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一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用高效离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，包括样品预处理、样品测定和含量分析三个步骤，其特征在于：所述样品测定步骤中流动相的选择为A泵：0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl；B泵：0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl+0.5mol/LNaCl。本发明采用高效液相离子交换色谱法对乳制品中未变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分分析测定，方法重现性良好，且可以很好的反映出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。
【专利说明】一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α -乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法。
【背景技术】
[0002]牛乳制品是现代日常饮食中不可或缺的组成部分，也是摄取蛋白质的重要来源。牛奶中的乳清蛋白被称为蛋白之王，具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，是公认的人体优质蛋白质补充剂之一，其主要成分包括β -乳球蛋白、α -乳白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白等。
[0003]然而,对婴幼儿而言,牛乳蛋白过敏症(cow' milk allergy,CMA)是一种常见的蛋白过敏症状，发生率高达2%_6%，严重地影响婴幼儿的身体健康。研究表明，牛乳制品中导致婴幼儿过敏的蛋白成分主要是天然未变性的β_乳球蛋白和α-乳白蛋白。因此，建立牛乳β_乳球蛋白和α-乳白蛋白高特异性、高灵敏度、快速、准确的检测方法，将对维护CMA患儿的健康起到积极的作用。目前，针对β_乳球蛋白和α-乳白蛋白检测方法的研究多有报道，如常用的反相高效液相色谱法，但是，由于检测过程使用有机溶剂如乙腈、甲醇等，会对导致天然蛋白成分发生变性，不能很好地反映出未变性的α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分。

【发明内容】

[0004]本发明为解决上述问题，提供了一种新的技术方案来满足需求。
[0005]本发明的目的是提供了一种利用高效离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，包括样品预处理、样品测定和含量分析三个步骤，其特征在于:所述样品测定步骤采用高效液相离子交换色谱法；所述采用高效液相离子交换色谱法中流动相的选择为A泵:0.02mol/L pH8.2的Tris- HCl ；B泵:0.02mol/LρΗ8.2 的 Tris- HC1+0.5 mol/L NaCl。
[0006]所述的样品预处理分为液态样品预处理和固体或粉末状样品预处理；所述液态样品预处理为将样品于4°C下采用转速4000rpm离心IOmin ;所述固体或粉末状样品预处理为将样品溶于适量去离子水后离心，离心后将液态部分调节PH至4.6，静置lOmin，于4°C下采用转速IOOOOrpm离心15min,弃去沉淀,上清液调节pH至6-7,用3倍体积0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl进行稀释。
[0007]所述的高效液相离子交换色谱法的色谱条件为色谱柱:4.6 mmX 3.5 cm的TSKgel DEAE-NPR ;柱温:25°C ;进样体积:10μ L ;流速:lmL/min ;洗脱方式:0_5min等度洗脱100%A ；5-15min梯度洗脱0-100% B ;检测波长280nm。
[0008]所述的含量分析为根据标准曲线法进行计算α -乳白蛋白和β -乳球蛋白含量。
[0009]所述的标准曲线为分别准确称取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准品，溶解于0.02mol/L pH8.2的TriS- HCl配制成一定浓度的标准溶液，分别稀释成一定浓度梯度的标准稀释液，0.45 μ m滤膜过滤，分别进样进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标制作标准曲线。
[0010]有益效果:本发明采用高效液相离子交换色谱法对牛乳制品中未变性α -乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法进行分析测定时，在检测过程中使用的流动相为缓冲溶液，不会使乳品中的天然蛋白成分发生变性；而且本发明的方法重现性良好，所以可以很好的反映出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。
【专利附图】

【附图说明】
[0011]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述。
[0012]图1a-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准图谱。
[0013]图2原料乳色谱图。
【具体实施方式】
[0014]下面的实施列可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0015]实施例1 标准曲线的制作
分别准确称取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准品，溶解于0.02mol/L Tris- HCl(ρΗ8.2)配制成浓度为2mg/mL的标准溶液，分别稀释成浓度分别为0.05,0.1,0.2,0.4、
0.8、1.0mg/mL标准稀释液，0.45 μ m滤膜过滤分别进样进行测定。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标做标准曲线。α-乳白蛋白、β-乳球蛋白标准曲线分别为Y = 625741.3Χ -68252.8 (相关系数 R2=0.9923)和 Y = 510211.7Χ - 378208.3 相关系数 R2=0.9869)，线性范围均在50-1000 μ g/mL。以信噪比S/N=3测定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白最小检出限分别为4 μ g/mL和12 μ g/mL。6次重复测定混合标准也中的α -乳白蛋白和β -乳球蛋白的含量，RSD分别为4.3 %和3.6%，表明本方法重现性良好。
[0016]实施例2
原料乳中未变性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分测定
原料乳于4°C下以4000rpm离心10分钟,弃去脂肪,调节pH至4.6,静置lOmin, 4°C下以IOOOOrpm的转速离心15min,0.45 μ m滤膜过滤。选用阴离子交换色谱柱TSKgel DEAE-NPR(4.6mmX3.5 cm),设置柱温:25°C ;进样体积:10 μ L ;流速:lmL/min ；流动相:A 泵:0.02mol/LTris- HCl (ρΗ8.2);Β 泵:0.02mol/L Tris- HCl (ρΗ8.2)+0.5 mol/L NaCl ;洗脱方式:0-5min等度洗脱100%A ;5-15min梯度洗脱0-100% B ;检测波长280nm。根据标准曲线，计算出原料乳中Ct-乳白蛋白和β -乳球蛋白含量分别为0.9mg/g和4.7mg/g。
【权利要求】
1.一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，包括样品预处理、样品测定和含量分析三个步骤，其特征在于:所述样品测定步骤中采用高效液相离子交换色谱法；所述高效液相离子交换色谱法中流动相的选择为A泵:0.02mol/L ρΗ8.2 的Tris- HC1，B泵:0.02mol/L ρΗ8.2 的Tris- HC1+0.5 mol/L NaCl。
2.根据权利要求1所述的一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的样品预处理分为液态样品预处理和固体或粉末状样品预处理；所述液态样品预处理为将样品于4°C下采用转速4000rpm离心IOmin ;所述固体或粉末状样品预处理为将样品溶于适量去离子水后离心，离心后将液态部分调节pH至4.6,静置IOmin,于4°C下采用转速IOOOOrpm离心15min,弃去沉淀,上清液调节pH至6-7，用3倍体积0.02mol/L ρΗ8.2的Tris-HCl进行稀释。
3.根据权利要求1所述的一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的高效液相离子交换色谱法的色谱条件为色谱柱:4.6 mmX 3.5 cm的TSKgel DEAE-NPR ;柱温:25°C ;进样体积:10 μ L ;流速:lmL/min ;洗脱方式:0_5min等度洗脱100%A ；5-15min梯度洗脱0-100% B ;检测波长280nm。
4.根据权利要求1所述的一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的含量分析为根据标准曲线法进行计算α-乳白蛋白和β_乳球蛋白含量。
5.根据权利要求1?4任一项所述的一种高效液相离子交换色谱法分析牛乳制品中未变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的标准曲线为分别准确称取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准品，溶解于0.02mol/L pH8.2的Tris- HCl配制成一定浓度的标准溶液，分别稀释成一定浓度梯度的标准稀释液，0.45 μ m滤膜过滤，分别进样进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标制作标准曲线。
【文档编号】G01N30/88GK103792316SQ201410032986
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】邵彪, 陈刚, 许蓓蓓, 施炎炎 申请人:南通市产品质量监督检验所