专利名称：一种快速检测重组蛋白表达量的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及重组蛋白表达过程中蛋白表达量的检测方法。
背景技术：
DNA的重组技术是基因工程 的核心技术，广泛地应用于生命科学领域的多个方面并给生命科学带来了革命性的变化，促进了生命科学领域研究和应用的进步。其中，利用某种生物或细胞来大量表达特定的目标蛋白，也就是重组蛋白的表达是DNA重组技术的重要应用之一。蛋白质是生命组成中的重要物质，是生物体行使各种生命活动的基�。鞍字手�、蛋白质与核酸以及其他细胞组分之间的相互作用，蛋白质等生物大分子本身的结构与功能的改变均对生物体的生命活动产生重要的影响。重组蛋白表达技术的出现使得人们可以利用基因工程的手段产生天然的或任意设计的核酸序列，进而大量获得过去难以获得的生物体内的蛋白质，从而研究其结构与功能。更重要的，还可以通过突变的手段获得“改造”以后的蛋白质，为研究蛋白质的结构与功能，揭露生命的本质提供了强有力的手段。目前发展起来的重组蛋白表达系统有许多，根据表达蛋白的宿主的不同可以分为原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、转基因动植物表达系统以及不需要宿主的无细胞表达系统等。不同的表达系统有各自的特点，往往需要根据目标蛋白的性质和后续的应用进行选择。原核表达系统是利用特定的大肠杆菌工程菌株作为宿主菌来表达外源重组蛋白的一个系统，由于其宿主细胞培养简单，转化方便，表达成本相对较低等特点而得到广泛的应用。在原核细胞中表达重组蛋白主要有以下几个环节A、从生命体内扩增或根据序列人工合成目的基因；B、利用克隆的手段将该基因片段装到表达载体中，表达载体通常是一段与宿主细胞相容的、可以短时间存在于细胞中、或可以在宿主细胞中繁殖和扩增、或可以整合至宿主细胞基因组DNA中的特殊的DNA分子，该分子上的一些具有特定序列和特殊作用的片段如启动子、终止子、调控序列等与目的基因形成一个可以让目的基因在宿主细胞体内完成转录和翻译过程的表达盒；C、为了确保目的基因和其他相关序列的正确性，该表达载体需要通过DNA序列测定完成验证。为了获得大量的载体，在这个过程中往往需要将表达载体转入克隆菌株中进行保存和扩增；D、将序列得到确认的表达载体转入特定的宿主细胞(如大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞等)中，在一定条件下诱导表达载体中的目标蛋白进行表达；E、筛选获得表达量最高的细胞；F、将该细胞扩大培养，诱导目标蛋白表达并进行后续的纯化等工作。在这些环节中，前期载体构建的步骤主要利用基因工程中的工具酶进行扩增、酶切、连接等一系列的过程来完成，整个技术已相对成熟，目前也已经有多种具有不同特性的表达载体可以选择。后续的纯化工作需要根据不同的目标蛋白的特性制定纯化策略，尽管目前有多种融合标签可以帮助进行蛋白纯化，但需要进一步纯化时，纯化方案需要的定制程度仍然比较高。外源重组蛋白在一个宿主中的表达以及表达量往往受到众多因素的影响，比如质粒的拷贝数、启动子与诱导方式的选择、重组蛋白的亲疏水性、重组蛋白对宿主细胞的生理影响等，甚至宿主菌的生长状态或其基因组上的细微突变均会影响到重组蛋白的表达与否，表达量的高低。因此，在进行大量表达之前，对可能的克隆进行筛�。竦靡桓霰泶锪扛叩目寺《杂诤笮氖笛榉浅９丶Ｔ谙中械难芯糠椒ㄖ校泶镌靥遄胨拗骶院螅枰韧ü齈CR等手段验证重组载体是否转入宿主菌中，随后通过小量培养阳性克隆并进行小量表达实验来筛选和比较不同克隆之间的表达量。该过程操作繁琐，重新培养也需要额外的等待时间，而且很难将筛选规模进一步扩大。为了解决这一问题，采用本发明的方法可以在克隆平板上直接进行筛�。看慰梢酝奔觳馍习俑隹寺。蟠筇岣吡松秆〉男Ч�。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种快速检测重组蛋白表达量的方法。本发明首先将含有目标蛋白表达盒的载体转入表达菌株后涂布于平板培养基上并诱导蛋白表达，待单克隆菌落生长至一定大小后，将平板上的克隆影印至印迹膜上。随后，将菌体在膜上裂解，使克隆中的蛋白固定至印迹膜上，并用针对目标蛋白或载体上的特定标签的抗体进行Western blotting检测,Western blotting检测中，各个斑所在位置处的信号强度即反映了该克隆中目标蛋白的表达量。进一步可以从原来的平板上或复制的平板上找到表达量最高的克�。糜诤笮笛�。具体地，本发明快速检测重组蛋白表达量的方法，包括以下步骤a)将待检测的基因工程菌涂布或点种于平板培养基上，并在适合目标蛋白表达的条件下进行培养至单克隆菌落生长至合适大�。竦每寺∑桨澹籦)将克隆平板上的菌斑影印到印迹膜上；c)对印迹膜上的菌斑进行原位裂解；d)利用针对目标蛋白或与目标蛋白融合表达的蛋白标签的抗体作为一抗对印迹膜进行 Western Blotting 检测；e)根据Western blotting检测结果获知各单克隆的表达量高低，Westernblotting检测信号强度越强，则对应克隆中目标蛋白的表达量越高。在步骤a)中，本领域的技术人员可根据工程菌的种类及表达条件的差异选择合适的培养基与培养条件。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养，并在培养基中加入合适的诱导剂或者采用物理诱导的方式诱导目标蛋白的表达。例如，大肠杆菌可选用LB培养基，采用IPTG诱导目的蛋白的表达等等。进一步的，步骤a)所述待检测的基因工程菌为经验证转入了正确表达载体的基因工程菌。所述基因工程菌可以为原核细胞，如细菌细胞；或是真核细胞，如真菌细胞。代表性例子有大肠杆菌，酵母，昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞等。
进一步的，所述基因工程菌预期表达的目的蛋白也可与蛋白标签融合表达。所述蛋白标签(Protein tag)是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。该蛋白标签可以是载体自带，也可以在基因工程菌构建时与目标蛋白一起构建。所述蛋白标签可为各种现有的蛋白标签，包括但不限于Trx标签、Poly-His标签、FLAG标签、HA标签、Avi标签、SUMO标签、MYC标签、MBP标签、SBP标签、CBP标签、CBD标签、GST标签、eGFP标签、eYFP标签、eCFP标签、SNAP标签、Halo标签、protein A标签、Poly-Arg标签等等。步骤b)所述印迹膜可为Western blotting常用的印迹膜,包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜等。步骤b)所述影印的方法可将印迹膜贴于克隆平板上影印。进一步的，步骤b)将克隆平板上的菌斑影印到印迹膜上后，将印迹膜倒贴于另一新鲜平板培养基上，并在适合目标蛋白表达的条件下进行培养12-16小时。步骤c)所述原位裂解的方法为将印迹膜浸于细胞裂解液中进行细胞裂解。过程中可轻微震荡以促进细胞裂解。所述细胞裂解液为常规，本领域可根据基因工程菌的宿主菌选择合适种类的裂解液。裂解的时间及温度条件可按细胞裂解液的说明进行，一般为室温下5-10min。进一步的，步骤c)对印迹膜上的菌斑进行原位裂解后，将印迹膜晾干。将印迹膜晾干是为了便让蛋白质与印迹膜更好地结合与固定。步骤d)所述对印迹膜进行Western Blotting检测,具体包括将印迹膜依次经清洗、封闭、清洗、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、显色。上述均为常规Western Blotting转膜后的步骤，所采用的试剂及条件也为常规。本发明所述快速检测重组蛋白表达量的方法可用于判断目标蛋白的表达与否或用于高表达量克隆的快速筛选。利用本发明，可从大量克隆中快速筛选到蛋白表达量最高的克隆。本发明的优点I、适用性广。采用本发明的方法不受目的蛋白编码序列的限制，只需根据载体上的蛋白标签即可进行检测。2、快速便捷。能够直接在平板菌落上进行筛选。样本容量大，一次实验可以进行上百个菌落的筛选。3、操作简单。本发明中用到的均为基本的基因工程操作技术，可以在常规生物学实验室完成，没有特殊设备的要求。4、便于后续操作。平板上的菌落经过影印转移到新鲜的平板上，长出来的菌落可以直接用于后续的大规模培养和蛋白表达。
图I是本发明操作流程示意图
图2是实施例中克隆PCR验证的结果图3是实施例中平板菌落生长情况与Western blotting检测结果及两者之间的对应关系图4是实施例中对筛选出的克隆进行大量培养的验证结果
具体实施例方式实施例的总体设计包括以下步骤I.目的基因合成的引物设计，PCR获得目的基因；2.载体和目的片段的双酶切及连接，目的片段的测序验证；3.重组表达质粒的构建及鉴定；4.目的蛋白的表达；
5.目的蛋白在NC膜上的Western blotting检测；6.目的蛋白表达情况的分析和比较。下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I表达载体的构建I. IGFP基因的获得I. I. IGFP基因合成引物的设计通过全基因合成的方法获得GFP的编码基因(SEQ ID NO :1)，目的片段的C端加上6xHis tag标签；在目的基因的上下游分别带有BamHI和NotI酶切位点用DNAworks在线程序设计出34条长度为40bp的引物，通过PCR组装和重叠延伸PCR获得GFP基因的全长序列。引物的处理将每条引物用水溶解并稀释成5 ii M的使用浓度。将34条引物分成两组进行PCR组装引物1-18 (SEQ ID NO :2_19)和17-34 (SEQID NO 18-35)。引物混合液的配制首尾引物各取IOii L，中间引物各取5 ii L，充分混勻，以此作为PCR组装过程的底物。引物序列(5，-3，)gfp-lGACCTCGGATCCATGAGC (SEQ ID NO :2)gfp-2CCGGTAAACAGTTCTTCGCCTTTGCTCATGGATCCGAGGT (SEQ ID NO :3)gfp-3CGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTTGAA (SEQ ID NO :4)gfp-4GGCCATTAACATCGCCATCCAGTTCAACCAGAATCGGCAC (SEQ ID NO :5)gfp-5TGGCGATGTTAATGGCCATAAGTTTAGCGTGCGCGGCGAA (SEQ ID NO :6)gfp-6TTTGCCGTTGGTCGCATCGCCTTCGCCTTCGCCGCGCACG (SEQ ID NO :7)gfp-7GCGACCAACGGCAAACTGACCCTGAAGTTTATTTGCACCA (SEQ ID NO :8)gfp-8CGGCACCGGCAGTTTGCCGGTGGTGCAAATAAACTTCAGG (SEQ ID NO :9)gfp-9AACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGAC (SEQ ID NO :10)
gfp-lOCGGCTAAAGCACTGCACGCCATAGGTCAGGGTGGTCACCA(SEQ ID NO :11)gfp-llTGCAGTGCTTTAGCCGCTATCCGGATCACATGAAACGCCA(SEQ ID NO :12)gfp-12CATCGCGGACTTAAAGAAATCATGGCGTTTCATGTGATCC(SEQ ID NO :13)gfp-13ATTTCTTTAAGTCCGCGATGCCGGAAGGCTATGTTCAGGA(SEQ ID NO :14)gfp-14ATCTTTAAAGCTAATGGTGCGTTCCTGAACATAGCCTTCC(SEQ ID NO :15)gfp-15GCACCATTAGCTTTAAAGATGATGGCACCTATAAGACCCG(SEQ ID NO :16)gfp-16GCCTTCAAATTTCACTTCCGCGCGGGTCTTATAGGTGCCA(SEQ ID NO :17) gfp-17CGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGCAT(SEQ ID NO :18)gfp-18TTGAAGTCAATGCCTTTCAGTTCAATGCGGTTCACCAGGG(SEQ ID NO :19)gfp-19CTGAAAGGCATTGACTTCAAAGAAGATGGCAACATTCTGG(SEQ ID NO :20)gfp-20AATTGTACTCCAGTTTATGGCCCAGAATGTTGCCATCTTC(SEQ ID NO :21)gfp-21GCCATAAACTGGAGTACAATTTCAACAGCCATAACGTGTA(SEQ ID NO :22)gfp-22TTCTGTTTGTCCGCGGTAATATACACGTTATGGCTGTTGA(SEQ ID NO :23)gfp-23CCGCGGACAAACAGAAGAACGGCATCAAAGCGAATTTCAA(SEQ ID NO :24)gfp-24TCTTCCACATTATGGCGGATTTTGAAATTCGCTTTGATGC(SEQ ID NO :25)gfp-25CCGCCATAATGTGGAAGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGAT(SEQ ID NO :26)gfp-26CGATCGGGGTATTCTGCTGATAGTGATCCGCCAGCTGCAC(SEQ ID NO :27)gfp-27GCAGAATACCCCGATCGGCGATGGCCCGGTGCTGCTGCCG(SEQ ID NO :28)gfp-28GACTGGGTGCTCAGGTAGTGATTGTCCGGCAGCAGCACCG(SEQ ID NO :29)gfp-29TACCTGAGCACCCAGTCCGTGCTGAGCAAAGATCCGAATG(SEQ ID NO :30)gfp-30GAACCATGTGATCGCGTTTCTCATTCGGATCTTTGCTCAG(SEQ ID NO :31)gfp-31ACGCGATCACATGGTTCTGCTGGAGTTTGTGACCGCGGCG(SEQ ID NO :32)gfp-32CAGCTCGTCCATGCCATGAGTGATACCCGCCGCGGTCACA(SEQ ID NO :33)gfp-33TGGCATGGACGAGCTGTACAAGCATCACCATCACCATCAC(SEQ ID NO :34)gfp-34GACGTCGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATG(SEQ ID NO :35)I. I. 2GFP基因合成的PCR过程PCR组装体系如下
10 X PCR Buffer5 ^iL
dNTP (IOmM each)I ^iL
MgCl2 (25 mM)4 ^iL
引物混合液8 ^iL
pfu DNA polymerase (5 U/[iL) 0.5 [iL
ddH2031.5^iL反应程序95°C for 3min, (94 °C for 15see, 56°C for 15see, 72 °C for20sec) X 18cycles, 72°C for 2min。两组引物混合物分别进行以上反应，获得PCR组装产物I和PCR组装产物2。重叠延伸PCR体系如下
10 x PCR Buffer5 uL
dNTP (10 mM each)I u L
MgCl2 (25 mM)4 uL
PCR组装产物I2 ii L
PCR组装产物22 uL pfu DNA polymerase (5 U/u L) 0. 5 u L
ddH2035. 5 u L反应程序95°C for 3min, (94 °C for 20sec, 57 °C for 20sec, 72 °C for40sec) X 22cycles, 72°C for 2min。将重叠延伸PCR体系中的产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用生工生物工程(上海)有限公司生产的“SanPr印柱式DNA胶回收试剂盒”回收700bp位置的条带。用BamH I和Not I双酶切回收后的片段和克隆载体pBSK，双酶切体系如下
IOx BanR I buffer5 u L
DNA2 u g
BamH I1.5 u L
Not I1.5 u L
ddH20补足至 50 ii L37°C酶切3h。将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用生工生物工程(上海)有限公司生产的“SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒”分别回收700bp目的基因条带和3000bp位置的克隆载体条带。将酶切后的产物与经过同样双酶切的克隆载体pBSK连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，涂布含有X-Gal的氨苄青霉素平板，挑取白色菌落提取质�：笏筒庑�。保存测序正确的克隆和质粒。I. 2目标载体的制备I. 2. I出发质粒的酶切处理将出发载体pGEX-4T-l用BamH I和Not I双酶切后纯化回收，做为目的载体的骨
架。酶切体系如下
IOx BamH I buffer5 u L
PGEX-4T-1 载体2 u g
BamH II. 5 u L
Not II. 5 u L
ddH20补足至50 u L
37°C酶切3h。将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用生工生物工程(上海)有限公司生产的“SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒”回收4900bp位置的条带。I. 2. 2目的基因的酶切处理将重组的带有正确目的基因序列的克隆载体pBSK进行BamH I和Not I双酶切，
酶切体系如下
IOx BanE I buffer5 u L
重组pBSK质粒2 u g
BanH II. 5 u L
Not II. 5 u L
ddH20补足至50 u L37°C酶切3h。将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用生工生物工程(上海)有限公司生产的“SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒”回收700bp位置的条带。I. 2. 3目的片段与表达载体的连接将经过BamHI和Not I双酶切的载体和片段连接起来，连接体系如下
10 X T4 DNA ligase buffer2 u L
片段100 ng
载体100 ng
T4 DNA ligaseIuL
ddH20补足至 20 ii L反应条件为16°Cfor 2h。反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，用氨苄青霉素抗性平 板进行筛�。羧“咨涮崛≈柿：笏筒庑�。正确克隆的质粒用做目标蛋白表达的最终载体。实施例2闻表达克隆的筛选2. I平板的准备配制LB琼脂培养基，制成两种平板分别为添加了 100 U g/mL氨苄青霉素及添加了 100 i! g/mL氨苄青霉素和0. 2mM IPTG的固体平板。培养皿采用9cm x9cm的方形平板。将上述最终表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，活化之后，将培养液涂布在含有100 U g/mL氨苄青霉素和0. 2mM IPTG的LB平板上，37°C过夜培养便可得到表达了 GFP蛋白的单菌落。与此同时做没有插入GFP的表达载体转化BL21 (DE3)感受态细胞的阴性对照。分别挑取阴性对照和阳性菌落的单克隆点种至上述两种LB平板上，37°C过夜培养后用于后续实验。2. 2膜的准备与蛋白固定
将硝酸纤维素膜(NC膜)裁剪成与平板大小匹配的膜，便于影印。在膜的一角剪掉一个小缺口以作为分辨正反面的记号。将膜贴在点种后长出单菌落的LB平板上，影印之后，将印记面朝下贴于另一新鲜的含有IOOy g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C过夜培养。将影印后的NC膜置于合适的器皿中，加入适量的细菌细胞裂解液进行细胞裂解，裂解5-10min后,将膜适当晾干，以便完成蛋白质与NC膜的结合与固定。2. 3ffestern Blotting 检测在膜上完成细菌的裂解和蛋白固定之后，用Ix TBST溶液对膜进行漂洗，每次5min，重复三次。然后加入10%的BSA蛋白溶液对膜进行封闭，室温孵育I. 5h。封闭结束之后，用Ix TBST溶液对膜进行漂洗，每次5min，重复三次。将膜反贴于按I : 700稀释的兔源His-tag抗体，室温孵育I. 5h。结束之后，再次用Ix TBST溶液对膜进行漂洗，每次5min，重复三次。将膜反贴于按I : 3000稀释的HRP修饰的驴抗兔IgG 二抗中，室温孵育lh。二抗孵育结束后，用Ix TBST溶液对膜进行漂洗，每次5min，重复四次。漂洗结束之后便可进行化学发光反应，之后将膜置于暗盒中曝光；便可观察目的蛋白的表达与否及表达量的高低情况。检测结果如图3所示，上图为影印前的平板，平板上第0列AO-FO为对照组，克隆 内部含有未插入目标蛋白的空载体；平板上第1-5列为带有目标表达载体的克隆。下图为Western Blotting检测结果，各信号点的位置与上图中的克隆一一对应，从检测结果可以看出，平板上第1-5列中的单克隆都被检测到有大量目标蛋白的表达，而对照组A0-R)中仅有微量信号，但该信号与阳性克隆的检测信号相比可以忽略。从下图的Western Blotting检测结果可以明显看出来其信号点所对应的克隆是否有目标蛋白的表达，信号强度也反映了目标蛋白的表达量。实施例3表达克隆筛选方法的验证3. I菌落PCR法验证目的片段的插入与否挑取单菌落溶解在20 ii L双蒸水中，98°C加热IOmin后，取3 y L样品作为PCR模板，用上述基因合成的首尾引物来检测目的基因的插入。20 U L PCR反应体系如下
PCR mix2. 4 UL
gfp-1 引物(5iiM)0. 8 uL
gfp-34 引物(5iiM)0. 8 uL
模板3 ii L
双蒸水补足至20 ii LPCR 反应条件95 0C 3min ； (94 °C 24sec，57 °C 24sec，72 °C 35sec)x 30cycles ；72°C 2min。PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，扩增出的片段大小在700bp左右(如图2)。3. 2western blot 检测挑取转入了正确表达载体的单克隆点种在LB平板上，37°C过夜培养之后，将单克隆影印到硝酸纤维素膜上，按实施例2的方法裂解，并利用表达载体上特定蛋白标签的抗体进行检测，检测信号的情况即反映了被影印的平板上克隆中的目标蛋白的表达情况(如图3)。3. 3液体培养由于本发明中采用的插入片段是GFP蛋白基因，将Western Blot检测为阳性的部分单克隆挑取至含有100 u g/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，30°C培养经过IPTG诱导之后,表达了目的蛋白的菌能够呈现出可见的绿色(如图4中的A1-A3，C1-C3)。而WesternBlot中未被检测到的克隆(A0，C0)则未观察到GFP蛋白的表达，扩大培养的检测 结果与上述Western blotting验证结果一致。即说明通过用Western Blotting检测到的克隆的信号可以反映该克隆中目标蛋白的表达量。
权利要求
1.一种快速检测重组蛋白表达量的方法，包括以下步骤 a)将待检测的基因工程菌涂布或点种于平板培养基上，并在适合目标蛋白表达的条件下进行培养至单克隆菌落生长至合适大�。竦每寺∑桨澹� b)将克隆平板上的菌斑影印到印迹膜上； c)对印迹膜上的菌斑进行原位裂解； d)利用针对目标蛋白或与目标蛋白融合表达的蛋白标签的抗体作为一抗对印迹膜进行 Western Blotting 检测； e)根据Westernblotting检测结果获知各单克隆的表达量高低，Western blotting检测信号强度越强，则对应克隆中目标蛋白的表达量越高。
2.如权利要求I所述快速检测重组蛋白表达量的方法，其特征在于，步骤a)所述待检测的基因工程菌为经验证转入了正确表达载体的基因工程菌。
3.如权利要求I所述快速检测重组蛋白表达量的方法，其特征在于，步骤b)将克隆平板上的菌斑影印到印迹膜上后，将印迹膜倒贴于另一新鲜平板培养基上，并在适合目标蛋白表达的条件下进行培养12-16小时。
4.如权利要求I所述快速检测重组蛋白表达量的方法，其特征在于，步骤c)所述原位裂解的方法为将印迹膜浸于细胞裂解液中进行细胞裂解。
5.如权利要求I所述快速检测重组蛋白表达量的方法，其特征在于，步骤c)对印迹膜上的菌斑进行原位裂解后，将印迹膜晾干。
6.如权利要求1-5任一权利要求所述快速检测重组蛋白表达量的方法用于判断目标蛋白的表达与否或用于高表达量克隆的快速筛选的用途。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测重组蛋白表达量的方法。本发明将含有目标蛋白表达盒的载体转入表达菌株后涂布于平板培养基上并诱导蛋白表达，随后将平板上的克隆影印到印迹膜上，通过裂解步骤后，克隆中的蛋白固定至印迹膜上。随后利用针对表达载体上特定标签的抗体或针对目标蛋白的特异性抗体进行Western Blotting检测，检测信号的情况即反映了被影印的平板上克隆中的目标蛋白的表达情况。利用本发明提供的方法，可以根据检测信号快速从大量克隆中筛选到表达量高的克隆。
文档编号G01N33/577GK102654504SQ201210072148
公开日2012年9月5日 申请日期2012年3月18日 优先权日2012年3月18日
发明者李威, 李彬 申请人:生工生物工程(上海)有限公司
专业数控铣床产品供应商
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