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专利名称：细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方 法，属于生物技术领域。
背景技术：
荧光显微镜观察与计数是细菌活的非可培养状态(Viable but Non-culturable， VBNC)研究所用的最基本的技术手段。目前，国内外用 于VBNC细菌荧光观察与计数的现有技术主要源自于Hobbie等人于1977 年在《应用与环境微生物学》上发表的一篇题为"利用核孔滤膜进行细 菌荧光计数"的文章。该技术的一大亮点就是利用聚碳酸酯核孔滤膜替 代纤维素微孔滤膜，用于细菌总菌数的测定。同时还利用吖啶橙和萘啶 酮酸对细菌核染，用以区分细菌的"死"与"活"。除此之外，该项技术 所涉及的材料还包括伊拉克黑、甲醛、可换膜针头式滤器等。其具体技 术措施如下。首先，在适当浓度的稀释液中加入终浓度为0.001%的萘啶 酮酸和0.025%酵母膏，37'C培养16h — 24h，随后加入2%甲醛固定(终浓 度)，而后再加入O. ly。的吖啶橙溶液染色3min。将稀释液中的细菌过滤 到直径25mm孔径0.2um的核孔滤膜上。为消除滤膜本身的荧光，滤膜先 用0. 2%伊拉克黑的2%醋酸溶液染色24h。最后将滤膜放在载玻片上滴一 滴无自发荧光的香柏油，在油上盖一张盖玻片，在盖玻片上再滴加一滴 无自发荧光的香柏油，于落射荧光显微镜下进行观察计数。通过上述方
法，细菌总数能被客观地计数出来，并且活菌与死菌也能被明显地区分
开来。因此，该技术在VBNC细菌研究领域中被广泛应用。但是随着VBNC 研究范围的不断扩大，具有VBNC性质的细菌种类也越来越多，已不局限 于当初发现的16个种属的30多种细菌。不但革兰氏阴性病原菌存在VBNC 状态，革兰氏阳性益生菌也存在；不但水中细菌存在，土壤、空气、动 植物体内细菌也存在。那么此项技术在该领域研究中也显现出了储多不 利方面，存在着一定的局限性。归纳其技术缺点如下(l)操作繁琐，耗 费时间，不利于VBNC细菌的快速检测。 一般地，在观察VBNC细菌时， 需用萘啶酮酸抑制细菌生长16h — 24h。 (2)适用范围窄，仅对革兰氏阴 性菌适用，而对革兰氏阳性则不适用。(3)不能真实反映活菌数量。经吖 啶橙染色，呈现橙黄或橙红色荧光的菌体难于有效确定是活菌还是死菌。 (4)所用材料种类多，且取材不便。例如，伊拉克黑是在印染工业中所使 用的一种黑色染料，但在国内各大生化及生物公司却很少销售此类物质。

发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察
与计数方法，其以SYT0-9和PI替代吖啶橙和萘啶酮酸，以市售的黑色 钢笔墨水替代伊拉克黑，自行建立了一套VBNC细菌荧光显微镜观察与计 数方法，简化了操作流程，克服了现有技术的适用范围狭窄、取材困难、 观察结果不准确等缺点，解决了细菌VBNC研究领域中的技术难题，提高 同业者的实践操作水平。
本发明的技术方案是这样实现的细菌活的非可培养状态荧光显微 镜观察与计数方法，其特征在于具体步骤是1、 VBNC细菌观察样本的前处理 VBNC细菌诱导前的菌液浓度为10s — 106个/mL，取可培养菌数为1 X
10，/mL的VBNC细菌液lmL至无菌离心管中，8000 r/min离心2min， 弃上清；然后用灭菌生理盐水充分洗涤菌体沉淀2次，每次均8000 r/min， 离心2min，弃上清；洗涤菌体时，应尽可能地除尽细菌培养液，以免培 养液产生自发光而干扰观察结果；最后需将洗涤完毕的沉淀置于室温， 用于立即观察；或者将菌体保存于4t;，在2天内备用；
2、 微孔滤膜疏水性检查与处理
首先将直径25mm孔径0. 2um的微孔滤膜完全浸入灭菌生理盐水中2 rnin，再将微孔滤膜取出置于平皿中，光面朝上，仔细观察微孔滤膜表面， 若微孔滤膜表面有部分面积没有水痕，则表示此滤膜疏水，应重新更换； 或者将疏水滤膜浸入0.5%的吐温-80中，浸泡lmin，而后将微孔滤膜 转入可换膜针头式滤器内，在针管内注入灭菌生理盐水2mL， 一并将吐 温-80和盐水滤出；验证后的和吐温-80处理后的滤膜均光面朝上平铺于 平皿内，37'C烘干，室温存放备用，微孔滤膜最好直接使用亲水性滤膜;
3、 微孔滤膜染色
将上述处理完毕的微孔滤膜光面朝上平铺于平皿中，膜与膜之间不 能重叠；而后用吸管吸取适量"英雄牌"黑色钢笔墨水，在滤膜圆心处 滴一滴，要让墨水从膜中心向四周自行浸染扩散，待墨水已全部浸透膜 后，将平皿移至干热箱内，6(TC烤膜20min，其间需用镊子轻轻夹起滤 膜翻动2次，而后冷却，室温存放备用；4、 VBNC细菌样本荧光染色
将SYTO-9和PI染料配制成工作浓度，一20'C存放备用；将步聚1 中的VBNC菌体沉淀溶于50 til灭菌生理盐水中，贴壁加入工作浓度的 SYTO-9和PI各25u 1至离心管中，瞬间离心，吹吸混匀，室温避光染 色15minj
5、 VBNC细菌荧光标本的制备
将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片中心处，吸取 10y 1染色完毕的VBNC菌液，滴在微孔滤膜圆心上，待菌液刚好被滤膜 吸干时，在其上盖上盖玻片，并用手用力压片，除尽空气夹层；最后在 盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用OLYMPUS BX-51落射荧光显微镜于 暗室中观察并计数；荧光显微镜的激发光波长480nm，发射光波长为 610nm;待检标片可置于温盒内，在4'C低温存放ld;
6、 VBNC细菌荧光显微镜计数
计数时至少随机选择10个不同视野，而每个视野中的细菌数不低于 30 — 50个，而后取平均值；观察计数时，每个视野在lmin之内完成； 当看到呈现绿色荧光的即为活菌，而呈现红色荧光的即为死菌；VBNC细 菌数的具体计数可参考以下公式
其中E为样品中细菌总数(个/mL); X为各计数视野细菌总数的平均 值(个)；S,为滤膜面积(鹏)；S2为显微镜油镜的视野面积(mm); V为待 检VBNC细菌液的体积(mL)。
本发明的积极效果是选用的SYT0-9和PI两种核酸荧光染料是VBNC
细菌荧光观察的关键材料，其中，SYT0-9是一种能渗入具有完整细胞膜 细胞内的小分子，呈绿色荧光，PI则是一种仅能渗到细胞膜破损的菌体 内且呈红色荧光的大分子，并且与SYT0-9竞争核酸着染位点；经此试剂 染色后，发出绿色荧光的即为活菌，而发出红色荧光的为死菌。这两种 染料还对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌都适用，都利于活细胞与死细胞的 区分；因而，SYT0-9和PI不但能縮短VBNC细胞观察期，而且还应用广
泛。采用黑色钢笔墨水不仅取材方便而且便宜；采用由上海英雄金笔厂 有限公司生产的英雄牌黑色钢笔墨水不但不产生自发光，而且还能去除 滤膜的光亮；不但能加深视野背景深度，而且还能加强膜对玻片的吸附 力，因而该牌墨水对VBNC细菌的荧光观察效果最好。采用物理固定方式， 即利用湿润的滤膜对载玻片和盖玻片的吸附作用以及手动压力作用，这 种固定方式并不影响细菌的存活状态，因而在测定总菌数的同时，也能 一并将活菌数测定出来。
具体实施例方式
实施例1:
1、 首先对VBNC细菌观察样本进行前处理，VBNC细菌诱导前的菌液 浓度为106个/mL，取可培养菌数1Xl(f个/mL的VBNC细菌液lmL至无 菌离心管中，以8000 r/min离心处理2min，弃上清；然后用灭菌生理 盐水充分洗涤菌体并沉淀2次，每次均8000 r/min，离心2min，弃上清； 洗涤菌体时，应除尽细菌培养液，以免培养液产生自发光而干扰观察结 果；最后需将洗涤完毕的沉淀置于室温，用于立即观察；
2、 接下来进行微孔滤膜疏水性检査与处理，首先将直径25mm孔径0. 2um的微孔滤膜完全浸入灭菌生理盐水中2 min，再将微孔滤膜取出置 于平皿中，光面朝上，仔细观察微孔滤膜表面，若微孔滤膜表面有部分 面积没有水痕，则表示此滤膜疏水，应重新更换；或者将疏水滤膜浸入 0.5%的吐温_80中，浸泡1 min，而后将微孔滤膜转入可换膜针头式滤 器内，在针管内注入灭菌生理盐水2mL， 一并将吐温-80和盐水滤出；验 证后的和吐温-80处理后的滤膜均光面朝上平铺于平皿内，37'C烘干， 室温存放备用，微孔滤膜最好直接使用亲水性滤膜；
3、 将处理完毕的微孔滤膜光面朝上平铺于平皿中，膜与膜之间不能 重叠；而后用吸管吸取适量"英雄牌"黑色钢笔墨水，在滤膜圆心处滴 一滴，要让墨水从膜中心向四周自行浸染扩散，待墨水已全部浸透膜后， 将平皿移至干热箱内，6(TC烤膜20min，其间需用镊子轻轻夹起滤膜翻 动2次，而后冷却，室温存放备用；
4、 对VBNC细菌样本进行荧光染色，将SYT0-9和PI染料配制成工 作浓度，并在一20'C存放备用；将步聚l中的VBNC菌体沉淀溶于50ul 灭菌生理盐水中，贴壁加入工作浓度的SYT0-9和PI各25u 1至离心管 中，瞬间离心，吹吸混匀，室温避光染色15min;
5、 VBNC细菌荧光标本的制备，将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自 发荧光的载玻片中心处，吸取10 ul染色完毕的VBNC菌液，滴在微孔滤 膜圆心上，待菌液刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用手用力 压片，除尽空气夹层;最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用OLYMPUS BX-51落射荧光显微镜于暗室中观察并计数；荧光显微镜的激发光波长 480nm，发射光波长为610nm;待检标片可置于温盒内，在4XM氐温存放 Id;
6、 VBNC细菌荧光显微镜计数，随机选择10个不同视野，而每个视 野中的细菌数为30个，而后取平均值；观察计数时，每个视野在lmin 之内完成；当看到呈现绿色荧光的即为活菌，而呈现红色荧光的即为死 菌；VBNC细菌数的具体计数可参考以下公式
其中E为样品中细菌总数(个/mU ; X为各计数视野细菌总数的平均 值(个)；S,为滤膜面积(mm); S2为显微镜油镜的视野面积(mm); V为待 检VBNC细菌液的体积(mL)。
实施例2:
1、 首先对VBNC细菌观察样本进行前处理，VBNC细菌诱导前的菌液 浓度为K)5个/mL，取可培养菌数1X105个/mL的VBNC细菌液lmL至无 菌离心管中，以8000 r/min离心处理2min，弃上清；然后用灭菌生理 盐水充分洗涤菌体并沉淀2次，每次均8000r/min，离心2min，弃上清； 将菌体保存于4'C，在2天内备用；
2、 接下来进行微孔滤膜疏水性检查与处理，首先将直径25mm孔径 0. 2um的微孔滤膜完全浸入灭菌生理盐水中2 min，再将微孔滤膜取出置 于平皿中，光面朝上，仔细观察微孔滤膜表面，若微孔滤膜表面有部分 面积没有水痕，则表示此滤膜疏水，应重新更换；或者将疏水滤膜浸入 0.5%的吐温-80中，浸泡1 min，而后将微孔滤膜转入可换膜针头式滤 器内，在针管内注入灭菌生理盐水2mL， 一并将吐温-80和盐水滤出；验 证后的和吐温-80处理后的滤膜均光面朝上平铺于平皿内，37r烘干，室温存放备用，微孔滤膜最好直接使用亲水性滤膜；
3、 将处理完毕的微孔滤膜光面朝上平铺于平皿中，膜与膜之间不能 重叠；而后用吸管吸取适量"英雄牌"黑色钢笔墨水，在滤膜圆心处滴 一滴，要让墨水从膜中心向四周自行浸染扩散，待墨水已全部浸透膜后， 将平皿移至干热箱内，6(TC烤膜20min，其间需用镊子轻轻夹起滤膜翻 动2次，而后冷却，室温存放备用；
4、 对VBNC细菌样本进行荧光染色，将SYT0-9和PI染料配制成工 作浓度，并在一20'C存放备用；将步聚1中的VBNC菌体沉淀溶于50" 1 灭菌生理盐水中，贴壁加入工作浓度的SYT0-9和PI各25u 1至离心管 中，瞬间离心，吹吸混匀，室温避光染色15min;
5、 VBNC细菌荧光标本的制备，将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自 发荧光的载玻片中心处，吸取10ul染色完毕的VBNC菌液，滴在微孔滤 膜圆心上，待菌液刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用手用力 压片，除尽空气夹层；最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用OLYMPUS BX-51落射荧光显微镜于暗室中观察并计数；荧光显微镜的激发光波长 480nm，发射光波长为610nm;待检标片可置于温盒内，在4'C低温存放 ld;
6、 VBNC细菌荧光显微镜计数，随机选择10个不同视野，而每个视 野中的细菌数为50个，而后取平均值；观察计数时，每个视野在lrain 之内完成；当看到呈现绿色荧光的即为活菌，而呈现红色荧光的即为死 菌；VBNC细菌数的具体计数可参考以下公式
<formula>complex formula see original document page 12</formula>
其中E为样品中细菌总数(个/mL); X为各计数视野细菌总数的平均 值(个)；S,为滤膜面积(mm); S2为显微镜油镜的视野面积(mm); V为待 检VBNC细菌液的体积(mL)。
权利要求
1、细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法，其特征在于具体步骤是(1)、VBNC细菌观察样本的前处理VBNC细菌诱导前的菌液浓度为105-106个/mL，取可培养菌数为1×106个/mL的VBNC细菌液1mL至无菌离心管中，8000r/min离心2min，弃上清；然后用灭菌生理盐水充分洗涤菌体沉淀2次，每次均8000r/min，离心2min，弃上清；洗涤菌体时，应尽可能地除尽细菌培养液，以免培养液产生自发光而干扰观察结果；最后需将洗涤完毕的沉淀置于室温，用于立即观察；或者将菌体保存于4℃，在2天内备用；(2)、微孔滤膜疏水性检查与处理首先将直径25mm孔径0.2um的微孔滤膜完全浸入灭菌生理盐水中2min，再将微孔滤膜取出置于平皿中，光面朝上，仔细观察微孔滤膜表面，若微孔滤膜表面有部分面积没有水痕，则表示此滤膜疏水，应重新更换；或者将疏水滤膜浸入0.5％的吐温-80中，浸泡1min，而后将微孔滤膜转入可换膜针头式滤器内，在针管内注入灭菌生理盐水2mL，一并将吐温-80和盐水滤出；验证后的和吐温-80处理后的滤膜均光面朝上平铺于平皿内，37℃烘干，室温存放备用；(3)、微孔滤膜染色将上述处理完毕的微孔滤膜光面朝上平铺于平皿中，膜与膜之间不能重叠；而后用吸管吸取黑色钢笔墨水，在滤膜圆心处滴一滴，要让墨水从膜中心向四周自行浸染扩散，待墨水已全部浸透膜后，将平皿移至干热箱内，60℃烤膜20min，其间需用镊子轻轻夹起滤膜翻动2次，而后冷却，室温存放备用；(4)、VBNC细菌样本荧光染色将SYTO-9和PI染料配制成工作浓度，-20℃存放备用；将步聚1中的VBNC菌体沉淀溶于50μ1灭菌生理盐水中，贴壁加入工作浓度的SYTO-9和PI各25μ1至离心管中，瞬间离心，吹吸混匀，室温避光染色15min；(5)、VBNC细菌荧光标本的制备将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片中心处，吸取10μl染色完毕的VBNC菌液，滴在微孔滤膜圆心上，待菌液刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用手用力压片，除尽空气夹层；最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用OLYMPUS BX-51落射荧光显微镜于暗室中观察并计数；荧光显微镜的激发光波长480nm，发射光波长为610nm；待检标片可置于温盒内，在4℃低温存放1d；(6)、VBNC细菌荧光显微镜计数计数时至少随机选择10个不同视野，而每个视野中的细菌数不低于30-50个，而后取平均值；观察计数时，每个视野在1min之内完成；当看到呈现绿色荧光的即为活菌，而呈现红色荧光的即为死菌；VBNC细菌数的具体计数可参考以下公式 其中E为样品中细菌总数(个/mL)；X为各计数视野细菌总数的平均值(个)；S1为滤膜面积(mm)；S2为显微镜油镜的视野面积(mm)；V为待检VBNC细菌液的体积(mL)。
2、 权利要求1所述的细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与 计数方法，其特征在于所述的荧光显微镜标本制片的固定方式为物理 固定方式，即利用湿润的滤膜对载玻片和盖玻片的吸附作用以及手动 压力作用。
3、 权利要求1所述的细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与 计数方法，其特征在于所述的黑色钢笔墨水为"英雄牌"黑色钢笔墨 水。
全文摘要
本发明涉及一种细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法，其特征在于具体步骤是(1)VBNC细菌观察样本的前处理；(2)微孔滤膜疏水性检查与处理；(3)微孔滤膜染色；(4)VBNC细菌样本荧光染色；(5)VBNC细菌荧光标本的制备；(6)VBNC细菌荧光显微镜计数。其简化了操作流程，克服了现有技术的适用范围狭窄、取材困难、观察结果不准确等缺点，解决了细菌VBNC研究领域中的技术难题，提高从业者的实践操作水平。
文档编号G01N1/30GK101344476SQ20081005110
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月20日 优先权日2008年8月20日
发明者凤 候, 孙晓媛, 影 李, 锐 段, 王伟利, 钱爱东 申请人:影 李