专利名称：一种特异性结合稀土纳米颗粒的多肽及其筛选方法
技术领域：
本发明属于纳米生物学领域，具体涉及一种特异性结合稀土纳米颗粒的多肽及其筛选方法。
背景技术：
基于稀土的上转换发光纳米颗粒(upconversion nanophosphors, UCN)作为新一代生物发光标记，相比有机荧光染料和量子点等下转换发光标记而言，上转换发光纳米颗粒具有光稳定性好、化学稳定性高、吸收和发射带很窄、发光寿命长、潜在生物毒性小等优点。上转换发光标记因采用近红外连续激光作为激发源，具有较深的光穿透深度、无生物背景荧光干扰、对生物组织几乎无损伤等显著优势，使其成为生物成像的理想标记物。此外，由于稀土上转换纳米材料为稀土掺杂氟化物纳米颗粒，其具有较低的声子能，可以降低非辐射跃迁提高发光强度，在氧化物、硫化物、磷化物等众多基质中脱颖而出，近年来也被广泛应用在分析检测、疾病治疗等领域。然而，稀土上转换纳米颗粒作为无机纳米颗粒，用于体内应用及临床试验之前还存在着许多问题。例如，其易团聚且不溶于水，很难应用于体内环境；在体内进行生物成像及体内光动力治疗应用时，其会与很多组织、细胞及生物分子进行非特异性的粘附，影响作用效果；进入细胞或动物体内，其会引发严重的细胞自噬，甚至导致细胞死亡等。目前，针对于无机纳米颗粒的表面改性方法主要是通过各种共价和非共价手段，采用硅胶(CN101434748)、脂肪酸(CN1400167)、聚乙二醇(CN101038290)、壳聚糖(CN101411893)、蛋白、多肽等改善纳米颗粒的表面特性。在这些方法中，值得注意的是利用特异性结合肽涂层包裹的方法进行表面改性，它具有无与伦比的多功能性、生物相容性、简单和可扩展性。目前，国内外主要报道的特异性结合多肽主要是针对与体内外组织器官、细胞及蛋白结合。例如，与正常或癌变组织器官特异性结合的多肽(CN101531706、CN101827583A、CN15630 78、CN102060909A、CN101891803A);与正常或癌变细胞特异性结合的多肽(0附01918433六、0附709905、0附763082、0附01033251、0附900108);以及与体内蛋白质特异性结合的多肽(CN102060913A、CN1823087、CN1262688、CN102105487A、CN101146822、CN1721432、CN1687128、CN101225108、CN101113164、CN101481418)。然而，针对无机纳米颗粒的特异性结合多肽报道甚少，仅有的为对钛、银、硅材料的结合多肽(CN1829734)及金属镍的高亲和力结合肽(CN1911956)。
发明内容
本发明提供了一种方法，利用噬菌体展示技术通过噬菌体展示文库筛选出具有特异性结合稀土纳米颗粒能力的多肽。本发明的方法包括如下步骤:(a)将噬菌体展示多肽库与稀土纳米颗粒混合孵育；(b)回收结合在稀土纳米颗粒上的噬菌体；(C)扩增回收的噬菌体用于稀土纳米颗粒下一轮结合筛�。�(d)重复上述(a)到(c)的步骤至少一次；(e)对回收的噬菌体挑取单克�。庑蚝蠡竦盟嗦氲恼故径嚯摹Ｔ谑凳├校τ帽痉⒚鞯姆椒ㄊ侗鸪龅亩嚯木哂幸桓霰嗦胝故径嚯腃TARSPWIC (RE-0,SEQ ID NO:1)的核苷酸序列。携带该展示多肽的噬菌体显示出特异性的高亲和力结合稀土纳米颗粒的能力。本发明中还提供了高亲和力的特异性结合稀土纳米颗粒的多肽及其类似物的化学合成，这些类似物包括噬菌体展示技术筛选鉴定出的氨基酸序列。包括含有噬菌体展示肽的氨基酸序列的特定多肽及其类似物，显示出能够高特异性结合稀土纳米材料的能力。这些稀土纳米材料包括稀土金属氧化物，稀土金属硫化物，稀土金属硫氧化物，基于稀土元素掺杂的上转换发光纳米材料以及一切含有稀土元素的化合物。任何本领域的技术人员所熟知的这些多肽或蛋白质的生产技术包括但不限于通过诸如重组技术等标准的分子生物学技术来表达肽或蛋白质、从自然原料中分离肽或蛋白质、或者化学合成这些肽或蛋白质等，都包括在本发明的保护范围之内。在一个较佳的实施例中，合成出一个序列为ACTARSPWICG (RE-1，SEQ ID NO:2)的多肽，RE-1包括了 RE-O的序列，即来源于噬菌体M13外壳蛋白上的RE-O序列加上两个末端氨基酸A和G。在另一些实施例中，RE-1的多肽类似物也被合成出来。这些多肽类似物包括RE-3 (ACffPATRISCG, SEQ ID NO:4)，它是RE-1两端的各2个氨基酸不变、中间七个氨基酸顺序打乱形成的；RE-2X(ACTARSPWICGGGACTARSPWICG，SEQ ID NO: 13)，它是由两个 RE-1组成的。已经证实这些多肽及其类似物高亲和力的特异性结合稀土纳米材料的能力。在另一些实施例中，RE-1的多肽类似物也被合成出来。这些多肽类似物包括RE-2 (TARSPWI，SEQ ID NO:3)，它是RE-1去掉两端各2个氨基酸后剩余的中间七个氨基酸组成的；RE_4 (AATARSPffICG, SEQ ID NO:5)，它是RE-1的一个单独氨基酸被替换(C —A);RE-5 (ACAARSPffICG, SEQ ID NO:6)，它是RE-1的一个单独氨基酸被替换(T —A);RE-6 (ACTAASPffICG, SEQ ID NO:7)，它是RE-1的一个单独氨基酸被替换(R —A);RE-7 (ACTARAPffICG, SEQ ID N0:8)，它是 RE-1 的一个单独氨基酸被替换(S — A);RE-8 (ACTARSAffICG, SEQ ID NO:9),它是 RE-1 的一个单独氨基酸被替换(P — A) ;RE_9(ACTARSPAICG, SEQ ID NO: 10)，它是 RE-1 的 一个单独氨基酸被替换(W — A) ;RE_10(ACTARSPffACG, SEQ ID NO:11 )，它是 RE-1 的一个单独氨基酸被替换(I — A) ;RE_11(ACTARSPff I AG, SEQ ID NO:12)，它是RE-1的一个单独氨基酸被替换(C — A)。已经证实这些多肽及其类似物一般亲和力结合稀土纳米材料的能力。在另一些实施例中，RE-1的多肽类似物也被合成出来。这些多肽类似物包括RE-Ag (ACTARSPffICGGGNPSSLFRYLPSD, SEQ ID NO:14)，它是由 RE-1 和金属银特异性结合肽(NPSSLFRYLPSD)组成的，已经证实了它可以同时与稀土纳米颗�：徒鹗粢咔缀土Φ奶匾煨越岷�。RE-Ti (RKLPDAGGGACTARSPffICG, SEQ ID NO: 15)，它是由 RE-1 和金属钛特异性结合肽(RKLPDA)组成的，已经证实了它可以同时与稀土纳米颗�：徒鹗纛迅咔缀土Φ奶匾煨越岷�。RE-AT (CLSYYPSYCGGACTARSPWICG, SEQ ID NO: 16)，它是由 RE-1 和凋亡细胞靶向肽(CLSYYPSYC)组成的，已经证实了它不仅可以与稀土纳米颗粒高亲和力的特异性结合，而且可以将稀土纳米颗粒靶向到凋亡细胞表面。RE-PH (SMSIARLGGACTARSPffICG,SEQ ID NO:17)，它是由RE-1和前列腺组织靶向肽(SMSIARL)组成的，已经证实了它不仅可以与稀土纳米颗粒高亲和力的特异性结合，而且可以将稀土纳米颗粒靶向到前列腺组织。RE-BH (CLEVSRKNCGGACTARSPffICG, SEQ ID NO: 18)，它是由 RE-1 和脑组织靶向肽(CLEVSRKNC)组成的，已经证实了它不仅可以与稀土纳米颗粒高亲和力的特异性结合，而且可以将稀土纳米颗粒靶向到脑组织。RE-LH (CGFECVRQCPERCGGACTARSPWICG, SEQ ID NO:19)，它是由RE-1和肺脏组织靶向肽(CGFECVRQCPERC)组成的，已经证实了它不仅可以与稀土纳米颗粒高亲和力的特异性结合，而且可以将稀土纳米颗粒靶向到肺脏组织。RE-DH(ACTARSPffICGGPKKKRKVC, SEQ ID NO:20)，它是由 RE-1 和核酸定位肽(PKKKRKV)组成的，已经证实了它不仅可以与稀土纳米颗粒高亲和力的特异性结合，而且可以将稀土纳米颗粒靶向到细胞核。RE-SMAC (ACTARSPffICGGGAVPIAQK, SEQ ID NO:21 )，它是由 RE-1 和促凋亡多肽SMAC(AVPIAQK)组成的，已经证实了它不仅可以与稀土纳米颗粒高亲和力的特异性结合，而且可以将稀土纳米颗粒靶向到凋亡细胞。RE-1-RGD (CRGDCGGACTARSPffICG, SEQ ID NO:22)，它是由RE-1和肿瘤细胞靶向肽R⑶组成的，已经证实了它不仅可以与稀土纳米颗粒高亲和力的特异性结合，而且可以将稀土纳米颗粒靶向到肿瘤细胞。本发明也提供了编码诸如多肽RE-O (SEQ ID NO:1)、RE_1 (SEQ ID NO:2)、RE_2X(SEQ ID NO:13), RE-3 (SEQ ID NO:4)或者是它们的部分的分离的核苷酸、同系物和类似物，或者在严格条件下杂交为编码SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:4或者是它们的部分所示的氨基酸序列的核苷酸序列，都具有高亲和力的特异性结合稀土纳米颗粒的能力。进一步地，本发明还提供了核苷酸、同系物和类似物，包括编码SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO:4所示氨基酸序列、它们的部分、或者是它们的互补序列的核苷酸序列。本发明还提供了一种评估纳米材料悬浮能力的方法，包括如下步骤:(a)将纳米材料悬浮液置于紫外检测池中；(b)用该纳米材料的紫外特征吸收波长对样品池中的纳米材料进行实时观测和扫描，得出时间动力学曲线；(c)根据时间动力学曲线评估纳米材料悬浮能力。本发明还提供了一种评估纳米材料沉降速率和扩散能力以及与细胞相互作用的方法，包括如下步骤:Ca)将细胞培养在盖玻片上，正面细胞朝上或细胞朝下分别置于细胞培养板中，盖玻片架在小玻璃体上；(b)将纳米材料培养基倒入细胞培养板中，使得细胞充分浸入培养基中，细胞盖玻片的位置正好位于液体的中间高度；(C)用装备有红外激光器的荧光显微镜观察细胞表面上 结 合的纳米材料；(d)根据荧光观察结果评估纳米材料沉降速率和扩散能力以及与细胞相互作用。本发明还提供了一种评估纳米材料沉降速率和扩散能力以及与细胞相互作用的装置，所述装置包括细胞培养板、盖玻片、小玻璃体，所述小玻璃体位于细胞培养板中，所述盖玻片架在小玻璃体上。本发明提供了能够特异性高亲和力结合稀土纳米颗粒的多肽，该多肽能够结合在纳米颗粒表面形成包覆层，从而改善稀土纳米颗粒在水中的悬浮性能，阻止颗粒间的聚合，降低颗粒间的相互作用，也降低了稀土纳米颗粒与细胞表面，细胞培养板表面及其他介质表面的非特异性粘附能力。
图1为特异性与Nd2O3结合的噬菌体数量结果图。图2为验证RE0B-1噬菌体与Nd2O3结合的能力的PCR结果图。图3为不同浓度的RE-1短肽对RE0B-1噬菌体与Nd2O3结合能力的抑制效果结果图。图4为RE-1短肽与不同无机纳米材料的结合能力结果图。图5为UCN与RE-1的结合表征结果图。其中，图5A为UCN与RE-1短肽的结合透射电镜图；图5B为UCN与RE0B-1噬菌体的结合透射电镜图；图5C为UCN与RE-1短肽的结合的扫描电镜图。图6为上转换发光纳米材料的粒径分析结果图。其中，图6A为UCN的粒径分布；图6B为UCP的粒径分布；图6C为UCN-S的粒径分布。图7为上转换发光纳米材料与RE-1的结合曲线图。其中，图7A (UCN)和图7B(UCP)为结合的时间梯度曲线；图7C (UCN)、图7D (UCP)和图7E (UCN-S)为结合的浓度梯度曲线。图8为环境对上转换发光纳米材料与RE-1结合的影响。其中，图8A (UCN)和图8B (UCP)为不同pH值的影响；图8C (UCN)和图8D (UCP)为不同盐离子浓度的影响；图8E(UCN)和图8F (UCP)为不同温度的影响。图9为RE-1与上转换发光纳米材料结合后随时间的解离情况。其中，图9A为UCN的解离结果；图9B为UCP的解离结果。图10为RE-1提高上转换发光纳米材料悬浮能力的时间动力学曲线结果图。其中，图1OA为UCN的时间动力学曲线；图1OB为UCP的时间动力学曲线。图11为RE-1降低上转换发光纳米材料的非特异性粘附能力检测结果图。其中，图1IA和图1lB为UCN的检测结果；图1lC和图1lD为UCN-S的检测结果。
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图12为RE-1降低上转换发光纳米材料在溶液中的扩散能力检测结果图。其中，图12A和图12B为实验装置示意图；图12C、图12D和图12E为UCN的检测结果；图12F、图12G和图12H为UCP的检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。实施例1、噬菌体展示技术筛选特异性与Nd2O3结合的短肽用来筛选特异性与Nd2O3结合的肽的文库,是由New England Biolabs (Mass,MA)提供的，为含有二硫键的七肽文库(Ph.D.-C7C)。这个文库中的随机片段的两侧是半胱氨酸残基，它们可以在噬菌体组装过程中被氧化形成二硫键的连接，这样就形成一个环肽和靶对象相互作用。这个文库含有超过二十亿个克隆数。文库中随机肽在小外壳蛋白PlII的氨基端，所以每个噬菌体颗粒都表达五个拷贝。Ph.D.-C7C文库中噬菌体表达随机序列的位置之前是丙氨酸-半胱氨酸。在随机肽和PlII蛋白间含有短的连接序列(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸_丝氨酸)。(Ph.D. _C7C卩遼菌体肽展示试剂盒，http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp)。将 2 μ I 的 101° 个卩遼菌体与 Iml Nd203( lmg/ml,购自广州惠州瑞尔化学)混合，在37°C摇床中孵育2h，12000rpm高速离心IOmin后，沉淀用TBST (含有2%吐温-20，pH7.5)洗涤10次，将结合在Nd2O3上的噬菌体回收，然后与0.5ml快速生长的大肠杆菌ER2378 (购自New England Biolabs, Mass, MA)混合，鮮育0.5h后加入20ml的LB培养基(胰蛋白胨0.2g ;酵母提取物0.1g ;氯化钠0.2g)中扩增6h。扩增的噬菌体在磷酸缓冲液(150mM NaCl,50mM Tris_HCl，pH7.5)中重悬，并用来做第二轮的筛选。第一轮大约回收了 100个噬菌体，第三轮扩增后的噬菌体与Nd2O3的结合效率比噬菌体库提高了两个数量级(图1)。将第三轮回收的卩遼菌体铺在含有X-gal(5-bromo-4-chloro-3-1ndolyl-β _D_galactoside)和 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)的 LB 平板上，随机挑取 15 个蓝色的噬菌斑，用DNA自动测序仪(ABI3730)进行测序。其中12个(命名为RE0B-1)都是含有同样的插入序列，编码的肽序列是CTARSPWIC (RE-0, SEQ ID NO:1)0实施例2、鉴定RE0B-1噬菌体与Nd2O3的结合力将滴度为IO5的RE0B-1噬菌体与滴度为IO8的AP-1噬菌体(噬菌体库随机选取的随机噬菌体，用作对照，其编码的肽序列为CNATLPHQC，SEQ ID NO:23)混合，与100 μ I Nd2O3(lmg/ml)在37°C下孵育2h，12000rpm高速离心IOmin后，沉淀用TBST (含有2%吐温-20，pH值7.5)洗涤10次，将沉淀中结合的噬菌体用Iml含有lmg/ml BSA的0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱，并铺在LB平板上。随机挑选50个蓝色噬菌斑，每个噬菌斑同时进行双PCR反应。一个用RE0B-1噬菌体的特异性引物(5’ -CGAGGTCGCCTTGGATTTGC-3’ )进行PCR反应，一个用AP-1噬菌体的特异性引物(5’ -GACCAGTCGCATCCGCAGCA-3’)进行PCR反应。PCR反应所需的另外的引物由载体上的序列组成，为这两个反应共享。PCR产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，结果用凝胶成像系统(Tanonl600, Tanon, China)拍照。结果显示，由于加入的RE0B-1噬菌体和AP-1噬菌体的滴度相差1000倍，而PCR的结果RE0B-1:AP-1=12:1，因此RE0B-1噬菌体与Nd2O3的结合力比AP-1噬菌体高12000倍。实施例3、特异性结合肽及其类似物的化学合成本申请中的多肽委托上海吉尔生化公司利用标准的FMOC固相合成法在多肽自动合成仪(CS536-1381，CS Bio C0., Menlo Park，CA)中合成，并用HPLC纯化使其纯度大于95%,利用质谱仪(Therm oFisher Scientific, Thermo, USA)鉴定分子量。序列ACTARSPWICG (RE-1，SEQ ID NO:2)的肽合成步骤如下。末端氨基酸丙氨酸和甘氨酸来源于M13表面蛋白。RE-1使用标准的FMOC固相合成法，一般的手动合成步骤如下:将大约 0.2mM Fmoc-Gly-Wang resin 加到手动反应试管(Peptide International),加入DMF使其膨胀2h。然后加入20%哌啶/DMF反应2min以除去Fmoc保护基团，重复一次去保护基的步骤，冰反应20min。阳性的Kaiser检测结果表明树脂上有自由氨基。氨基酸残基按照如下的循环方法加到树脂上:按照RE-1的序列将三倍过量的Fmoc保护氨基酸、三倍过量的HOBT和三倍过量的DIPEA/DMF加到反应试管中。在N2流中偶联反应2h，反应试管用真空泵抽干。N端保护的肽用DMF (5次X Imin)洗涤以除去过量的反应物，然后如前述方法用20%的哌啶/DMF去Fmoc保护基。反应试管用DMF洗涤以除去哌啶，进行重复的步骤偶联序列中的下一个氨基酸。合成好有侧链保护的Na-Fmoc-Ala-Cys-Thr-Ala-Arg-Ser-Pro-Trp-1le-Cys-Gly-resin结合物后,肽树脂结合物用DMF (4次X Imin)洗漆,并用真空抽干。氨基末端Fmoc保护基用20%哌啶/DMF除去。侧链的去保护以及肽树脂键的断裂用IOml的裂解液(95%三氟乙酸、2.5%水和2.5%三异丙基硅烷)在500rpm振荡下反应3h。将反应物转移到预称重的锥形瓶中，用冰的无水乙醚沉淀。粗产物真空干燥48h。将70-100mg的粗产物用反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化并冻干成粉末。肽的纯度用分析型RP-HPLC鉴定，其分子量用质谱仪鉴定。
使用上述相同方法合成对照肽ACNATLPHQCG (AP-1，SEQ ID NO:24)和多肽类似物及衍生物。AP-1是一个有相同末端氨基酸而包含不相干内部序列的11肽。FITC通过Acp偶联到RE-1和AP-1的氨基端。实施例4、鉴定多肽类似物与Nd2O3的结合力将100 μ g Nd2O3 分别与 RE-1, AP-1, RE-2，RE-3，RE-4，RE-5，RE-6，RE-7，RE-8，RE-9, RE-10等多肽混合，再分别加入滴度为IO8的RE0B-1噬菌体，孵育2h后，检测Nd2O3上结合RE0B-1噬菌体的量。IC5tl值反映了各种多肽竞争抑制RE0B-1噬菌体与结合氧化钕纳米的相对活性。结果如表I所示，多肽RE-1及其类似物与Nd2O3具有不同程度的结合力。表1、多肽RE-1及其类似物与Nd2O3的结合力
权利要求
1.一种筛选具有特异性结合稀土纳米颗粒能力的多肽的方法，包括噬菌体展示技术，其特征在于，所述方法包括如下步骤: Ca)将噬菌体展示多肽库与稀土纳米颗粒混合孵育； (b)回收结合在稀土纳米颗粒上的噬菌体； (c)扩增回收的噬菌体用于稀土纳米颗粒下一轮结合筛�。� Cd)重复上述(a)到(c)的步骤至少一次； (e)对回收的噬菌体挑取单克�。庑蚝蠡竦盟嗦氲恼故径嚯�。
2.一种特异性结合稀土纳米颗粒的多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID N0:1所示的多肽序列或其类似物。
3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述类似物是通过将SEQID N0:1所示的多肽序列的氨基酸增加、缺失、变换顺序或替换获得。
4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸增加的类似物为SEQID N0:2、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22 所示的多肽序列。
5.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸缺失的类似物为SEQID NO:3所示的多肽序列。
6.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸变换顺序的类似物为SEQIDNO:4所不的多妝序列。
7.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸替换的类似物为SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的多肽序列。
8.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列含有编码如权利要求2所示的多肽序列或其类似物的核苷酸序列。
9.一种评估纳米材料悬浮能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (a)将纳米材料悬浮液置于紫外检测池中； (b)用该纳米材料的紫外特征吸收波长对样品池中的纳米材料进行实时观测和扫描，得出时间动力学曲线； (C)根据时间动力学曲线评估纳米材料悬浮能力。
10.一种评估纳米材料沉降速率和扩散能力以及与细胞相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (a)将细胞培养在盖玻片上，正面细胞朝上或细胞朝下分别置于细胞培养板中，盖玻片架在小玻璃体上；· (b)将纳米材料培养基倒入细胞培养板中，使得细胞充分浸入培养基中，细胞盖玻片的位置正好位于液体的中间高度； (C)用装备有红外激光器的荧光显微镜观察细胞表面上结合的纳米材料； (d)根据荧光观察结果评估纳米材料沉降速率和扩散能力以及与细胞相互作用。
11.一种评估纳米材料沉降速率和扩散能力以及与细胞相互作用的装置，其特征在于，所述装置包括细胞培养板、盖玻片、小玻璃体，所述小玻璃体位于细胞培养板中，所述盖玻片架在小玻璃体上。
全文摘要
本发明提供了一种特异性结合稀土纳米颗粒的多肽及其筛选方法。所述多肽能够结合在纳米颗粒表面形成包覆层，从而改善稀土纳米颗粒在水中的悬浮性能，阻止颗粒间的聚合，降低颗粒间的相互作用，也降低了稀土纳米颗粒与细胞表面，细胞培养板表面及其他介质表面的非特异性粘附能力。
文档编号G01N21/33GK103145798SQ20121026013
公开日2013年6月12日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年6月7日
发明者温龙平, 张云娇 申请人:中国科学技术大学
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