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专利名称：激光显微解剖方法和用于激光显微解剖的装置的制作方法
激光显微解剖方法和用于激光显微解剖的装置
本发明涉及一种激光显微解剖方法，以该方法借助于激光器的激 光脉沖沿着封闭的切割线从放置在一个平面载体上的生物样品上切下 切片。
本发明还涉及用于激光显微解剖的装置，其包含一个具有至少一 个定义一个光轴的物镜的显微镜。此外设置一个发射激光束的脉冲激 光器，该激光束经过物镜沿着光轴指向样品并且画出一条封闭的切割 线。
在生物学和医学范围内有一种称为显微解剖的方法，以该方法用 聚焦激光束从一个基本上扁平的样品(例如细胞、细胞培养物或组织 切片)中切下一小部分，所谓的切片。为了激光切割将生物样品放置 在一个平面载体上，例如玻璃载物片或聚合物薄膜。在切割之后切片 提供给进一步的生物或医学(例如组织)检验使用。
在1976年5月Journal of Microscopy第107巻19至24 页G. Isenberg、 W.Bilser、 W.meier-Ruge、 E .Remy的文章"Cell surgery by laser micro—dissection: a preparative method"
中描述了这样一种激光显微解剖方法。在该文章中生物样品放置在一 个载物片的底面。此生物样品是吸附在一个载物片上的细胞培养物。 为了防止细胞固定黏附在基片上，使用了具有硅树脂涂层的载物片， 其有助于降低在样品和载物片之间的附着力。所述载物片放在一台直 立的、耦合了一个脉沖式氦-氖激光器的显微镜内。激光束聚焦在生物 样品上。以该聚焦激光束沿着封闭的切割线通过接连排列通过激光脉 冲形成的切割孔切下感兴趣的样品区域，即切片。在此切割基于已知 的激光切除术原理，也就是说单独的激光脉冲在切割线上产生等离子 体，所述等离子体"蒸发，，样品物质。在此最后的激光脉沖使切片与 周围的生物样品分离并且在此也导致切片在载物片上所要求的松动。 然后切片在重力的作用下坠落并接放在一个收集器皿中并用于进一步 的检验。
DE 100 43 506 CI描述该方法的改进方案。其中将需要检验的、 要从中切下感兴趣的样品区域的样品在非常薄的塑料薄膜上制成标本。所述塑料薄膜的厚度在1-2fim数量级。PET薄膜和PEN薄膜可以
用作材料。样品放入耦合了脉冲激光器的显微镜中。描述一个激光显 微解剖方法，在该方法中切割线在切割临近结束时不完全封闭，而是 在末端保留一个比较狭窄的并且同时稳定的桥。该桥防止薄膜与感兴 趣的样品区域向聚焦平面外掀开并扭转。在割断该桥之前借助于一个 光阑放大激光束的光圏，但不改变显微镜的观察口径。通过放大激光 的光圈扩大激光束的切割宽度。同时激光束焦点的位置相对于样品保 持在同样的位置不变。然后用加宽的激光光圈以最后的、已聚焦的、 切割激光脉冲割断剩余的桥。在结束切割之后样品在重力作用下坠落 并收集在一个收集器皿中。可是总体来说，在最后的激光脉沖之前停 止切割线并且在最后的激光脉冲结束切割线之前，转换用于激光光圈 的光阑，被证明是仪器技术上复杂的并且是费时的。由应用者确定一 个适当的剩余桥并且指定一个合适的激光光圈也是不完全简单的，因 此有时切片不能完整地独立制成标本并且必须重复切割。
此外在这两种方法中都观察到，在不改变设备设置(光学镜组、 激光器参数、聚焦位置等)的情况下相继切割的切片在落入收集装置 时不同程度地向旁边漂移。该收集装置例如可以是小样品管，市场上 通常称为PCR管。结果是，切片黏附在PCR管的侧面内壁上，而不是 落到管的底部。这使切片难以检查，这对于使用者，例如病理学家来 说，在进一步处理已切割的切片之前是一个重要的工作步骤。
因此德国专利申请DE 103 46 458建议对样品的感兴趣的样品 区域进行激光显微解剖的 一个方法，在该方法中脉沖激光束的激光脉 冲同样聚焦到样品上，并且在该方法中，在最后的、完成切割的激光 脉沖中切除的主体与最后用来切割的激光脉沖的切割宽度匹配并优 化，如此使得从等离子体传递到切片上的能量最大。然而在此在最后 的激光脉沖之前停止切割线也使应用者感到费时。
美国专利6,773,903同样公开了切割所选择的生物样品区域的 一种显微解剖方法。放置在载物片上的样品位于一个在x-y坐标平面 内的可移动工作台上。在该显微镜内耦合激光束并使x-y工作台作相 应移动，如此使得激光束围绕感兴趣的样品区域描绘一个相应的封闭 的切割线。由此将感兴趣的生物物质与生物样品分离。可是x-y工作 台的控制在机械上是复杂的并且不能相应在x-y平面内的激光束那样
准确地控制，以将生物物质与其余样品分离。
因此本发明的技术问题是，给出一个激光显微解剖方法，其在艰 难的样品标本制作中能够以进一 步改善的切割结果更舒适、更快捷地
切下切片。
该技术问题通过具有权利要求1的特征的一种激光显微解剖方法 来解决。
本发明的另一个技术问题是，给出一个激光显微解剖装置，用户 用该装置可以安全、快速并可靠地获得所希望的切片。在此切片的获 得与各自的样品标本不相关。
该技术问题通过包含权利要求10的特征的一种激光显微解剖装
置来解决。
明的激光显微解剖方法中借助于激光束的讀
样品上切下一个切片。在此沿着封闭的切割线引导激光束。样品本身 放在平面载体上。在切割切片期间沿着封闭切割线连续改变确定激光 脉冲和切割线的参数。
通过图像处理确定参数沿着封闭切割线的连续变化。从图像处理 中获得参数沿着封闭切割线连续变化的量。这些参数例如是样品厚度、 样品的紋理、着色在样品内部的分布等。
同样也可以考虑，仅仅在闭合封闭的切割线之前才连续改变确定 激光脉沖和封闭切割线的参数。在样品的其余切割期间参数保持恒定。
借助于在用户界面上的滑块可以改变确定在结束封闭的切割线之 前连续变化的参数。
借助于中央计算单元确定所述参数，其中由中央计算单元把相应 的控制信号提供给光学系统的各个元件。
激光脉沖在击中生物样品之前通过所述光学系统，其中改变激光 脉沖关于光圈、衰减、各个激光点在切割线上的密度和激光脉沖聚焦 位置的参数。
光圈和衰减器的变化同时进行。光圈和衰减器的变化与激光脉冲 同步，以便由此达到最高的切割速度。光圈的变化可以借助于针孔光 阑或彩虹器。
可以视各自激光器功率和样品的局部特性匹配在切割线内部各个 激光点的密度。
本发明的激光显微解剖装置包含具有至少一个定义光轴的物镜的 一个显微镜。同样设置了一个发射激光束的脉沖激光器，所述激光束 经过物镜沿着光轴指向样品。所述激光束在样品上描绘一条封闭的切 割线，由此将所选择的一个样品区域与剩余的周围生物物质分离。所 有在光轴上布置的、确定激光脉冲和切割线参数的元件都连接在中央 计算单元上。
中央计算单元借助于图像处理通过各个元件的协调调节实现沿着 封闭切割线的参数的连续改变。
在此同样可以使用中央计算单元，使中央计算单元仅仅在结束封 闭的切割线之前才连续改变确定激光脉冲和切割线的参数。
确定激光脉冲和切割线的参数的元件是一个X/Y移位单元、 一个 光圈单元、 一个衰减器单元、 一个聚焦单元、 一个UV激光器和一个偏 转单元。在此中央计算单元给各个元件提供相应的调节信号。
同样激光显微解剖装置与一台监控器相连，在该监控器上为用户 显示用户界面。该用户界面是一个滑块，用该滑块可以在结束封闭的 切割线之前确定参数的连续变化。中央计算单元在此同时改变光圈和 衰减器。
从附属权利要求中可以在此得出本发明的进 一 步的有利的实施方案。
下面借助示意图更详细地阐述本发明。图示
图l示出一种具有固定激光束的激光切割装置；
图2示出一种具有可移动激光束的激光切割装置；
图3示出根据现有技术背景的参数汇集，在该现有技术中直到切 割线结束参数保持不变；
图4示出根据现有技术背景的参数汇集，在该现有技术中在结束 完全切下样品之前参数跳5夭式地改变；
图5示出参数沿着一条封闭切割线的连续改变；
图6示出参数在结束切割线之前的连续改变；
图7示出一条切割线的示意图，在该切割线中参数在整个切割线 期间连续改变；
图8示出所述切割线的示意图，在该切割线中参数在结束切割线 之前才改变；
图9示出光圏A和衰减器K变化的总效果；


图10示出光圏A和衰减器K变化的优化的总效果；
图11示出切割线，在这些切割线中对光圈光阑和衰减器进行了 共同的调节；
图12举例地示出动态范围为40:1的衰减器和同样动态范围的光 圈光阑的可能组合的局限；
图13举例地示出衰减器和光圏的控制曲线，其绝不仅仅局限于 曲率单调变化的走势；
图14示出依赖于衰减器角位的一条典型的校准曲线；
图15示出由预先给定的控制值形成的衰减器的特征曲线的线性
化；
图16示意地举例示出用于产生切割线的一个程序环；
图17示出用户界面图的一部分，通过该用户界面借助于滑块在闭 合封闭的切割线之前调整参数的连续变化。
在图中相同的元件用同一参考数字表示。
在图1中示出了一个用于显微解剖的装置，其以一个固定激光束 和一个相对于激光束移动的样品4工作。该装置包含一个具有可电动 移动的x-y工作台2的显微镜1。该x-y工作台2用于接纳样品吸持 器3,在该吸持器上安放要检查的或要切割的样品4。此外设置了一个 照明系统5,以该照明系统使用者能够通过一个目镜12可视观察样品 4。为了切割样品4设置了一个激光束22，其耦合在显微镜的光轴IO 上。由激光器22产生的激光束31聚焦在要切割的样品4上。所述x-y 工作台2与一个控制单元15连接，其如此移动x-y工作台2,使得形 成所希望的切割线。然后通过在激光束31和样品4之间的相对移动借 助于所希望的切割线从样品上切下相应的样品部分。在图1中所示的 显微镜是一台透射光显微镜，其中在显微镜支架8上的照明系统5布 置在x-y工作台2和样品4的下面。显微镜1包含至少一个物镜9， 其布置在x-y工作台2和样品4的上部。所述物镜定义一个光轴10， 其与照明系统5的光轴在一条直线上。在这个所描述的布置中以透射 光照明观察样品4。同样也可以用一个倒置的显微镜实施激光切割，在 这种情况下照明系统5布置在x-y工作台2的上面并且至少一个物镜 布置在工作台2的下面。由照明系统5发出的光通过一个聚光镜11从
下面指向布置在x-y工作台2上面的、具有样品4的样品吸持器3。 透过样品4的光到达显微镜1的物镜9。在显微镜内部光经过没有示 出的透镜和反射镜通向至少一个目镜12。同样一个摄像机17与显微 镜1连接，该摄像机依赖于物镜的放大倍数拍摄样品4的部分图像。 由摄像机拍摄的图像数据传递给一个计算单元16，其自身方面与一个 监视器18连接，在该显示器上可以向用户显示所拍摄样品区域的图 像。在摄像机和计算单元之间同样中间连接一个控制单元15。由激光 器22发出的激光束31经过射束分离器13，比如二色分离器，耦合进 入显微镜的光程。在激光束31耦合进入显微镜1的光程之前，激光束 经过一个光学系统，在该光学系统内设置了多个元件14、 16和19。 该光学系统中的第一个元件是光圈单元14,其与控制单元15连接， 该控制单元自身方面再和计算单元16连接。该光圈单元14可以包含 一个彩虹器或多个不同针孔光阑的选择。该光学系统中第二个元件19 是一个聚焦单元19，其自身方面同样与控制单元15连接，该控制单 元同样连接在计算单元16上。所述聚焦单元19主要用于补偿主要在 可见光频谱范围内校正的、显微镜1的物镜9的紫外线的不同聚焦位 置。有选择地也可以用聚焦单元19选择确定的聚焦位置或者连续改变 在切割过程中激光焦点的焦点位置。该光学系统30中的第三个元件 16是一个衰减器单元16。该衰减器单元16同样与一个独立的控制单 元15连接，该控制单元再连接在所述计算单元上。由UV激光器22 产生激光束31，其导入光学系统30中。该UV激光器22同样与计算 单元16连接。
可以在角位上改变衰减器16,并且衰减基于干涉原理。光圈单元 14、聚焦单元19和衰减单元16都可以通过独立的控制单元15的控 制信号在位置或者倾斜状态或大小上改变。在此电动实现这些改变。 所述光圈单元14、聚焦单元19或衰减单元16与独立的控制单元15 连接，控制单元自身方面经过独立的应答线路15a连接在计算单元16 上。在此可以彼此独立地调整光圈单元14、聚焦单元19和衰减单元 16。由于光圈单元14和衰减单元16的独立调整组合实现最大的动态 范围(在样品上激光功率的变化幅度)，并且与此无依赖地可以有针 对性地影响这些量，比如景深清晰度、分辨率和功率密度。以耦合进 入光学系统30的激光束31,其通过光束分离器反射进入显微镜1的光程IO，用单个激光脉沖切割样品4。可是在本发明的意义上最佳切 割结果要求激光脉沖与光圈单元14、衰减单元16和聚焦单元19的变 化同步，其中必须考虑x-y工作台2的移动。
图2示出用于显微解剖的一个装置，该装置的x-y工作台固定并 且通过同样布置在光学系统30中的偏转单元40以相应的方式偏转激 光束，以便从样品4上切下任意形状的切片。在该布置中所述x-y工 作台2在切割过程中不移动。在光学系统30中在由激光器22发出的 激光束的方向上首先布置衰减单元16,然后布置聚焦单元19,然后布 置光圈单元14并且最后布置偏转单元40。偏转单元40与一个独立的 控制单元15连接，该控制单元自身方面经过应答线路15a与计算单 元16连接。偏转单元40包括一对楔形板，通过与计算单元16连接 的控制单元15以适当的方式可以推移这对楔形板，由此激光束在样品 上画出所希望的、切下的切片最终应当具有的形状。正如已经在图1 的说明中提到的，光学系统30的所有元件分别与一个独立的控制单元 15连接，这些控制单元经过一个应答线路15a连接在计算单元16上。
图3示出在根据现有技术用于切片的切割方法中应用的参数组。 在才黄坐标上以百分比标注了切割长度。对此0%表示切割开始，100% 表示切割结束。在纵坐标33上以任意单位标注了依赖于切割长度的各 个参数值。所有参数，比如焦点34、点距35、衰减器36和光圏37 在整个切割长度上恒定不变。因此从衰减器36和光圏37的配合中得 出的总功率38同样在整个切割长度上恒定不变。
图4同样描述根据现有技术的在切片的切割过程中的参数组合。 在横坐标41上同样以百分比标注了切割长度，并且在纵坐标42上以 任意单位示出了参数值。在几乎整个切割长度上焦点43、点距44、衰 减器45和光圈46恒定不变。正如在图3中所描述的，从衰减器45 的参数和光圏46的参数得出总功率47,其因此同样直到在结束切割 线之前不久恒定不变。在结束切割长度或切割线之前不久该系统插入 一个简短间隔，在该间隔内改变光圏46的参数。因此在结束切割线之 前加大光圈。因此总功率也随之改变，其基于较大的光圈因此也变大。 其它参数，比如衰减器45和焦点43在此保持恒定。
图5示出了在整个切割长度上连续变化的参数组。在横坐标50上 以百分比标注了切割长度，并且在纵坐标51上标注了各个参数的连续 变化的值。正如/人图5中可以看出的，焦点52、点距53、衰减器54、 光圏55的参数并且也因此总功率56在整个切割长度上改变。为补偿 样品的歪斜或为使焦点配合不同的样品厚度，必须改变焦点位置。同 样可以随着焦点的变化选择一个确定的Z位置或者在切割过程或产生 切割线期间连续改变激光焦点的Z位置。通过各个激光脉冲的接连排 列产生切割线。在此，点相互接触是重要的，以便由此形成使切片脱 离剩余样品4的切割线。为此正如在图5中示出的，同样可以改变切 割线内部各个激光脉冲的点距。变化的点距表明，在形成切割线期间 各个激光脉沖的直径可以改变。同样从光圈55和衰减器54的配合中 得出连续变化的总功率56,该总功率通过激光脉冲传到样品4上。在 图5中描述的情况下量总功率56、光圈55、衰减器54、点距53、以 及焦点位置52连续地并且与激光脉冲同步改变，以便在最佳切割速度 的同时达到尽可能可靠的脱落。这些参数的估计值可以例如通过分析 在全部或在确定光谱范围或者色彩通道内的光密度，或者通过该方法 对样品材料的"校准"，也就是通过在通常不使用的样品部分中的切 割试验来确定。在此存在附加的自由度，即通过衰减器和光圈光阑的 不同调整实现相同的激光总功率并且如此选择性地按切割线的分段， 例如(a)或(b)优化景深清晰度(小光圏)或焦点的功率密度(大光圏)。 通过在不同焦点位置上对显微镜图像的对比度的分析也可以确定可能 的曲率和切片对光轴的公共斜率(c),并且在本发明的范围内与激光 脉沖同时并且因此在不降低切割速度的情况下改变曲率和斜率。当然 有选择地例如通过分析在全部或确定光谱范围或者色彩通道内的光密 度d或也借助于另外的方法确定沿着预定切割曲线I或者Ii的样品材 料切割特性的估计值。根据如此估计的光密度d与关于样品材料或载 体材料的类型x的由用户给定的数据一起得出如沿着I的激光总功率 P(见下面)、光圈A、衰减器K、点密度D和也许可能的焦点位置z 等的切割参数曲线并将这些参数的曲线存储用于后续切割过程。这里 为了简化操作也可以考虑一些预定的单参数函数(P、 D、 z)=fx(d) 或(A、 K、 D、 z)=fx(d)。也可以通过所述方法对于样品材料的"校 准"，也就是通过在样品4的通常不使用的部分中的切割试验来确定 最佳切割参数。
通过对在不同焦点位置上的显微镜图像的对比度分析也可以确定
可能的曲率和切片或者样品4对光轴10的公共斜率并且在本发明范围 内与激光脉沖同时并且因此在不降低切割速度的情况下改变曲率和斜率。
图6描述在结束切割线之前短暂地连续改变一些参数的情况。在 横坐标60上以百分比标注了切割长度并且在纵坐标61上以任意单位 示出了各个参数的值。变化的参数值是焦点62、点距63、衰减器64、 光圈65和总功率66。在此焦点62可以在整个切割线上保持恒定或在 整个切割线上连续变化。对于其余参数，比如点距63、衰减器64、光 圈65并从而总功率66从切割线结束了大约60%时起连续增加。前面 提到的参数直到切割线的60%恒定不变。因此实现，通过在结束切割 线之前连续提高作用在样品4上的总功率使切片与剩余的样品材料或 载体可靠分离。在图6中示出的参数调节中放弃沿着切割线明确确定 切割参数。力求在高的"高于一切"的切割速度下尽可能可靠地分离 切片。这里不留出部分切割曲线，而是在切割曲线的结束区域内连续 提高激光功率(或者光圏和衰减器)和点距，以便使切片提前下降或 张力引起的竖起使切片离开焦点位置最小化。通过x类的单参数函数 来说明这种变化，这些函数确定激光功率和点距沿着切割线的变化。 根据典型的(已知的或者事先得出的)材料特性选择x或通过一种"校 准"选择x。被证明对于使用者有益的是，有选择地或者也附加地，通 过附加的一个调节量影响正确函数类的选择，该调节量表明，各自材 料对于千扰作用，比如竖起、下降、倾斜或上滑和粘牢是多么重要， 并且该调节量然后例如规定总激光功率(或光圈和衰减器)和所属点 密度在切割线将近结束时的变化。从而用户可以以尽可能简单的方式 区分一方面不难处理的样品材料和另一方面难以分离的样品材料并且 相应匹配切割过程。
在图6的简化情况中不求出并采用沿着切割线I的光密度d，可 是确定优化的参数分布(P,D) -gx(I)或(A,K,D,z) =gx(I),其中 gx仍是单参数函数类，其表明特别是在将近结束时参数沿着切割线I 的变化，以便实现不仅正如上面已经讨论的、在尽可能大部分的切割 线I上尽可能薄的切片，而且也在I的临界末端范围内尽可能可靠的 脱离。可以根据典型的(已知或事先得出的)材料特性选择x或再度 通过一种校准，如在图5的描述中已经讨论过的。被证明对于使用者
有益的是，有选择地或也附加地，通过附加的一个调节量影响正确函
数gx的选择，该调节量表明，各自材料对于提到的干扰作用，如倾斜、 上滑、粘牢或向上弯曲是多么重要，并且然后例如规定总激光功率P
(或A和K)和所属点密度D在切割线将近结束时的变化。从而用户
可以以尽可能简单的方式区分一方面不难处理的样品材料和另一方面 难以分离的样品材料并且相应地优化切割过程。
在图6中描述的切割方法中也可以作为选择地通过对在不同焦点 位置的显微镜图像的对比度分析确定并且与激光脉沖同时而在不降低 切割速度的情况下校正可能的曲率和切片对光轴的公共斜率。
图7示出一个切割线70，在该切割线内部设置多个区域，在这些 区域内改变在样品4上激光脉冲的参数组合。在该实施形式中切割线 70划分为四个区h戈71、 72、 73和74。如此例如在区i戈71和在区》或 73内以恒定的参数进行切割。在区域72内和在区域74内连续改变用 于产生切割线的参数。用户或者借助于鼠标(没有示出)在监视器18 上在样品4的图像上直接标记所希望的切割线I，或许他仅仅粗略地 预先给定检索范围并且图像识别全自动地确定在样品4的预定范围内 一个或多个/全部切割线Ii。
图8示出用于形成切割线80的另一个实施形式。该切割线具有一 个在图8中以81表示的始端。切割线的始端81与切割线的末端83 重合。从切割线的始端81出发直到在切割线上的位置82以恒定的参 数进行切割。在该切割线上在切割线的始端81和位置82之间使用恒 定不变的参数。然后在切割线的位置82和始端或者末端81之间连续 改变或者提高参数。最早在大约完成切割线的60%之后开始，直到切 割线结束连续改变切割参数。在该切割过程中切割线的平均宽度为几 |iun。
图9示出在同时改变光圈和衰减器情况下的总效果。在横坐标90 上以任意单位标注了控制值。在纵坐标91上以对数单位标注了强度。 光圈和衰减器必须同时变化，以便实现尽可能大的动态范围。衰减器 和光圈的组合控制提高功率调节的分辨率。通常仅仅粗略地以对数对 光圈进行光阑分级。 一个光阑等级相当于大于30%的强度变化。相反 可以用7%的分辨率并且更好地(更小的微步是可能的)调节衰减器。 通过光圈和衰减器组合的同时控制可以在分辨率优于7% ( 100级每级
0.928)的同时实现高动态(总动态为大约1: 2000)。在图9中以
离散级示出衰减器的变化92。同样在图9中以离散级示出了光圈93 的变化，其中正如前面提到的，在光圈调节中的级大于在衰减器调节 中的级。从光圏和衰减器的组合控制中得出的强度总效杲以曲线94示 出。曲线94从而示出在总效果中在强度上升时的周期跳跃。在切割过 程期间不仅随意改变光圈A而且随意改变激光束31的衰减器K。在实 践中并非A和K的所有组合都是不相关的或对于确定的应用是有意义 的。原则上存在许多A和K的组合，这些组合都导致在样品上相同的 总功率输入P,类似于照相术光阑B和曝光时间t的多个组合导致胶 片同样的曝光。A表示光圏直径的对数并且K表示衰减器透射的对数， 那么有简化的P=A+K (P也以对数单位表示)，由此可见，A和K的 (无限)多个值可能导致相同的和P。但是在此也与照相术类似，如果 平均功率输入P(在照相术中是平均曝光)相同，则结果可能完全不同。 在照相术中通过所谓的"自动程序"考虑这种特性，也就是说在这个 可使用的曝光范围内B和t的值以一种确定的模式变化，各自的模式 根据应用变换或匹配，例如是否希望有最大的景深清晰度或是否希望 有最小的移动模糊。"自动程序"的想法，也就是使A和K一起变化 的一种模式，可以与在此描述的方法和所属的装置一起用于改善在激 光显微解剖中的功率控制。
借助于光圈光阑和衰减器独自可达到的动态范围在实践中是有限 的，在具体情况中限制在大约为70:1或者30:1的数值。可是最佳的 切割质量典型地要求在较大范围上改变总效果。通过光圏光阑和衰减
当大"功率变化，因为:个元件的;节路径小于仅仅以光圈光S和衰 减器单独实现的变化，并仍然合计实现约等于2000:1的动态范围。
在最简单的情况下(参见图9)在控制值的预定范围内单调改变光 圈和衰减器，以实现所述的大动态范围。然而由此(正如上面已经提 到的)也许得出不一样大的效果级别。如此在该实例中衰减器的与光 圈的较大分级相比更为精细的分级不能完全得到利用。
图10同样示出衰减器和光圈的总效果的组合。在此在横坐标100 上以任意单位标注了控制值。在纵坐标101上仍以对数单位标注了强 度。曲线92示出衰减器的变化。在此非连续地、阶跃上升地改变衰减
器。继而如此改变衰减器，使强度首先上升两级并且在一个第三级再
度下降。该模式在衰减器的整个调节中延续。正如在图9中已经示出 的，以不连续的阶跃改变光圈。由变化的光圈和变化的衰减器的组合 产生的总效果用曲线94示出。可以清楚看出，强度连续阶梯式上升， 其中每一级是一样大的。因此也可以说总效果以准连续式上升。加之， 从衰减器和光圏的适当组合调节中得到 一个总效果，该总效果基本可 以以更精细的分级进行调节。通过衰减器的优化控制，该控制补偿在 简单情况下(图9)产生的误差，可以在-2000:l的全范围内在保持 衰减器较精细分级的情况下实现总效果的单调的指数变化。
图11示出所产生的切割线112、 113和114，在这些切割线中按 照在图10中描述的方法共同调节了光圈光阑和衰减器。在此切割线 112、 113和114的每一个以光圈光阑和衰减器的不同参数组切割。 所有切割线112、 113和114都示出切割宽度115的连续增加。根据 按照在图10中描述方法的光圈光阑和衰减器的调节每一个切割线 112、 113和114未显现切割宽度115的跳跃。在切割线112、 113 或114的末端切割宽度为大约IO拜至50jim。通过功率值的细孩炎校正 的可能性也证明了采用针孔光阑代替彩虹器是绝对有益的。原则上彩 虹器有这样的优点，即光圈值的变化稳定并且不存在这样的"危险"， 即在调节期间激光脉冲会射到在针孔光阑的预定孔之间的空间并因此 阻断激光脉冲。相反针孔光阑的光圈值有更准确的定义并且针孔光阑 构造小而轻，如此调节仅仅需要几ms并因此完全可以在激光脉沖的等 待时间内实现。
图12示范阐述了动态范围40:1的衰减器与相同动态范围的光圏 光阑的可能组合的限制。这里如此同时控制衰减器和光圏光阑，使得 在0-100的控制值内按照累计曲线G实现402:1、也就是1600:1的 总功率的严格指数变化。
也在图9和10中实现的最简单和最普遍的情况下，在控制值的全 部范围内不4义衰减器而且光圏光阑以相同方式按照恒定上升的曲线E 和F变化。因此没有实现确定调节值的特殊选择。
可是例如在控制值的尽可能大的范围内保持尽可能低的光圈值也 是合理的，以保证切割光学系统的尽可能大的景深清晰度和/或也尽可 能低的图像误差。相反优选尽可能大的光圏也可能是合理的，以便对于特殊的基片保证尽可能高的空间(側向和轴向)分辨率并同时保证 在焦点上的尽可能高的功率密度(通过随着光圈的增加焦点斑点减小，
功率密度超比例升高！)。这种情况相当于控制曲线，比如H和I的 结对，在第一种情况下I代表光圈并且H代表衰减器，并且在第二种 情况下反之。
在一般情况下人们发现，对于在预定任务范围内的控制所有(和 只有这些！)曲线对都是可能的，即其完全在平行四边形ABCD内从A 向D延伸，并且成对地对称于A至D线(或者等效于此对于一个确 定的控制值其和表明预定的值G)。
在图13中示出了衰减器和光圈的控制曲线，绝不仅仅局限于曲率 单调变化的曲线，而也可能是转折点和(近似)恒定值的范围。如此 可能要求，在控制值周围尽可能大的范围内例如为30附近(L)确保 按照曲线K的尽可能恒定的光圏。按照上述考虑从而可以直接从A-D 的对称或者从G的求和条件中推导出衰减器的所属控制曲线J。
光圈光阑A和衰减器K的组合控制，特别是在应用根据图10的误 差校正的情况下，要求被调节的衰减器值K高度准确。可惜所采用的 衰减器表现出依赖于倾角alpha的、典型近似于具有最大值和最小值 的偏移的余弦形特征曲线K=f0xcos (fl+f2xalpha)+l+f3 (f0至 f3 是独立参数)而不是所希望的单调指数形状 K=g0xexp(—glxalpha)。
在本发明的意义上因此为了确保精确度确定独立衰减器的配合参 数(四个或多个)或在散布足够小的情况下确定衰减器的生产批次的 平均参数(参见图14)并且存放在激光头的存储区域内。通过配合函 数的反演如此可以从预定的控制值中确定所属倾角并且如此使衰减器 的特征曲线(参见图15)"线性化"。在具体情况中可能例如要求了， 控制值的三级相当于1.25的系数(指数特征曲线)。由此得出具有 loglO (强度)oc-0 . 0323x控制值的强度的指数特征曲线。
为了最优化切割速度计算和移动在时间上"交叉"进行，也就是 说在各个元件(光圈单元14、衰减器单元16、聚焦单元19和偏转单 元40或x-y工作台2 )向新位置运行或等待所希望的激光频率的预定 周期运行完成期间，就进行各自接下来位置的费时计算。如果随后已 有关于所有元件已到达其应有位置并且激光脉沖的预定等待时间已过
的应答，则触发激光触发器并立刻发出随后射击位置的定位指令。
在图16中图解示范描述了用于产生切割线的程序环，其按如下形 式运行
1) 向偏转单元40的楔形板发出前往最后已计算出的角位(a, (3)的指令；
2) 根据当前的点距D计算后面的射击坐标(x,y);
3) 将这些射击坐标换算为偏转单元40的楔形板的角位(a, (3) (通常是最费时的)；
4) 等待所有元件已到达其理论位置，并且所选择的激光周期已
过；
5) 触发激光触发器并且复位周期计数器；
6) 计算点距值(dx,dy)、功率P的新值，从中计算出光圈A 和衰减器K并且也许可能焦点位置F的值；
7) 向光圏光阑、衰减器和焦点电机发出运行到新位置的指令；
8) 只要还没有到达切割曲线的末端点就返回1)。
为了启动该序列必须已曾计算出了切割曲线第 一点的角位(a， (3)， 并且光圈A、衰减器K和焦点位置F必须已经进入切割曲线的启动点 的起始位置。
在图6中示出的切割方法中在本发明的意义上是有利的，在切割 线的末端控制最后激光射击的位置并且也许校正性地干预。在此直接 在结束切割曲线之前，应当始终如此定位在激光显微解剖中具有最高 激光功率的最后的激光脉沖，以去除切片尽可能大的范围，确保脱离 尽可能可靠。如果最后的射击离切割线的起始点太远，存在切片悬吊 着的危险；如果最后的点设置太紧密，则存在这样的危险，即切片不 是像所希望的一样分离，而是(正如经常观察到的)已经从聚焦平面 "旋转出来，，并且因此对于最后的射击"够不着"。
然而通常由使用者任意确定的切割曲线的总长，很难得刚好是点 距的倍数，特别是如果在扩展的模式中点距不保持恒定。因此本发明 在切割过程开始之前计算由所选择的切割参数得出的最后脉冲的位 置，并通过参数的简单变化迫使最后脉冲具有一个有利的位置，而不 致于由此出现干扰性的中断或在切割曲线或者切割线中出现空隙。
通过同步于激光脉沖改变激光功率参数(光圏和衰减器)达到最高的切割速度。由此产生有利的副效应，其在自动切割多个子区域的
情况下同样使流通量最大化。
通过点密度与各自的激光功率和局部的样品特性的匹配可以确保
各个激光射击形成一个切片。因此防止了或避免了切片悬吊、倾斜等。
在分离感兴趣的区域时也能够实现脉沖传递的优化。
同时改变光圈和衰减器得到尽可能大的动态范围。
衰减器和光圈光阑的组合控制提高功率调节的分辨率。
通过按照确定的模式通过光圈和衰减器改变有效的激光功率可以
最佳地考虑样品(在提供使用的动态范围内部)的确定特性。
通过在激光头中存储的、独立校准曲线实现衰减器K的"线性化，，。
线。 '；"、'、 ，
此外可以，或者事先在样品的"校准范围，，内，或者在切割期间 在对切割结果连续的、自动的光学控制下从图像分析中确定切割过程 的最佳参数。也许还可以自动修整或者重新切割非最佳分离的样品区 域。
图17示出用户界面图170的一部分，在该用户界面上借助于至 少一个滑块171、 172、 173在结束封闭的切割线之前调节参数的连续 变化。用户界面170在监视器18上显示给用户。用第一滑块171可 以调节入射到样品上的激光脉冲的总功率。正如已经描述的，从衰减 器和光圈的适当组合调节中得出总功率。用第二滑块172可以调节在 样品上设置切割线的速度。为此随之相应调节激光脉沖的重复率。用 第三滑块173可以调节，在接近切割线末端参数应该改变多大。
权利要求
1.激光显微解剖方法，以该方法借助于激光器的激光脉冲沿着封闭的切割线从放置在一个平面载体上的生物样品上切下切片，其特征在于，同步于激光脉冲沿着封闭的切割线连续改变确定激光脉冲和切割线的参数。
2. 按照权利要求l的方法，其特征在于，通过图像处理获得沿 着封闭切割线连续改变参数的量。
3. 按照权利要求2的方法，其特征在于，参数包含样品厚度、 样品载体的偏斜、样品紋理和样品着色。
4. 按照权利要求1至3之一的方法，其特征在于，仅仅在结束 封闭的切割线之前连续改变确定激光脉冲和切割线的参数。
5. 按照权利要求1至4之一的方法，其特征在于，借助于中央 计算单元确定参数，并且由中央计算单元给光学系统的各个元件提供 控制信号。
6. 按照权利要求1至5之一的方法，其特征在于，激光脉沖在 到达生物样品之前经过光学系统，其中根据光圏、衰减、各个激光点 在切割线上的密度和激光脉沖的焦点位置来改变激光脉沖的参数。
7. 按照权利要求6的方法，其特征在于，同时改变光圈和衰减器。
8. 按照权利要求6的方法，其特征在于，同步于最高切割速度 的激光脉冲改变光圈和衰减器。
9. 按照权利要求6的方法，其特征在于，根据各自激光功率和 样品的局部特性匹配在切割线内部各个激光点的密度。
10. 用于激光显微解剖的装置，包含一个具有至少一个定义光轴 (10 )的物镜(9 )的显微镜(1 )、发射激光束的脉沖激光器(6 ),该激光束经过物镜沿着光轴指向样品(4 )并且画出 一个封闭的切割线， 其特征在于，所有在光轴上布置的、确定激光脉沖和切割线的参数的 元件连接在一个中央计算单元上。
11. 按照权利要求10所述的装置，其特征在于，中央计算单元 借助于图像处理通过元件的协调调整沿着封闭切割线连续改变参数。
12. 按照权利要求10所述的装置，其特征在于，中央计算单元 仅仅在结束封闭的切割线之前才连续改变确定激光脉冲和切割线的参数。
13. 按照权利要求10至12之一所述的装置，其特征在于，确定 激光脉冲和切割线的参数的元件包含一个X/Y移位单元、 一个光圈单 元、 一个衰减单元、 一个聚焦单元、 一个UV激光器和一个偏转单元。
14. 按照权利要求10至12之一所述的装置，其特征在于，中央 计算单元给元件提供相应的调节信号。
15. 按照权利要求10至14之一所述的装置，其特征在于，设置 了一个显示用户界面的监视器，其中用户界面包含一个滑块，用该滑 块可以在结束封闭切割线之前确定参数的连续改变。
16. 按照权利要求13所述的装置，其特征在于，所述X/Y移位 单元包含一个X/Y工作台和一个控制单元。
17. 按照权利要求13所述的装置，其特征在于，所述光圈单元 包含一个可调节的针孔光阑或彩虹器和控制单元。
18. 按照权利要求13所述的装置，其特征在于，所述衰减器单 元包含一个滤光器和一个控制单元。
19. 按照权利要求13所述的装置，其特征在于，所述UV激光器 直接与计算单元连接。
20. 按照权利要求13所述的装置，其特征在于，所述偏转单元 包含一对楔形板和一个控制单元。
全文摘要
公开了一种激光显微解剖方法和用于激光解剖的装置。借助于激光器的激光脉冲沿着一条封闭切割线从放置在平面载体上的生物样品上切下切片。同步于激光脉冲沿着封闭切割线连续改变确定激光脉冲和切割线的参数。所有布置在光轴上的、确定激光脉冲和切割线的参数的元件都连接在一个中央计算单元上。
文档编号G01N1/28GK101198855SQ200680021248
公开日2008年6月11日 申请日期2006年6月14日 优先权日2005年6月16日
发明者J·韦斯纳 申请人:莱卡微系统Cms有限责任公司