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专利名称：H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术检测技术领域，特别涉及烟草青枯病抗性检测技术领域，具体是指一种H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。
背景技术：
烟草青枯病是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一，目前在中国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。目前该病造成的损失已居各类病害的第4位，因此，寻找有效的防治青枯病的方法和培育具有青枯病抗性的烟草品种是当前植物病理学和育种学研究的重要方向之一。到目前为止，防治烟草青枯病最好的方法是利用抗病杂交品种。据统计至2011年底，在世界范围内种植的烟草品种已达2000份以上，其中主栽品种超过400份。所以，如何对这些烟草品种的青枯病抗病性进行合理的筛选并评价这些宝贵的种质资源、最后应用这些资源以培育出对青枯病高抗的烟草品种具有十分重要的意义。因此，为筛选和培育的目的而进行研究和开发在烟草青枯病抗性品种中高表达的基因和/或蛋白质具有重要意义。本领域迫切需要新的在烟草青枯病抗性品种中高表达的基因和/或蛋白质。蛋白质烟草H3型组蛋白(Histone H3)的NCBI登录号为gi | 3273350 |，Uniport登录号为A7VMF1。H3型组蛋白是组成真核细胞染色体核小体主要成分之一，一个核小体由两个H2A，两个H2B，两个H3，两个H4组成的八聚体和147bp缠绕在外面的DNA组成。研究表明，这些组成成分的核心部分状态大致是均一的，游离在外的N-端则可以受到各种各样的修饰，包括组蛋白末端的乙酰化，甲基化，磷酸化，泛素化等等。所以组蛋白的修饰与基因表达调控有关。目前研究发现组蛋白是不可缺少的动态转录调控成分，会发生许多组蛋白翻译后的共价化学修饰，包括乙酞化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化及ADP-核糖基化等，这些修饰通常发生于组蛋白的氨基端尾部，它们通过改变组蛋白-DNA和组蛋白-组蛋白的相互作用而引起染色质的结构和功能变化，影响基因表达并且这种影响取决于氨基末端被修饰的位点。在四种核心的组蛋白中，H3似乎拥有较多的修饰位点，这些调控涉及到基因调控和染色质组装等过程。组蛋白H3系列蛋白已经被报导存在于很多植物中，然而它们的表达模式和在很多研究常用植物中的拷贝数现在还不是很清楚。有文献报道，H3型组蛋白可能与水胁迫有关，水能够调节水稻H3，小麦H3与一个与盐胁迫相关的蛋白WAFl相互作用。水稻根部的RH13. 2基因在盐胁迫下表达量增加。到目前为止，还没有蛋白质烟草H3型组蛋白与烟草青枯病有关的报道
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明的目的是提供一种H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用，该H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了 一种H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用。较佳地，所述H3型组蛋白作为烟草青枯病抗性蛋白标志物。较佳地，所述H3型组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本发明的第二方面，提供了 一种抗H3型组蛋白抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。本发明的有益效果在于1、本发明可以通过H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用，从而可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。2、本发明还可以通过抗H3型组蛋白抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用，从而可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。


图1是H3型组蛋白的免疫印迹分析结果图。其中A为采用肌动蛋白Actin抗体对内源Actin进行免疫印迹的结果图，B为采用鼠源H3型组蛋白单克隆抗体对H3型组蛋白进行免疫印迹的结果图，1，2，3均为抗病品种DBlOl的蛋白质样品，4，5，6均为感病品种红花大金元的蛋白质样品。
具体实施例方式本发明的原理为通过筛选在烟草青枯病抗性品种以及烟草青枯病感病品种中差异表达的蛋白质，申请人找到了一种在抗性品种和感病品种中存在差异表达的蛋白质(在抗性品种中上调表达)，经质谱鉴定为H3型组蛋白。用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags forrelative and absolute quantification, iTRAQ)蛋白质组学方法，使用稳定同位素标记不同抗性烟草品种叶片蛋白质酶解之后的肽段，通过鸟枪法(shotgun)技术，结果发现蛋白质H3型组蛋白在烟早青枯病抗性品种中上调表达。免疫印迹实验进一步证实蛋白质烟草H3型组蛋白的确在不同烟草青枯病抗性品种中存在差异表达。基于蛋白质烟草H3型组蛋白与烟草青枯病抗性的这种相关性，本发明首先提供了蛋白质烟草H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用。如果蛋白质烟草H3型组蛋白在待检烟草品种中呈上调表达，则提示该待检烟草品种对青枯病具有较高的抗性。另外，本发明还提供了烟草H3型组蛋白的抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、烟早青枯病抗性品种DBlOl及感病品种红花大金兀蛋白质样品的制备
本实施例中所使用的三氯乙酸(TCA)、丙酮、盐酸均购自国药公司；二硫苏糖醇(DTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)均购自BioRad公司。SDT裂解液(4%SDS, ImM DTT, 150mM Tris-HCl ρΗ8· O)。本实施例以TCA-丙酮以及SDT裂解的方法制备烟草叶片蛋白质样品。具体如下分别取青枯病抗性品种DBlOl和感病品种红花大金元各3株在相同的条件下进行培养，在出苗65天后取所有叶片，立即在清水中洗净，吸水纸吸干水分，然后用铝箔纸包裹，于-80°C冰箱备用。称取1. 2g左右叶片，用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，力口Λ 25ml TCA/丙酮(1:9)，65mM DTT，-20°C沉淀 I 小时。离心 lOOOOrpm，45 分钟，去除上清。沉淀加入25ml纯丙酮，_20°C沉淀I小时，离心lOOOOrpm，45分钟，去除上清。沉淀加入25ml纯丙酮，_20°C沉淀I小时，离心lOOOOrpm，45分钟，去除上清。空气干燥，粉末_80°C保存。取0. 5g粉末于1.5mL离心管中，加入ImL SDT裂解液中，沸水浴5min，再进行超声处理(80w，超声10s，间歇15s，共10次)沸水浴5min，超声后样品再次进行沸水浴5min，最后进行离心，12000g, 20°C离心Ih,取上清。上清浓度测定采用BCA protein assay reagent(Beyotime碧云天)进行总蛋白定量，定量结果见表I。制备好的蛋白质样品进行分装，-80°C保存备用。取制备好的DB101和红花大金元共6个蛋白质样本各100 μ g充分混匀成并制作成内标(IN);后续的实验中内标用IS表示，DB101样本用D表示，红花大金元样本用H表示。表16例样本的蛋白质定量结果
权利要求
1.H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述H3型组蛋白作为烟草青枯病抗性蛋白标志物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述H3型组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO 1所示。
4.抗H3型组蛋白抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用。较佳地，所述H3型组蛋白作为烟草青枯病抗性蛋白标志物。较佳地，所述H3型组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明还涉及一种抗H3型组蛋白抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。本发明的H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。
文档编号G01N33/68GK103018466SQ201210580018
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者宋浩, 丁伟, 陈薇, 周燕 申请人:上海中科新生命生物科技有限公司, 湖南中烟工业有限责任公司