专利名称：一种猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明属于兽医生物技术领域，涉及一种快速检测抗体技术，尤其涉及猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的检测试纸条，同时还涉及该试纸条的制备方法和应用方法。
背景技术：
猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)属圆环病毒科、圆环病毒属病毒。其中猪圆环病毒2型(PCV2)与猪多种疾病相关，主要引起断奶仔猪多系统衰弱综合症(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS), PCV2 感染猪只后，可以导致猪只机体免疫机能下降，从而容易导致其他疾病的继发或并发感染。因此，猪圆环病毒2型是一种严重威胁养猪业的病毒。我国自2001年以来，全国各地不断出现PCV-2感染病例的报道。为了更好的控制猪圆环病毒�。捅匦爰笆绷私獠⒄莆罩沓CV-2的感染情况，因此，开发建立一种可以对猪群进行PCV-2血清抗体检测快速有效的方法是十分必要的。目前已有的检测血清抗体的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA法)，在这种传统的检测方法中存在一些较难克服的缺点，比如=ELISA检测法步骤较为繁琐，检测所需时间较长；在检测中需要配合酶标仪进行使用，检测的专业人员也需要经过专业培训；整体所需花费较高；该方法还存在特异性不高稳定性差等特点。因此迫切的需要建立一种省时省力又可以迅速普及的检测方法。免疫胶体金技术是20世纪80年代继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术，目前已广泛应用于临床诊断，尤其是在医学临床检验中已广泛应用，具有种费用低、灵敏度高、速度快、使用便捷和易于普及等特点；单克隆抗体具有理化性状高度均一、生物活性单一、便于人为处理和质量控制等优点，特别是其具有与抗原结合特异性强的特点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测试纸条。本发明提供的检测试纸条，其包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，所述质控带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白单克隆抗体。其中，所述的支撑层优选为聚乙烯纤维板，更优选为聚氯乙烯板(Polyvinylchlorid PVC 板)其中，所述的加样垫优选为中速定性滤纸。其中，所述的金标抗体释放垫优选为玻璃纤维素膜，更优选为Rapid27 (美国Whatman)的玻璃纤维素膜。其中，所述的检测层优选为硝酸纤维素膜，更优选为FF85系列(美国Whatman)的硝酸纤维素膜。其中，所述的吸收层优选为玻璃纤维，更优选为玻璃纤维CF4 (美国Whatman)。本发明还提供一种制备所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤I)在检测层的不同位置上分别固定猪圆环病毒2型核衣壳蛋白以及猪圆环病毒2型核衣壳蛋白单克隆抗体，形成检测带和质控带；2)制备金标抗体释放垫；3)组装支撑层、加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层。其中，制备金标抗体释放垫包括如下步骤以1:10(Γ3000的标记比例将待标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白加入到ρΗ7. (ΓΙΟ. O胶体金溶液中，按1:1(Γ500的比例用含
O.r5%BSA的O. 00Γ0. lmol/L磷酸盐缓冲液(PB)稀释胶体金标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，将稀释后的胶体金标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白液按60μ L/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4°C低温真空干燥。其中，将包被浓度为0. rimg/mL,优选为0. 2^0. 8mg/mL,更优选为0. 5mg/mL的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白按I μ L/cm的速度喷于检测层上作为检测带，将包被浓度为
0.l 5mg/mL,优选为0. 5 2mg/mL,更优选为lmg/mL的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白单克隆抗体按I μ L/cm的速度喷于检测带下方的检测层上作为质控带，37°C下干燥30min，从而制备检测层。与传统的PCV2抗体检测方法相比本发明的试纸条具有明显的优越性特异性强，使用原核表达的Cap蛋白和其单克隆抗体，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中病毒的操作；操作简便快捷，本发明不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需IOmin极为迅速。
图I是PCV-2抗体胶体金试纸条侧面结构示意图，图中加样垫1，金标抗体释放垫2，检测层3，吸收层4，支撑层5，检测带6，质控带7。图2是PCV-2抗体胶体金试纸条正面结构示意图，图中A检测线与质控线均显现，为阳性样品检测结果；B质控线显现而检测线不显现，其为阴性样品检测结果；C质控线与检测线均不显现，为无效检测。图3是猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白PCR电泳结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1PCV-2核衣壳蛋白的表达与纯化(l)PCV-2 0RF2基因的提取与目的基因的扩增本胶体金试纸条选择的表达蛋白为猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白(Cap蛋白)，其对应的基因为0RF2，由此设计如下引物上游引物5，-GATATCATGACGTATCAAAGCAGG-3’
下游引物5’ -GTCGACCGTAGGGTTCAGAGGGGG-3 ’使用试剂盒(天根生化科技有限公司)提取PCV-2病毒的DNA作为PCR反应的模板。其PCR的50 ill反应体系组成为取PCR模板I yl，引物各I ill (浓度均为50mmol/L), 10XPCR buffer (含 MgCl2) 5 iiL，4 XdNTPs 4 y L (浓度均为 2. 5mmol/L)、Taq DNA 聚合酶 liiL，dd H2O 38 u L0 PCR 的反应条件为 94°C预变性 5min，94°C变性 40s，55°C退火 40s，72°C延伸45s，35个循环，然后72°C延伸7min。反应结束后取7 y LPCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳检验产物的大小。结果出现目的条带约为600bp，与目的条带609bp大小一致，如图3所示。电泳结束后，切下目的条带，按DNA凝胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)的操作步骤进行，将得到纯化的DNA置-20° C保存备用。 (2) PCR产物的连接、转化与鉴定将纯化的DNA连接pMD19-T载体，转化感受态大肠杆菌TG1，对转化菌进行蓝白斑筛�。粞“装撸琇B培养基培养并提取质粒，用PCR方法快速鉴定阳性克隆。阳性克隆质粒送北京博迈德生物公司测序。测序结果进一步验证了重组质粒的正确性。分别取pET_32a载体质粒及回收的PCR产物各20iiL，分别加入BamH I和Sal I酶各2.5 iiL，10 Xbuffer 5 y L，水15 y L，在37°C水浴反应3h，回收酶切产物。加入BamH I和Sal I酶切回收后的载体Iy L，PCR产物4 iiL，10 X buffer I y L，T4DNA连接酶I y L，水3 u L，16°C过夜连接。按常规方法制备JM109感受态细胞取连接产物5 u L，加入感受态细胞，42°C热激，冰上放置2min，加入无抗性培养基，震荡培养50min，取100 y L培养物涂布含卡那抗性的LB平板，37 °C过夜培养。挑取过夜生长的菌落，利用碱裂解法提取质粒，用BamH I, Xho I双酶切鉴定重组质粒，对阳性重组质粒进行进一步的PCR鉴定。PCR鉴定结果显示阳性，转化成功。(3)阳性重组菌的诱导表达挑取鉴定为阳性的重组菌接种于LB培养基上，过夜后转入三角瓶进行37°C培养至0D600 ^ 0. 5时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为I. 5mmol/L进行诱导表达，转入25°C培养6h。取出培养物，将重组菌超声裂解后的上清与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，阴性对照为只转化载体的JM109感受态细胞，考马斯亮蓝染色。电泳结果表明重组菌的裂解物沉淀和上清中均存在分子量约为30ku大小的条带，阴性对照中未见上述条带。⑷目的蛋白的纯化将诱导6h后的融合蛋白收获菌液，5000r/min离心lOmin，加入IOmL结合缓冲液，弃去上清后用IOmL的结合缓冲液重悬菌液，将样品置于冰浴中超声波裂解5s、间隔5s、超声至液体透明。然后10000r/min离心15min，去除细胞碎片，将上清液移入新管中。取上清液利用pET-32a载体带有的His-tag选择性标签应用Nitrogen公司说明书纯化蛋白。实施例2单克隆抗体的制备( I)动物免疫将纯化好的蛋白与弗氏完全佐剂等体积充分混匀乳化，小鼠腹腔注射，接种剂量50iig/只；14日后用同样纯化好的蛋白与弗氏不完全佐剂的乳化物注入小鼠腹腔；28日后，再次用同样的纯化蛋白与弗氏不完全佐剂的乳化物注入小鼠腹腔；最后一次不加佐剂的纯化蛋白加强免疫，三天后无菌取脾融合。(2)筛选方法的建立免疫后的小鼠分别在第21d、35d以及取脾脏前断尾采血，分离血浆，以获得阳性血清。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，用包被液做1:200、1:300、1:400、1:600、1:800稀释，加入酶标板，100 μ L/孔，振动平板以使抗原分布均匀。将包被的酶标板用塑料膜封好，4°C过夜，弃去ELISA板中液体，加入洗涤液(PBST溶液)250 μ L/孔，室温下洗3min，用干净吸水纸在桌面上轻轻拍干，反复洗涤三次。用5%脱脂奶粉以PBST稀释作为封闭液，力口入酶标板，100 μ L每孔。将包被的酶标板用塑料膜封好，37°C置2h。弃去ELISA板中液体，加入洗涤液(PBST溶液)250 μ L每孔，室温下洗3次每次3min。阳性血清为一抗，分别作1:50、1:80,1:100,1:150,1:200稀释，加入酶标板中，100 μ L/孔，同时设空白对照，37°C作用lh，洗涤三次，拍干。加入用5%脱脂奶粉1:8000稀释的HRP-兔抗鼠IgG，IOOuL每孔，37°C作用lh，洗涤三次，拍干。加底物溶液(TMB. H2O2)，100 μ L/孔，室温作用15min，加入终止液(2M H2SO4溶液)50 μ L/孔，在酶标仪上读取OD值。以阳性血清孔的OD值接近1.0，Ρ/Ν>2. O的抗原血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度，其分别为1:600和1:80。(3)细胞融合①分离脾细胞取加强免疫后三天的BALB/C小鼠，眼球摘除放血，分离血清供阳性抗体用；将小鼠颈椎脱臼处死，用75%酒精擦拭消毒后，移入超净工作台内，固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开皮肤和腹膜，无菌取出脾脏，放入己盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛有IOmL基础培养液的带铜网的平皿内，后用研磨器轻轻研磨，将平皿中脾细胞悬液转移到50mL离心管中，1000r/min离心lOmin，细胞沉淀用基础培养液同法离心洗涤一次，然后用培养液将细胞重悬至10 20mL，混匀，台盼蓝染色活细胞计数后备用。②制备骨髓瘤细胞融合前两周复苏骨髓瘤SP2/0细胞，并将骨髓瘤SP2/0细胞经8_AG选择培养。细胞复苏后，加入8-AG (20ug/mL)的DMEM完全培养液选择培养三代以上，以保持HGPRT缺陷型。融合当天，取生长状态良好的SP2/0细胞，用PBS缓冲液洗涤三次，将刚好处于对数生长期的细胞收集至离心管中，900r/min离心lOmin，弃去营养液，用基础培养液洗涤一次后将细胞重新悬�。ㄅ卫既旧赴剖严赴∈臀狪O6个/mL，放置离心管中备用。③细胞融合按常规方法融合，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量5: Γ10:1之间混合，加入5OmL的一次性无菌离心管内，1000r/min离心IOmin,弃上清,用无菌吸纸充分吸干残余液体，用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀，直至成糊状；将离心管置于37°C水的烧杯中，吸取37°C预热的50%聚乙二醇(PEG)溶液ImL在Imin内缓慢滴入，用在水浴上轻轻摇动离心管lmin，在Imin内缓缓滴入37°C预热的基础培养液lmL，边滴边转动离心管，随后在Imin内缓慢滴入37°C预热的基础培养液4mL，在随后的4min内加入补加基础培养液至30mL轻轻搅动离心管使PEG彻底稀释而失去融合作用。1000r/min离心IOmin,弃上清，、将细胞沉淀轻悬于含20%胎牛血清的预温HAT选择培养液40mL中，混合均匀，加入到已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100 u L，将培养板移至37°C，5% CO2培养箱中培养。(4)阳性孔克隆化并扩大培养阳性杂交瘤细胞用间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，采用有限稀释法对已鉴定的阳性杂交瘤细胞进行克隆化。融合后的细胞3d后观察，并每隔7d更换培养液一次，采用半换液方式。待杂交瘤细胞长满孔底1/3 1/2时，于换液I 2d后即可取细胞培养上清液IOOuL,不作稀释用融合蛋白30a-P97C包被的间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照，阳性鼠血清为阳性对照。将已检测为分泌阳性的特定孔中杂交瘤细胞集落吹起混匀，细胞用台盼蓝染色计 数，取上述细胞悬液，用含20 %胎牛血清的完全培养液稀释到ImL含10个细胞，将稀释好的细胞悬液100 u I加入到预先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。适时换液、筛选与克隆化，同时每次将克隆化剩余细胞进行扩大培养冻存。经过2-3次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(5)动物接种及单抗腹水的粗提在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前I周，先给8 12周龄雌性BALB/C小鼠每只腹腔注射0. 5mL液体石蜡。将培养的杂交瘤细胞从细胞培养瓶中冲洗下来，1000r/min离心5min，再用PBS缓冲液(pH7. 2)悬浮离心洗涤2次，台盼蓝染色做活细胞计数后将细胞密度数调至f 2X IO6个/mL，每只小鼠腹腔注射0. 5mL细胞悬液，约含5 10X IO5个细胞。接种后注意观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大，行动不便时，用碘酒棉球消毒下腹部皮肤后，可用20mL注射器针头刺入腹腔，可见有淡黄色的腹水滴出，用无菌离心管收集，4°C放置过夜，3000r/min离心5min,去除油脂沉淀,上清即为腹水,分装标记后，_80°C保存；间隔2 3d，待腹水再生积聚后，同法再�。恢恍∈罂沙槿�2 3次。采用硫酸铵沉淀法进行单抗的粗提。取5mL小鼠腹水，4°C 10000 r/min,离心15min，除去细胞碎片及其他杂质；将上清液移入小烧杯中，压泵缓慢滴加饱和硫酸铵(pH7. 8) 2. 5mL,边加边搅拌；搅拌30min后，10000r/min离心15min,弃上清；沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬�。涟枳饔�30min,同法离心。沉淀物溶于ImL的PBS中，装入透析带内，4°C透析过夜，其间换液3 4次，直至检测不到NH4+和SO广。移出蛋白质溶液，10000r/min离心15rain，收集上清即为粗提的单抗。紫外分光光度计测蛋白含量，分装，一 80°C保存备用。实施例3PCV-2抗体胶体金试纸条的制备( I)胶体金标记抗原蛋白以柠檬酸钠还原法制备金溶液在50ml沸腾的0. 04%氯金酸水溶液中加入2ml的I. 5%柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热直至溶液呈稳定而透亮的红色。在透射电镜下观察胶体金溶液，发现胶体金颗粒其大小均一，无椭圆形或者其他不规则形状，说明已获得了稳定胶体金。以0. lmol/L的K2CO3调节胶体金pH值在7 10之间，以1:1000^2000的标记比例将待标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白加入到调节好pH值的胶体金溶液中，静置IOmin后，加入20%聚乙二醇(PEG) 10000至最终浓度为0. 05%，4°C下2000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4°C下15000r/min离心40min后弃去上清获得胶体金标记好的Cap蛋白，用丙烯葡聚糖S-400层析柱分离纯化后4°C下短期保存。(2)试纸条各层材料的选择与制备发明设计的试纸条基本结构为支撑层、加样层、检测层与吸收层。将各层按以下顺序粘贴将检测层粘贴在支撑层上；将加样塾粘在金标抗体释放塾上组成加样层，由金标抗体释放垫连接在靠近检测层的检测线一端，边缘附在检测层上，定义为始端；把吸收层粘贴在检测层上靠近质控线的一侧，定义为末端。①将GF/C滤纸、中速定性滤纸和GF-9型滤纸三种滤纸折叠成漏斗状置于IOml小烧杯中，把离心后的空白猪血浆Iml滴入滤纸中央，通过比较其各自的过滤速度及过滤后血浆的澄清度后发现，中速定性滤纸的过滤速度最快，且澄清度与其余两支相近。选择中速 定性滤纸作为加样层的加样垫材料。②NC膜的三种备选材料为FF85 (美国Whatman)、AE100 (美国Whatman)和Vividl70(美国PALL)。经不断摸索后发现，FF85系列的流速适中满足本发明需求而被选用。选定Cap蛋白三个包被浓度为O. 2,0. 5和O. 8mg/mL，选定单克隆抗体的三个包被浓度为O. 5、I和2mg/mL。用喷膜机按I μ L/cm的速度将两种蛋白喷于硝酸纤维素膜上,通过交叉试验，结果显示Cap蛋白的包被浓度为O. 5mg/ml、其单克隆抗体的包被浓度为Img/ml时，在FF85上红色印记最明显。③将O. 01mol/L PB (含1%BSA)稀释1:200倍的金标蛋白分别滴加在Glass24(美国 Whatman)、Glass33 (美国 Whatman)、Rapid27 (美国 Whatman)和 Ahlstrom8964 (芬兰Ahlstrom)四种释放垫备选材料上，37°C下烘干Ih后，粘贴在标记好检测线和质控线的NC膜上，滴加100 μ L生理盐水在释放垫上比较其金标抗体的释放速度，结果发现使用Rapid27质控线在7min35sed时显色,其它的显色时间均大于8min,因此优选Rapid27作为释放垫的材料。用O. 01mol/L PB (含 1%BSA)稀释 1:100、1:200、1:300 和 1:400 倍的金标蛋白滴加在Rapid27，按60 μ L/cm2的体积均匀喷于金标垫上，37°C下烘干Ih后，粘贴在标记好检测线和质控线的NC膜上，滴加100 μ L生理盐水在释放垫上比较其质控线的显色深浅，结果如下
权利要求
1.ー种猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，其特征在于，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，所述质控带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白单克隆抗体。
2.如权利要求I所述的检测试纸条，其特征在于，所述的支撑层为聚氯こ烯板。
3.如权利要求I所述的检测试纸条，其特征在于，所述的加样垫为中速定性滤纸。
4.如权利要求I所述的检测试纸条，其特征在于，所述的金标抗体释放垫为玻璃纤维素膜。
5.如权利要求I所述的检测试纸条，其特征在于，所述的检测层为硝酸纤维素膜。
6.如权利要求I所述的检测试纸条，其特征在于，所述的吸收层为玻璃纤维。
7.ー种制备权利要求1飞任一项所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤 1)在检测层的不同位置上分別固定猪圆环病毒2型核衣壳蛋白以及猪圆环病毒2型核衣壳蛋白单克隆抗体，形成检测带和质控带； 2)制备金标抗体释放垫； 3)组装支撑层、加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在干，制备金标抗体释放垫包括如下步骤以1:100^3000的标记比例将待标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白加入到pH7. (TlO. 0胶体金溶液中，按1:10飞00的比例用含0. r5%BSA的0. 001 0. lmol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，将稀释后的胶体金标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白液按60y L/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4°C低温真空干燥。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，将包被浓度为0.rimg/mL的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白按I U L/cm的速度喷于检测层上作为检测带，将包被浓度为0. r5mg/mL的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白单克隆抗体按I U L/cm的速度喷于检测带下方的检测层上作为质控�。�37°C下干燥30min，从而制备检测层。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的包被浓度为0.2^0. 8mg/mL,猪圆环病毒2型核衣壳蛋白单克隆抗体的包被浓度为0. 5 2mg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，所述质控带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白单克隆抗体。本发明的试纸条特异性强，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中病毒的操作；操作简便快捷，本发明不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需10min极为迅速。
文档编号G01N21/78GK102735680SQ201210231818
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者于倩倩, 汤波, 王洪彬, 王美君, 王贵华, 赵亚荣, 陈义锋 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司
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