专利名称：同时测定对克里西丁磺酸及其含原料量的反相离子对色谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及液相色谱分析对克里西丁磺酸和对克里西丁含量的方法。具体地说，是采用反相离子对色谱法同时测定对克里西丁磺酸工业品中对克里西丁磺酸和对克里西丁含量的方法。
背景技术：
对克里西丁磺酸(4-Amino-5-methoxy-2-methylbenzenesulfonic acid，p-Cresidinesulfonic acid，PCSA)是一种合成染料及有机染料的中间体，也可用于合成食品染料。对克里西丁磺酸由对克里西丁(2-Methoxy-5-methylaniline，p-Cresidine)经磺化制得，故对克里西丁磺酸工业产品中常含有原料对克里西丁。对克里西丁具有一定的环境和生物影响作用，近年来许多动物性研究已经证明它有致癌作用。接触对克里西丁会刺激皮肤和眼睛；呼吸一定量会刺激鼻子和喉咙；大量摄入会扰乱血液运输氧气的能力从而导致头疼、疲惫、头晕以及皮肤和嘴唇呈蓝色；更高的量会导致呼吸困难甚至死亡。所以控制对克里西丁磺酸中对克里西丁的含量非常重要。而对克里西丁磺酸的测定一般采用经典的重氮滴定法，手续繁琐，操作复杂，且无法区分对克里西丁磺酸和对克里西丁。虽然可以用高效液相色谱法(HPLC)[参见Stancer，A；Jeretin，B.Zb.Ref.Posvetovanja Slov，Kem Dnevi，1998，35-43；陈笑梅，郑自强，施旭霞，高效液相色谱多波长定性方法研究，色谱，1999，17(2)，178-181]以及气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[参见肖前，郑建国，翟翠萍，GC-MS特征质量离子分析法在禁用偶氮染料检验中的应用，分析测试学报，1999，18(2)，32-35]等技术来测定对克里西丁，但尚未见测定对克里西丁磺酸中对克里西丁含量的报道。
发明内容
我们建立了反相离子对色谱的方法，可以同时测定对克里西丁磺酸工业品中对克里西丁磺酸和对克里西丁的含量，结果令人满意。
本发明的技术方案如下一种同时测定对克里西丁磺酸及其原料含量的液相色谱法，其特征是采用反相离子对色谱法，高效液相色谱条件为色谱柱C18，5μm，150×4.6mm(I.D.)，
流动相组成体积比甲醇∶四丁基氯化铵溶液(TBAC1，10mM水溶液)∶水＝40∶35-44∶25-16，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长287nm，进样量10μL。
上述的同时测定对克里西丁磺酸及其原料对克里西丁含量的液相色谱法，在测定主成分对克里西丁磺酸含量时，进样的浓度是测定残存原料对克里西丁含量时进样浓度的十分之一。
采用本发明的同时测定对克里西丁磺酸及其原料含量的液相色谱法能将对克里西丁磺酸工业品中对克里西丁磺酸、对克里西丁及杂质1用液相色谱法分离。对克里西丁磺酸和对克里西丁两者的出峰能达到基线分离，杂质1和对克里西丁磺酸两者的出峰也能达到基线分离，进而测定出对克里西丁磺酸和对克里西丁的含量。该方法的重复性好、误差率�。僮骷虮�、快捷。为严格控制产品质量，包括其中有害成分的残留，提供了简单且准确可靠的方法。
图1为不同浓度离子对试剂条件下溶质保留因子的变化。
图2为对克里西丁磺酸的标准曲线。
图3为对克里西丁的标准曲线。
图4为对克里西丁磺酸工业品中对克里西丁磺酸含量测定的液相色谱图。
图5为对克里西丁磺酸工业品中对克里西丁含量测定的液相色谱图。
图4和图5中1为杂质峰，2为对克里西丁磺酸峰，3为对克里西丁峰。
具体实施例方式
仪器及色谱条件Varian 5060型高效液相色谱仪，配有Rheodyne 7725i六通进样阀，Waters 486型紫外-可见分光光度检测器；大连江申分离科学技术公司JS-3050色谱工作站；四川仪表厂Type3066笔式记录仪。Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪，996型二极管阵列(PDA)检测器。
色谱柱选用的是Kromasil C18(江苏汉邦科技股份有限公司)，5μm，150×4.6mm(I.D.)。流动相甲醇-四丁基氯化铵(TBAC1，10mM)-水，40∶43∶17(体积比)；流速1.0mL/min；柱温30℃，检测波长287nm；灵敏度0.2aufs。
试剂与药品对克里西丁磺酸及对克里西丁对照品由中国化工建设江苏公司提供；甲醇(HPLC级)购自江苏汉邦科技股份有限公司；实验中流动相和溶液用水均为二次石英蒸馏水；TBAC1(50％)；氢氧化钠(1％)实施例1.色谱条件的选择1.1流动相对克里西丁磺酸在流动相中会离解为亲水性的磺酸根离子，在反相键合相色谱中没有保留，需要采用离子对试剂进行分离。我们选择离子对试剂TBAC1，利用季铵盐与磺酸根离子形成疏水性的离子缔合物，来增加对克里西丁磺酸的保留值。再通过改变流动相中的甲醇的比例以及TBAC1的浓度，选择实现最佳分离的流动相条件。
实验结果显示，当流动相中不加TBAC1时，对克里西丁磺酸在死时间时出峰，且保留时间不随甲醇比例的下降而延长。随着TBAC1浓度的增加，对克里西丁磺酸的保留逐渐增强，并在3.0mM后趋于稳定，但当TBAC1的浓度低于3.5mM时杂质1的峰与对克里西丁磺酸的峰交叠。尽管对克里西丁的保留时间不随TBAC1浓度的变化而变化，但当TBAC1浓度大于4.4mM时，对克里西丁的峰形严重展宽，无法定量。因此，要同时测定对克里西丁磺酸和对克里西�。琓BAC1的浓度应该选择在3.5-4.4mM范围内。
从图1中还可以出，杂质1的保留行为的变化规律与对克里西丁磺酸相似，且在不加入TBAC1的情况下与对克里西丁磺酸无法分离，因此杂质1很可能是对克里西丁磺化过程中得到的另一种磺酸副产物。
同样我们也比较了在流动相中TBAC1的浓度相同情况下，不同甲醇比例的情况，发现甲醇比例过高或者过低都不利于分离测定。最终选择了40％的甲醇比例作为实验条件。
在流动相条件选择实验中我们还尝试加入pH＝7的NHAc-NH4OH缓冲盐溶液进行调节，试图改善色谱峰的峰形。在没有TBAC1存在的情况下，在流动相中加入缓冲盐，对克里西丁磺酸出峰时间与死时间接近，且与杂质1无法分开；在TBAC1存在的情况下，加入缓冲盐，对克里西丁的峰形没有明显改善，但对克里西丁磺酸的峰出现分叉，所以流动相中加入缓冲盐是不合适的。
1.2检测波长用二极管阵列检测器在200-400nm进行连续扫描，可知对克里西丁磺酸与对克里西丁均在287nm处有最大吸收，因此选择检测波长为287nm。
1.3样品浓度为了兼顾主成分含量与其中杂质含量的测定，在测定杂质时，样品的浓度必须较大，足以使杂质能够出峰；测定主成分含量时，溶液浓度太大会导致主峰超线性畸变而使定量不准，故将样品稀释10倍后测定，试验准确度令人满意。
实施例2.标准曲线的制作溶剂A的配制对克里西丁磺酸必须加入强碱才能溶解，因此按甲醇-氢氧化钠(1％)-水40∶43∶17(体积比)的比例配制溶剂A，此配制比例与流动相比例相近。
标准溶液的配制准确称取25.00mg对克里西丁磺酸与对克里西丁对照品，分别置于25mL容量瓶中，用溶剂A溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.0mg/mL的标准储备液，分别精密移取适量储备液，用溶剂A逐级稀释成系列标准溶液。
在对克里西丁磺酸标准溶液浓度0.0001～0.8mg/mL范围进行实验，取标准溶液10μL进样，以峰面积对浓度作图(见图2)，在0.0005～0.8mg/mL的范围内成线性，回归方程为APCSA(area)＝6937.74381+7.98117E7 CPCSA，r＝0.9999。对浓度为0.1mg/mL的对克里西丁磺酸标准溶液重复进样5次，峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.84％。
在对克里西丁标准品溶液浓度0.0001～0.1mg/mL范围进行实验，取标准溶液10μL进样，以峰面积对浓度作图(见图3)，在0.0002～0.08mg/mL浓度范围内成线性，回归方程为Ap-Cresidine(area)＝-60016.43095+1.19419E8 Cp-Cresidine，r＝0.9996。对浓度为0.006mg/mL的对克里西丁标准溶液重复进样5次，峰面积的RSD为0.91％。
当信噪比S/N＝3时，测得对克里西丁磺酸、对克里西丁的最低检测限均为0.0001mg/mL。
实施例2.样品测定2.1主成分含量的测定样品溶液的制备称取约10mg对克里西丁磺酸试样，置于10mL容量瓶中，加10mL溶剂A溶解，定容至刻度，摇匀。再移取1.0mL上述溶液置于10mL容量瓶中，加溶剂A至刻度，摇匀备用。
同一份样品溶液重复进样5次，每次进样量为10μL，测定其峰面积(见图4)，用外标法计算含量，对克里西丁磺酸的平均含量为86.30％，RSD为0.59％。取同一批供试样品6份，按上述方法配制样品溶液，并按所述测试条件测定，对克里西丁磺酸的平均含量为86.29％，RSD为0.71％。
2.2杂质含量的测定样品溶液的制备称取约10mg对克里西丁磺酸试样，置于10mL容量瓶中，加溶剂A溶解，再定容至刻度，摇匀备用。
同一份样品溶液重复进样5次，每次进样量为10μL，测定其峰面积(见图5)，用外标法计算含量，平均含量为0.412％，RSD为0.84％。取同一批供试样品6份，按上述方法配制样品溶液，并按所述测试条件测定，平均含量为0.405％，RSD为2.51％。
权利要求
1.一种同时测定对克里西丁磺酸及其原料含量的液相色谱法，其特征是采用反相离子对色谱法，高效液相色谱条件为色谱柱C18，5μm，150×4.6mm(I.D.)，流动相组成体积比甲醇∶10mM四丁基氯化铵水溶液∶水＝40∶35-44∶25-16，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长287nm，进样量10μL。
2.根据权利要求1所述的同时测定对克里西丁磺酸及其原料含量的液相色谱法，其特征是在测定主成分对克里西丁磺酸含量时，进样的浓度是测定杂质含量时进样浓度的十分之一。
全文摘要
一种同时测定对克里西丁磺酸及其原料含量的液相色谱法，其特征是采用反相离子对色谱法，高效液相色谱条件为色谱柱C
文档编号G01N30/02GK1560622SQ200410014129
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月23日 优先权日2004年2月23日
发明者练鸿振, 李丹妮, 王惟汉 申请人:南京大学
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