的制备精密称取广东凉茶颗粒I 20g，50% 100%甲醇萃取，采用索氏萃取或超声萃取或微波辅助萃取或加速溶剂萃取方法进行萃�。腿∈奔湮� 10 120min，萃取液浓缩定容至5 50mL，针孔式微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；
(2)质谱条件采用电喷雾质谱直接检测，便携式蠕动泵直接进样，流速10 100 μ L/min,或高效液相色谱不经过色谱柱分离进样,流速100 500 μ L/min ;离子源采用电喷雾离子源；质谱质量分析器采用飞行时间或四级杆或离子阱或静电场轨道阱或傅立叶变换离子回旋共振质量分析器；谱图采用全扫描模式记录质谱的轮廓图，扫描质量范围m/ z 100 1000 ；
(3)测定取供试品溶液注入质谱仪，进样量I 100 μ L，按照直接电喷雾质谱法测定，记录质谱图，得到指纹图谱；
(4)标准指纹图谱供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004Α版》，均值法计算生成标准指纹图谱。
(5)主成分分析供试品指纹图谱采用统计学软件进行主成分分析，进行质量评价和来源区分。
本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施(I)供试品溶液的制备称取广东凉茶颗粒5. Og,加入甲醇50mL,超声萃取30min,萃取液旋转蒸懼浓缩至近干,加入5mL甲醇溶解，摇匀，针孔式微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(2)质谱条件50 μ L/min流速便携式蠕动泵直接进样，或流速200 μ L/min高效液相色谱不经过色谱柱分离进样，电喷雾离子源，飞行时间质量分析器，全扫描模式记录质谱的轮廓图，扫描质量范围m/z 100 1000 ；(3)测定取供试品溶液注入质谱仪，进样量5yL，按照直接电喷雾质谱法测定，记录质谱图，得到指纹图谱；(4)标准指纹图谱供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，均值法计算生成标准指纹图谱；(5)主成分分析供试品指纹图谱采用统计学软件进行主成分分析，进行质量评价和来源区分。
按照本发明所提供指纹图谱的建立方法所得广东凉茶颗粒的指纹图谱中有61个特征离子共有峰，其中特征离子m/z 133为苹果酸、m/z 191为奎尼酸、m/z 191为葡萄糖酸、m/z 353为绿原酸、m/z 515为异绿原酸。
本发明的原理是根据广东凉茶颗粒中主要的活性成分是药材岗梅、山芝麻、五指柑、淡竹叶、木蝴蝶、布渣叶、火炭母、金沙藤、广金钱草和金樱根的提取物，其电喷雾质谱指纹图谱能从整体面貌上把握广东凉茶颗粒的质量。
本发明的有益效果如下
(I)按本发明提供的方法所建立的电喷雾质谱指纹图谱，能有效的进行广东凉茶颗粒的质量评价和来源区分，有利于全面监控产品的质量。
(2)指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定广东凉茶颗粒整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。
(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现型好等优点。
(4)该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，为广东凉茶颗粒的质量评价和来源区分提供技术依据。
图1、6种不同来源的广东凉茶颗粒的电喷雾质谱标准指纹图谱.(A)王老吉无糖广东凉茶颗粒；(B)王老吉有糖广东凉茶颗粒；(C)香雪有糖广东凉茶颗粒；(D观鹤有糖广东凉茶颗粒；(E)龙马有糖广东凉茶颗粒；(F)速永康有糖广东凉茶颗粒.
图2、6种不同来源的广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的主成分分析(PCA) 图.㈧二维PCA得分图；⑶三维PCA得分图；(C) 二维PCA载荷图；⑶三维PCA载荷图.
下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所列举的实施例及附图对本发明并没有限制。
具体实施方式
实施例I.广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的建立
I仪器与试剂
I. I仪器Agilent 6210飞行试剂质谱仪，MassHunter质谱工作站。
I. 2试剂苹果酸、奎尼酸、葡萄糖酸、绿原酸和异绿原酸对照品；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、二次重蒸水。
2.实验部分
2. I质谱条件便携式蠕动泵直接进样，流速50 μ L/min ；电喷雾离子源；电喷雾电压5000V ;辅助喷雾氮气压力15psi ;干燥氮气温度350°C ;干燥氮气流速5L mirT1 ； fragmentor电压100V ;锥孔电压65V ;八级杆射频电压250V ;全扫描模式记录质谱轮廓图， 扫描质量范围m/z 100 1000。
2. 2对照品溶液的制备
A.苹果酸对照品溶液的制备精密称取苹果酸对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至 25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。
B.奎尼酸对照品溶液的制备精密称取奎尼酸对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至 25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。
C.葡萄糖酸对照品溶液的制备精密称取葡萄糖酸对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。
D.绿原酸对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至 25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。
E.异绿原酸对照品溶液的制备精密称取异绿原酸对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。
F.混合对照品溶液的制备分别吸取I. OOmL苹果酸、奎尼酸、绿原酸和异绿原酸对照品溶液，组成混合对照品溶液。
2. 3供试品溶液的制备
精密称取广东凉茶颗粒5. 0g，置于150mL的具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，超声萃取30min，萃取液旋转蒸馏浓缩至近干，少量甲醇溶解后转移至5mL的容量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2. 4测定吸取供试品溶液与对照品溶液，注入飞行时间质谱仪，按照直接电喷雾质谱法测定，所得指纹图谱与图I相似。
实施例2. 6种不同来源广东凉茶颗粒的标准指纹图谱
取王老吉无糖广东凉茶颗粒15批次、王老吉含糖广东凉茶颗粒12批次、香雪含糖广东凉茶颗粒8批次、观鹤含糖广东凉茶颗粒6批次、龙马含糖广东凉茶颗粒2批次和速永康含糖广东凉茶颗粒2批次，按实施例I条件进行检测，每个样品重复测定三次，将三次测定所得谱图的平均值以ASCII码格式导出为.csv文件，然后通过软件转化为.txt文件，导入中国药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，采用均值法计算生成每种来源广东凉茶颗粒的标准指纹图谱，见附图I。
实施例3.通过对指纹图谱进行主成分分析进行广东凉茶颗粒的来源区分
取王老吉无糖广东凉茶颗粒15批次、王老吉含糖广东凉茶颗粒12批次、香雪含糖广东凉茶颗粒8批次、观鹤含糖广东凉茶颗粒6批次、龙马含糖广东凉茶颗粒2批次和速永康含糖广东凉茶颗粒2批次，按实施例I条件进行检测，每个样品重复测定三次，将三次测定所得谱图的平均值以ASCII码格式导出为.csv文件，然后采用统计学软件进行主成分分析(PCA)，进行来源区分的化学标识离子可很好的在PCA得分图中表示出来，而6种不同来源的广东凉茶颗粒则可通过PCA载荷图进行很好的来源区分，PCA得分图和载荷图见附图2。
权利要求
1.一种广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的建立方法，其特征在于采用电喷雾质谱直接构建基于活性成分的指纹图谱，具体包括如下步骤(1)供试品溶液的制备精密称取广东凉茶颗粒，50% 100%甲醇萃取，萃取液浓缩定容后，针孔式微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(2)质谱条件电喷雾质谱检测，全扫描模式记录质谱的轮廓图，扫描质量范围m/z 100 1000 ；(3)测定取供试品溶液注入质谱仪，按照直接电喷雾质谱法测定，记录质谱图，得到指纹图谱；(4)标准指纹图谱供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版》，计算生成标准指纹图谱。(5)主成分分析供试品指纹图谱采用统计学软件进行主成分分析，进行质量评价和来源区分。
2.根据权利要求I所述的广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(I)供试品溶液的制备，精密称取广东凉茶颗粒I 20g，采用索氏萃取或超声萃取或微波辅助萃取或加速溶剂萃取方法进行萃取，萃取时间为10 120min,萃取液浓缩定容至5 50mL。
3.根据权利要求I所述的广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(2)质谱进样方式采用10 100 μ L/min流速便携式螺动泵直接进样或100 500 μ L/min流速高效液相色谱不经过色谱柱分离进样，质谱离子源采用电喷雾离子源，质谱质量分析器采用飞行时间或四级杆或离子阱或静电场轨道阱或傅立叶变换离子回旋共振质量分析器，谱图采用全扫描模式记录质谱的轮廓图，扫描质量范围m/z 100 1000。
4.根据权利要求I所述的广东凉茶颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(3)测定将供试品溶液I IOOOyL注入质谱仪，按照直接电喷雾质谱法测定，得到指纹图谱。
5.根据权利要求I所述的广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的建立方法，其特征是在于所述步骤(4)标准指纹图谱供试品指纹图谱在质量范围m/z 100 1000采用均值法计算生成标准指纹图谱，标准指纹图谱中有61个特征离子共有峰，其中特征离子m/z 133为苹果酸、m/z 191为奎尼酸、m/z 195为葡萄糖酸、m/z 353为绿原酸、m/z 515为异绿原酸。
6.根据权利要求I所述的广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(5)主成分分析采用具有主成分分析功能的统计学软件进行主成分分析，根据主成分分析结果的载荷图进行广东凉茶颗粒的质量评价和来源区分。
全文摘要
广东凉茶颗粒电喷雾质谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，涉及中药制剂的质量控制方法，具体是建立电喷雾质谱指纹图谱以实现广东凉茶颗粒的质量评价和来源区分的方法。方法包括(1)供试品溶液的配制；(2)质谱条件电喷雾质谱直接检测，全扫描模式记录质谱轮廓图，扫描质量范围m/z 100～1000；(3)测定直接电喷雾质谱法得指纹图谱；(4)标准指纹图谱供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，均值法计算，生成标准指纹图谱；(5)主成分分析供试品指纹图谱采用统计学软件进行主成分分析，进行质量评价和来源区分。本发明的有益效果快速、高效、可靠的表征了广东凉茶颗粒的质量，有利于产品质量监控；具有方法简便、稳定、灵敏度高、重复性好、满足高通量分析的要求；可快速准确地鉴别产品的真伪优劣。
文档编号G01N1/34GK102914587SQ201210389868
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者杨运云, 邓洁薇, 张中强, 宋化灿, 范春林 申请人:中国广州分析测试中心
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
