专利名称：检测荧光增白剂vbl的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种检测荧光增白剂VBL的试剂盒。
背景技术：
荧光增白剂VBL(C. I.荧光增白剂85)，化学名称为4，4’-双[(4-羟乙胺基-6-苯胺基_1，3，5-二嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2，2’- 二横酸钠,属二苯乙烯二嗪型增白剂，荧光强度为100%±5%，色光为青光微紫，易溶于水，中性，具有优良的匀染性和渗染性，能提高物质的白度和光泽，广泛用于纸张、塑料制品、洗涤剂、纺织品等。长期以来，荧光增白剂的安全性颇受争议，有资料显示荧光增白剂是低毒的，也有资料显示荧光增白剂的分子结构稳定，不易被分解，在生物体内长期累积，会使细胞发生变异，产生潜在的致癌因素。因此，在未充分评估荧光增白剂的安全性的情况下，并不是所有荧光增白剂都被允许使用，欧盟、美国、日本、中国等许多国家对荧光增白剂都有一定的监管，相关法规如欧盟2002/72/EC指令、美国联邦法规21CFR178. 3297和GB 9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》都制定了允许用于生产塑料食品接触材料和制品的添加剂清单，对允许使用的荧光增白剂的最大添加量进行限制。鉴于此，建立相关产品的荧光增白剂的快速检测方法，开展定期监测和安全性评估，对于规范行业发展，保证产品质量，保护消费者身体健康和保护环境等具有深远的意义。而荧光增白剂VBL做为允许添加的荧光增白剂中的一种，也亟需一种合适的快速检测方法。目前，国内外对荧光增白剂的检测方法包括以下几种紫外灯直接照射观测法、色谱法、色谱质谱联用法。其中，紫外灯直接照射观测法只是一种简单的判断，不能鉴别荧光增白剂的种类；色谱法和色谱质谱联用法具有特异性高、结果准确的优点，但是这两种方法的缺点是样品前处理繁琐，消耗大量溶剂，且需要昂贵的实验室设备，检测成本高。
发明内容基于此，本实用新型在于克服现有技术的缺陷，提供一种成本低廉、操作简便、灵敏性高的检测荧光增白剂VBL试剂盒。其技术方案如下检测荧光增白剂VBL的试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及每个微孔内包被浓度为1-3 y g/mL荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板；所述试剂瓶包括装有浓度为1-3 u g/mL荧光增白剂VBL特异性抗体溶液的试剂瓶。下面对进一步技术方案进行说明在一些实施例中，所述试剂瓶还包括装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗的试剂瓶、装有荧光增白剂VBL标准品溶液的试剂瓶、两瓶装有显色剂的试剂瓶、装有终止液的试剂瓶、装有洗涤液的试剂瓶、装有浓缩样品稀释液的试剂瓶、装有封闭液的试剂瓶。在其中一个实施例中，该试剂盒还包括有用于检测时密封酶标板的封口膜。[0010]本实用新型的检测荧光增白剂VBL的试剂盒检测原理为将荧光增白剂VBL抗原吸附于固相载体上，加入样品或荧光增白剂VBL的标准溶液及荧光增白剂VBL抗体工作液，待测样品中荧光增白剂VBL和固相载体上包被的荧光增白剂VBL抗原竞争结合荧光增白剂VBL抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中荧光增白剂VBL的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出荧光增白剂VBL浓度范围。下面对前述技术方案的优点进行说明本实用新型的检测荧光增白剂VBL的酶联免疫试剂盒，利用竞争酶联免疫测定法检测荧光增白剂VBL，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确的检测大批量样品中的荧光增白剂 VBL。
图I是本实用新型实施例所述试剂盒结构示意图；图2是下凹瓶位设置示意图；图3是本实用新型实施例中酶标板结构示意图。附图标记说明1.盒体；2.下凹瓶位；3.塑料框架；4.酶标板；5.微孔。
具体实施方式
下面对本实用新型的实施例进行详细说明，但不对本实用新型的内容造成任何限制。实施例I本实施例所述的检测荧光增白剂VBL试剂盒的主要组成成份如下如图I-图3所示，所述检测荧光增白剂VBL试剂盒的盒体I内具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2 (共有14个下凹瓶位)，下凹瓶位用于放置装有溶液的试剂瓶；位于塑料框架3中的酶标板4，酶标板4中的微孔5内包被有荧光增白剂VBL特异性抗原。具体组成如下I)荧光增白剂VBL特异性抗原工作液；通过以下方法制得将荧光增白剂VBL0.87g，即I. Ommol和三乙胺I. Olg，即IOmmol分散于IOOmL干燥二氯甲烧中，零摄氏度下加入0. 5mL,即6. 46mmol甲磺酰氯作为活化试剂，室温搅拌反应3. 5h，荧光增白剂VBL的醇羟基可转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化对荧光增白剂VBL加入无水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流搅拌反应5h，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂VBL的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌lh，偶联制备得到荧光增白剂VBL特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2 y g/mL。2)荧光增白剂VBL特异性抗体工作液；通过以下方法制得将合成得到的荧光增白剂VBL特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂VBL特异性抗原的磷酸盐缓冲溶液(0. 01M, pH7. 4)乳化，抗原浓度为0. 4mg/mL，剂量为120 u g/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂VBL特异性抗原的磷酸盐缓冲溶液(0. 01M,PH7. 4)乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5 10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂VBL特异性抗原的磷酸盐缓冲溶液(0. 01M, pH7. 4)腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。单克隆抗体的制备与纯化Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0. 5mL/只。将细胞浓度为I. 5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞疒10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4°C冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法每I份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液(浓度 0. 05mol/L，pH4. 0)，用浓度 0. Immo 1/L NaOH调整 pH4. 5，在 4°C下搅拌 30min，期间缓 慢加入辛酸，按稀释前腹水体积计算40 V- L/mL ;在4°C静止3h,离心(10140r/min, 30min),取上清液，保持在4°C环境中，30min内加入(NH4) 2S04使其终浓度为0. 277g/mL,静止lh，4°C离心(10140r/min,30min),弃上清液,得到单克隆抗体沉淀,并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为 g/mL。3)辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；4)荧光增白剂VBL标准品溶液6瓶；浓度分别%=IXlO5U g/L、IXlO4U g/L、IXlO3U g/L、IXlO2U g/L、IXlO1U g/L、1X10> g/L ；5)酶标板；96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；6)底物显色剂；由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为lOmg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；7)洗涤液；为含有重量比为0. 05%-0. 5%吐温-20的0. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；8)终止液；为2mol/L的硫酸溶液；9)封闭液；为含5%脱脂奶粉的0. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；10)浓缩样品稀释液；为0. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液(即磷酸根浓度为0. 01M/L, pH7. 4的磷酸盐缓冲液)；11)自封袋；由商业公司提供。实施例2[0046]间接竞争ELISA方法的建立。采用间接竞争ELISA法检测荧光增白剂85单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下I)用2 ii g/mL的荧光增白剂VBL特异性抗原包被96孔酶标板，100 U L/孔，放置于4°C冰箱包被过夜，用300 UL/孔封闭液(即5%脱脂奶粉)封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；2)加入荧光增白剂VBL标准品溶液(浓度分别为:lX105ii g/L、I X IO4iI g/L、
1X IO3 u g/L, I X IO2 u g/L, I X IO1 u g/L, I X 10> g/L)或样品溶液 50yL，再加入浓度为
2u g/mL的荧光增白剂VBL特异性抗体工作液50 u L，混合均匀，37°C温育Ih ；3)洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗;IOOiI L/ 孔，37°C温育 Ih ； 4)洗漆拍干，每孔加入50 ii L显色液B液、10 u L显色液A液显色15min,加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50 u L/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处(优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定OD值。以抑制率1%为纵坐标，以荧光增白剂VBL浓度的对数lg[荧光增白剂VBL(ng/mL)]为横坐标，绘制荧光增白剂VBL竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中荧光增白剂VBL的实际含量。抑制率计算公式如下I =-— X I 00%
R-B
ljQ jjN其中1-抑制率B——(样本溶液的平均吸光度值)B0——(Ou g/L标准溶液的平均吸光度值)Bn——(参比空白对照平均吸光度值)实施例3试剂盒灵敏度、特异性、准确度。I.灵敏度测定。利用实施例2的间接竞争ELISA法测定结果建立荧光增白剂VBL检测的标准工作曲线。荧光增白剂VBL单克隆抗体在Iii g/L IX 105y g/L范围内有良好的线性，IC50=857. 9ng/mL，最低检测限为0. 324ng/mL，检测范围(抑制20% 80%之间)为2. 817ng/mL 1212. 182 ii g/mL。纸和塑料制品的检测限为0. 162ng/cm2，食品样品的检测限为0. 162ng/g，日化产品的检测限为30ng/g。2.特异性测定。采用实施例2的间接竞争ELISA法测定荧光增白剂VBL结构类似物2_羟乙基氨基-1，3, 5- 二嗪、2-苯胺基-1，3, 5- 二嗪、2-氨基-4-苯胺基-6-轻乙基氨基-1，3, 5- 二嗪、二苯乙烯_2，2’ - 二磺酸二钠盐、2- (3’ -磺酸基)苯氨基-4-苯胺基-1，3，5-三嗪)与单抗混合物的交叉反应。将系列浓度(IXlO7U g/L、IXlO6U g/L、IXlO5U g/L、IXlO4U g/L> I X IO3 u g/L, I X IO2 u g/L, I X IO1 u g/L)的上述物质分别与抗体同时加入到已包被封闭好的酶标板中，具体步骤同实施例3，分别计算各类似物的抑制率。利用单克隆抗体对荧光增白剂VBL的IC50值与单克隆抗体对各类似物的IC5tl值的比值得到交叉反应率(CR%)，公式如下
权利要求1.一种检测荧光增白剂VBL的试剂盒，其特征在于，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及每个微孔内包被浓度为l_3yg/mL荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板；所述试剂瓶包括装有浓度为1-3 μ g/mL荧光增白剂VBL特异性抗体溶液的试剂瓶。
2.根据权利要求I所述的检测荧光增白剂VBL的试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶还包括装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗的试剂瓶、装有荧光增白剂VBL标准品溶液的试剂瓶、两瓶装有显色剂的试剂瓶、装有终止液的试剂瓶、装有洗涤液的试剂瓶、装有浓缩样品稀释液的试剂瓶、装有封闭液的试剂瓶。
3.根据权利要求I所述的检测荧光增白剂VBL的试剂盒，其特征在于，还包括有用于检测时密封酶标板的封口膜。
专利摘要本实用新型公开了一种检测荧光增白剂VBL的试剂盒，属于添加剂检测技术领域。包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板；所述试剂瓶包括装有浓度为1-3μg/mL荧光增白剂VBL特异性抗体溶液的试剂瓶。用该试剂盒对荧光增白剂VBL进行检测，具有成本低廉、操作简便、灵敏性高的优点，适合用于快速而准确的检测大批量样品中的荧光增白剂VBL中。
文档编号G01N33/543GK202757940SQ20122039261
公开日2013年2月27日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者冼燕萍, 郭新东, 罗海英, 侯向昶, 吴玉銮, 邓龙, 罗东辉, 柯振华 申请人:广州市质量监督检测研究院
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