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专利名称：一种沙丁胺醇的免疫学检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及动物性食品安全和畜牧业生产中兴奋剂残留检测的试剂盒，特别是一种用于检测动物性食品和饲料原材料中沙丁胺醇的免疫学检测试剂盒。
背景技术：
随着畜牧业的快速、集约化发展，促进生长等非治疗用兽用药物在畜牧业生产过程中的应用显著增加，由此导致的动物源性食品药物残留对消费者的健康和环境的潜在危害也日趋严重。从上世纪80年代起，欧盟等西方发达国家就明令禁止在动物饲养中使用合成激素和限制使用兽药，我国在新颁布的《饲料和饲料添加剂管理条例》中也明确指出“生产饲料和饲料添加剂不得添加激素类药物”。但近年来，“瘦肉精”盐酸克伦特罗常被发现非法添加在动物饲料中以增加饲料报酬，导致严重的瘦肉精中毒事件时有发生，政府监管力度也因此不断加强。为逃避监管，不法者不断寻找新的“瘦肉精”替代品。沙丁胺醇(Salbutamol，SAL),又名舒喘宁、索布氨、阿布叔醇等，化学名称I- (4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，与盐酸克罗特仑、莱克多巴胺一样是一种苯酚胺类β_肾上腺素激动剂，有松弛支气管平滑肌等作用，在医学上广泛用于防治支气管哮喘以及哮喘型慢性支气管炎、肺气肿等呼吸系统疾病。沙丁胺醇具有营养再分配作用，通过刺激蛋白质的合成而引起纤维细胞内物质增多，体积增大，以及蛋白质降解减缓，脂肪形成减少，进而提高瘦肉率。沙丁胺醇由于生产成本低廉，作为一种新型促生长添加剂在畜产品生产中使用，尤其是当“瘦肉精”盐酸克伦特罗全面禁止使用后，沙丁胺醇便成为畜产品生产中兽药添加剂的常用药品。但人体沙丁胺醇摄入量过大时对心血管系统和神经系统会产生明显的刺激作用，引发肌肉颤抖、心悸、心慌、头疼、目眩，严重者有恶心、呕吐等症状，甚至危及生命。2002年我国农业部、卫生部公布沙丁胺醇、西马特罗、特步他林、克伦特罗、莱克多巴胺、多巴胺等6种禁用兽药兴奋剂，并且要求在肉制品中不得检出，即含量小于或等于O. I μ g/kg，因此，建立科学、高效、简便的沙丁胺醇残留监控方法十分必要。目前，检测沙丁胺醇的方法有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等。GC-MS、HPLC和LC-MS虽然检测结果准确，但成本高、操作复杂，而且样品的前处理涉及到有机溶剂提取、液液萃取和固相萃取等多种操作步骤，过程十分复杂、耗时。ELISA检测是一种基于抗原抗体反应和酶化学反应的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、易操作、方便快捷、成本低、安全可靠等优点，而且不需要复杂昂贵的的仪器设备，对操作者的专业要求也比较低，是目前快速检测此类药物较普遍的筛选方法。但我国目前国产沙丁胺醇酶联免疫试剂盒不多，且检测灵敏度和稳定性有待进一步提高，因此研制高灵敏、稳定性好的沙丁胺醇残留检测ELISA试剂盒对于促进养殖业健康发展、维护群众健康具有积极意义。
发明内容本实用新型的目的是提供了一种小巧轻便的沙丁胺醇免疫学检测试剂盒，使用该试剂盒操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，可进行一次连续多个样品中沙丁胺醇含量的测定，减少了检验样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种沙丁胺醇的免疫学检测试剂盒，包括盒体，其特征在于盒体内包含有酶标板、盖板膜、14瓶试剂和具有下凹瓶位的模具，所述的酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，微孔条上预包被沙丁胺醇偶联抗原后固定于酶标板的外框支撑架上，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；所述的盖板膜大小与酶标板一致；所述的模具上的下凹瓶位分别为标准液瓶位、高浓度标准液瓶位、酶标二抗工作液瓶位、沙丁胺醇抗体瓶位、显色液A液瓶位、显色液B液瓶位、终止液瓶位、浓缩洗涤液瓶位、浓缩样品稀释液瓶位。所述的盒体是硬纸盒；所述的酶标板由聚苯乙烯制成，放于真空铝钼袋内；所述的盖板膜是透明塑料硬膜，放于铝钼袋内；所述的14瓶试剂分别为6瓶标准液、I瓶高浓度标准液、I瓶酶标二抗工作液、I瓶沙丁胺醇抗体、I瓶显色液A液、I瓶显色液B液、I瓶终止液、I瓶浓缩洗涤液、I瓶浓缩样品稀释液，标准液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛装，酶标二抗工作液用红色瓶 帽的白色塑料瓶盛装，沙丁胺醇抗体用黄色瓶帽的白色塑料瓶盛装，显色剂A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛装，显色剂B液用绿色瓶帽的白色塑料瓶盛装，终止液用绿色瓶帽的白色塑料瓶盛装，浓缩洗涤液和样品稀释液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛装；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14个下凹瓶位，14个试剂瓶依次放入对应下凹瓶位内。所述的6瓶标准液，均为 Iml/ 瓶，浓度分别为 Ong/ml,O. 02ng/ml,O. 06ng/ml,O. lng/ml,0. 3ng/ml,0. 8ng/ml ;高浓度标准品溶液I瓶，lml/瓶；酶标二抗工作液I瓶，6ml/瓶；沙丁胺醇抗体工作液I瓶，6ml/瓶；显色液A液I瓶，7ml/瓶；显色液B液I瓶，7ml/瓶；终止液I瓶，7ml/瓶；浓缩洗涤液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；浓缩样品稀释液(2X) I瓶，40 ml/瓶。本实用新型用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书和质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96份测定(包括标准分析孔)，即可进行一次连续多个样品的检测，也可将酶标板微孔条拆开进行多次使用。此时，将剩下的微孔条放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性和稳定性。检测时，样本中的残留物沙丁胺醇将和微孔条上预包被的沙丁胺醇偶联抗原竟争抗沙丁胺醇抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物沙丁胺醇的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物沙丁胺醇的含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很闻的灵敏度检测缓冲液中最低检测限为O. 2ng/ml,动物组织中最低检测限为O. 6ng/ml，尿样样品中最低检测限为O. 2ng/ml，饲料样品中最低检测限为20ng/ml ;回收率组织样品中为80± 10%、尿样样品中为80±10%、饲料样品中80± 10%，且试剂盒的变异系数均小于10%。相对于其他兴奋剂残留检测，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、匀质器、振荡机和微量加样器，同类实验室一般均有配备，操作简单易行，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物源性食品中沙丁胺醇残留的定量、定性检测。

图I是本实用新型中酶标板的主视图；[0010]图2是图I中沿A-A的纵向剖视图；图3是本实用新型盖板膜的主视图；图4是本实用新型中试剂瓶的主视图；图5是本实用新型中具有下凹瓶位模具的结构示意图；图6是本实用新型中盒体与具有下凹瓶位模具的结构示意图。图面说明1、支撑架；2、微孔条；3、沙丁胺醇偶联抗原；4、盖板膜；5、洗涤液或样品稀释液白色瓶盖；6、半透明塑料试剂瓶；7、黄色瓶盖或红色瓶帽；8、黑色瓶盖；9、黑色塑料试剂瓶；10、绿色瓶盖；11、白色塑料试剂瓶；12、标准品溶液白色瓶盖；13、6ml沙丁胺醇抗体工作液瓶位；14、6ml酶标二抗工作液瓶位；15、7ml底物显色剂A液瓶位；16、lml高浓度沙丁胺醇标准品溶液瓶位；17、7ml底物显色剂B液和7ml终止液瓶位；18、6种lml/瓶各·种浓度的标准液瓶位；19、40ml浓缩洗涤液瓶位；20、40ml浓缩样品稀释液瓶位；21、具有下凹瓶位的模具；22、盒体。
具体实施方式
结合附图详细描述实施例。酶标反应微孔条(2)预包被沙丁胺醇偶联抗原(3)后固定于酶标板的外框支撑架(I)上，且酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);白色瓶帽(5)的半透明塑料试剂瓶(6)用于封装40ml浓缩洗涤液或40ml浓缩样品稀释液；黄色瓶帽(7)的白色塑料试剂瓶用于封装6ml沙丁胺醇抗体工作液，红色瓶帽(7)的白色塑料试剂瓶用于封装6ml酶标二抗工作液；黑色瓶帽(8)的黑色塑料试剂瓶(9)用于封装7ml底物显色剂A液，绿色瓶帽
(10)的白色塑料试剂瓶(11)用于封装7ml底物显色剂B液或7ml终止液；白色瓶帽(12)的半透明塑料试剂瓶用于封装lml/瓶的标准品溶液；实用新型盒体(22)内置新型具有下凹瓶位的固定泡沫模具(21),上有14个瓶位,放置位置依次为6ml沙丁胺醇抗体工作液瓶位(13)，6ml酶标二抗工作液瓶位(14)，7ml底物显色剂A液瓶位(15)，Iml高浓度沙丁胺醇标准品溶液瓶位(16)，7ml底物显色剂B液或7ml终止液瓶位(17)，6种lml/瓶各种浓度的标准液瓶位(18)，40ml浓缩洗涤液瓶位(19)，40ml浓缩样品稀释液瓶位(20)。饲料样品中沙丁胺醇含量测定I)样本前处理称取I. 0±0. 05g样品于50ml离心管中；加入O. IM的HCl溶液IOml,用润旋仪润动6 8min ；4000r/min离心IOmin ;取Iml上清液,用IM NaOH溶液调节pH值至7. O 8. O (大约20ml) ；4000r/min离心5min ;取上清IOOml力口入至丨J 900ml稀释后的样品稀释液中并混匀；取30ml用于样品分析。2)使用试剂盒的操作步骤①将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20 25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀取出需要数量的微孔条，将不用的微孔条放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2 8°C 洗涤工作液在使用前也需回温编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置； 加标准品/样本加标准品/样本50 μ I到对应的微孔中，随即加入酶标二抗工作液50 μ I /孔，再加入沙丁胺醇抗体工作液50 μ I /孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37°C避光环境中反应30min 洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300 μ I/孔，充分洗涤5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)显色加入底物显色剂A液50 μ I/孔，再加底物显色剂B液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37°C避光环境反应15 20min ·Μ测定加入终止液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。3)结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，而定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含沙丁胺醇成负相关。①用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本I的吸光度值为O. 659，样本2的吸光度值为I. 725，标准液吸光度值分别是0ng/ml为2. 523 ；0. 2ng/ml 为 2. 217 ；0. 6ng/ml 为 I. 566 ；1. 8ng/ml 为 O. 842 ；5. 4ng/ml 为 O. 387 ；16. 2ng/ml为O. 145。则样品I的浓度范围是I. 8ng/ml 5. 4ng/ml ;样品2的浓度范围是
O.2ng/ml O. 6ng/ml，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中沙丁胺醇的浓度范围。②准确定量计算分两个步骤第一步，百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(％) = B/ B0 X 100%式中，B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；Btl —O (ng/ml)标准溶液的平均吸光度值。第二步，标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以沙丁胺醇标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中沙丁胺醇实
际含量。4)注意事项①室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20 25°C)会导致所有OD值偏低；②在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作；③每加一种试剂前需将其摇匀；④反应终止液为浓度2 mol/1的硫酸,避免接触皮肤；⑤不使用过有效日期的试剂盒；不使用过有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂；⑥保存试剂盒于2 8°C，不可冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂(底物液)对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；⑦试剂变质的迹象底物液有任何颜色表明变质，应当弃之。O标准的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5)时，表示试剂可能变质；⑧在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15 20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到30min (或更长)。反之，则减短反应时间；⑨该试剂盒最佳反应温度为37°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
权利要求1.一种沙丁胺醇的免疫学检测试剂盒，包括盒体，其特征在于盒体内包含有酶标板、盖板膜、14瓶试剂和具有下凹瓶位的模具，所述的酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，微孔条上预包被沙丁胺醇偶联抗原后固定于酶标板的外框支撑架上，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；所述的盖板膜大小与酶标板一致；所述的模具上的下凹瓶位分别为标准液瓶位、高浓度标准液瓶位、酶标二抗工作液瓶位、沙丁胺醇抗体瓶位、显色液A液瓶位、显色液B液瓶位、终止液瓶位、浓缩洗涤液瓶位、浓缩样品稀释液瓶位。
2.根据权利要求I所述的沙丁胺醇的免疫学检测试剂盒，其特征在于所述的盒体是硬纸盒；所述的酶标板由聚苯乙烯制成，放于真空铝钼袋内；所述的盖板膜是透明塑料硬膜，放于铝钼袋内；所述的14瓶试剂分别为6瓶标准液、I瓶高浓度标准液、I瓶酶标二抗工作液、I瓶沙丁胺醇抗体、I瓶显色液A液、I瓶显色液B液、I瓶终止液、I瓶浓缩洗涤液、I瓶浓缩样品稀释液，标准液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛装，酶标二抗工作液用红色瓶帽的白色塑料瓶盛装，沙丁胺醇抗体用黄色瓶帽的白色塑料瓶盛装，显色剂A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛装，显色剂B液用绿色瓶帽的白色塑料瓶盛装，终止液用绿色瓶帽的白色塑料瓶盛装，浓缩洗涤液和样品稀释液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛装；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14个下凹瓶位，14个试剂瓶依次放入对应下凹瓶位内。
3.根据权利要求I或2所述的沙丁胺醇的免疫学检测试剂盒，其特征在于所述的6瓶标准液，均为 Iml/ 瓶，浓度分别为 Ong/ml, O. 2ng/ml, O. 6ng/ml, I. 8ng/ml, 5. 4ng/ml,，16. 2ng/ml ;高浓度标准品溶液I瓶，lml/瓶；酶标二抗工作液I瓶，6ml/瓶；沙丁胺醇抗体工作液I瓶，6ml/瓶；显色液A液I瓶，7ml/瓶；显色液B液I瓶，7ml/瓶；终止液I瓶，7ml/瓶；浓缩洗涤液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；浓缩样品稀释液(2X) I瓶，40 ml/瓶。
专利摘要本实用新型涉及一种沙丁胺醇的免疫学检测试剂盒。本实用新型的技术方案要点为一种沙丁胺醇的免疫学检测试剂盒，包括盒体，其特征在于盒体内包含有酶标板、盖板膜、14瓶试剂和具有下凹瓶位的模具，所述的酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，微孔条上预包被沙丁胺醇偶联抗原后固定于酶标板的外框支撑架上，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；所述的模具上具有14个下凹瓶位，14瓶试剂依次放入对应下凹瓶位内。本实用新型能实现快速、简便、灵敏、准确地进行一次连续多个样品中沙丁胺醇含量的测定。
文档编号G01N33/543GK202614762SQ20122025242
公开日2012年12月19日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者姜金庆, 齐永华, 刘俊伟, 李任峰, 常新耀, 李桂平, 杨志, 郭芳, 邓云娟, 赵莉 申请人:河南知微生物工程有限公司