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专利名称：Cyp450酶亚型生物质谱绝对定量方法
技术领域：
本发明属于蛋白质组学技术领域，涉及一种同时测定人的4种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法。
背景技术：
P450酶是体内重要的药物代谢酶。P450酶对药物进行代谢的同时，药物也可对 P450酶产生诱导或抑制作用。其中CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5四种P450酶参与了约 85%左右药物体内代谢过程。P450酶定性和定量分析对于评价药物的代谢过程和药物相互作用具有重要的参考价值和意义。现有P450酶定量分析方法主要有探针药物法，Western Blot法，以及mRNA检测法等。然而上述方法专属性差，灵敏度低，只能给出P450酶相对量， 并不能给出P450酶绝对含量，无法满足药物对P450酶作用评价的要求。第一，P450酶超家族多属于同工酶，其底物常常具有交叉现象，很难找到P450酶绝对专一的探针药物，至今只有极少数P450酶底物的专一性得到了全面的验证。第二，P450酶特别是亚家族内同工酶序列存在高度同源性，这为Western Blot法中所需特异性抗体的制备和纯化提出了很高的要求。第三，蛋白质的表达受到多种机制的调控，利用mRNA表达的水平代表其对应的蛋白含量并不十分可靠。因此，建立一种P450酶亚型绝对定量方法是十分必要的。

发明内容
本发明要解决的技术问题是，建立一种可以同时测定人的4种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法。涉及的4种CYP450酶亚型是CYP1A2，CYP2B6, CYP3A4, CYP3A5。本发明采取的技术方案是，选取经胰酶水解CYP450酶获得的特异性肽段，其中特异性是指肽段是产生此肽段的酶所特有的，其他蛋白质经胰酶水解并不能产生该肽段。基于液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)，利用多重反应监测(MRM)模式对特异性肽段及其稳定同位素标记肽段进行扫描分析，建立特异性肽段稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法。鉴于同种元素不同稳定同位素之间质谱响应相同，因此可利用对于蛋白样品中添加的稳定同位素标记肽段作为标准肽段进行定量分析建立标准曲线，从而实现特异性肽段的定量。每种酶亚型选取3种特异性肽段代表其本身浓度水平，即将肽段浓度取平均值得到相应CYP450酶亚型浓度，经由蛋白浓度校正获得CYP450酶亚型绝对含量。采取上述方法即可实现利用正常肽段定量CYP450酶亚型水平。正常肽段即是待测肽段。本发明的具体技术方案如下所述。一种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，涉及4种CYP450酶亚型CYP1A2、 CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5 ；具体步骤如下A、蛋白样品预处理(1)蛋白样品的还原，①于聚乙烯管中加入100μ 1蛋白样品，②加入5 μ 1变性剂，涡流混勻，
③加入10 μ 1还原剂，涡流混勻，④60°C孵育1小时，得到反应液；(2)半胱氨酸的封闭，于反应液中加入5 μ 1半胱氨酸封闭剂，涡流混勻；室温孵育IOmin ；(3)蛋白样品的胰酶消化，经半胱氨酸封闭的反应液中加入100 μ 1消化缓冲液，再加入10 μ 1胰酶溶液，涡流混合，37°C孵育12 16小时得到蛋白样品反应液；B、标准曲线制备①利用肽段稀释液将稳定同位素标记肽段标准品溶解至500fmol/ μ 1，得到稳定同位素标记肽段储备液；②利用蛋白样品反应液将稳定同位素标记肽段储备液分别稀释至5、10、30、100、 300fmol/y 1 ；③取10 μ 1进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以稳定同位素标记肽段浓度为横坐标，稳定同位素标记肽段峰面积为纵坐标，用加权W = 1/χ2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线；C、蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定取经由A步骤处理后的蛋白样品反应液10 μ 1进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将肽段峰面积代入标准曲线，求得肽段浓度，此肽段是指选取的3种胰酶水解 CYP450酶亚型得到的肽段；将3种肽段浓度取平均值，即为对应CYP450酶亚型浓度；经样品蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度除以蛋白浓度，得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量；所述的B步骤标准曲线制备及C步骤蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定，色谱条件为=Agilent 1100型液相色谱系统；色谱柱ρ印tide C18柱， 50mmX2. Imm I. D. ,5 μ m粒径；流动相含体积百分数占0. 1 %甲酸的水和含体积百分数占 0. 甲酸的乙腈，梯度洗脱；柱温30°C ；流速0. 7ml/min;进样量10 μ 1 ；质谱条件为ΑΡΙ 4000型三重四极杆液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst 1. 3数据处理软件；离子源电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压4000V ；温度550°C ；源内气体1 氮气压力55psi ；气体2 氮气压力60psi ；气帘气体氮气压力25psi ；扫描方式为多重反应监测；各肽段离子对及其相应DP、CE以及CXP值见表 1 ；表1肽段多重反应监测设定值
权利要求
1. 一种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，涉及4种CYP450酶亚型CYP1A2、 CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5 ；具体步骤如下A、蛋白样品预处理(1)蛋白样品的还原，①于聚乙烯管中加入100μ 1蛋白样品，②加入5μ 1变性剂，涡流混勻，③加入10μ 1还原剂，涡流混勻，④60°C孵育1小时，得到反应液；(2)半胱氨酸的封闭，于反应液中加入5μ 1半胱氨酸封闭剂，涡流混勻；室温孵育IOmin ；(3)蛋白样品的胰酶消化，经半胱氨酸封闭的反应液中加入100 μ 1消化缓冲液，再加入10 μ 1胰酶溶液，涡流混合，37°C孵育12 16小时得到蛋白样品反应液；B、标准曲线制备①利用肽段稀释液将稳定同位素标记肽段标准品溶解至500fmol/y1，得到稳定同位素标记肽段储备液；②利用蛋白样品反应液将稳定同位素标记肽段储备液分别稀释至5、10、30、100、 300fmol/y d ；③取10μ 1进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以稳定同位素标记肽段浓度为横坐标，稳定同位素标记肽段峰面积为纵坐标，用加权W = 1/χ2最小二乘法进行回归运算， 求得的直线回归方程，即为标准曲线；C、蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定取经由A步骤处理后的蛋白样品反应液10 μ 1进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将肽段峰面积代入标准曲线，求得肽段浓度，此肽段是指选取的3种胰酶水解CYP450 酶亚型得到的肽段；将3种肽段浓度取平均值，即为对应CYP450酶亚型浓度；经样品蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度除以蛋白浓度，得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量；所述的B步骤标准曲线制备及C步骤蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定，色谱条件为Agilent 1100型液相色谱系统；色谱柱p印tide C18柱，50mmX2. Imm I.D.，5 μ m粒径；流动相含体积百分数占0. 甲酸的水和含体积百分数占0. 甲酸的乙腈，梯度洗脱；柱温300C ；流速0. 7ml/min ；进样量10 μ 1 ；质谱条件为ΑΡΙ 4000型三重四极杆液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst 1. 3数据处理软件；离子源电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压 4000V ；温度550°C ；源内气体1 氮气压力55psi ；气体2 氮气压力60psi ；气帘气体氮气压力25psi ；扫描方式为多重反应监测；各肽段离子对及其相应DP、CE以及CXP值见表1 ；表1肽段多重反应监测设定值
2.根据权利要求1所述的CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，其特征在于，所述的变性剂，是重量体积比为20%的正-辛基谷氨酸溶液；所述的还原剂，是50mM的三(2-甲酰乙基)膦溶液；所述的半胱氨酸封闭剂，是200mM的甲基甲烷硫代磺酸盐溶液；所述的消化缓冲液，是0. IM的三羟甲基氨基甲烷与4mM氯化钙的混合溶液；所述的胰酶溶液，是5mg/ ml的胰酶溶液；所述的肽段稀释液，是按体积百分数20%乙腈与0. 三氟乙酸的混和溶液。
3.根据权利要求1或2所述的CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，其特征在于，所述的色谱条件中梯度洗脱，程序见表2，表2梯度洗脱程序
4.根据权利要求1所述的CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，其特征在于，样品测定期间利用质量控制样品对方法进行验证；所述的质量控制样品按照如下步骤制备①利用肽段稀释液将稳定同位素标记肽段标准品溶解至500fmol/y1，得到稳定同位素标记肽段储备液；②利用蛋白样品反应液将稳定同位素标记肽段储备液分别稀释至10、100、300fmol/μ ；③标准肽段每浓度取三个样本，根据标准曲线，得出标准肽段浓度，计算质量控制样品准确度。
全文摘要
本发明的CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，属于蛋白质组学技术领域。本发明基于LC/MS/MS，利用CYP450经胰酶水解产生的特异性肽段定量酶的策略，实现了同时对肝微粒体等体系中4种CYP450酶亚型CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5的绝对定量。本发明主要包括如下步骤蛋白样品预处理、标准曲线的制备、蛋白样品的测定以及质控样品的制备。本发明的方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、精密、可靠，可用于药物代谢及药物相互作用的评价。
文档编号G01N30/06GK102175804SQ20101061366
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者何群, 史美云, 孙严彤, 张芸辉, 曾苏, 杨艳, 蒋惠娣, 顾景凯 申请人:吉林大学