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专利名称：：云南红药胶囊中毒性成分滇乌碱的质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及药品
技术领域：
，具体涉及云南红药胶囊中毒性成分滇乌碱的质量控制方法。技术背景云南红药原名云南七龙散，是云南植物药业有限公司生产的特色药品，是中药保护品种，属于部版标准。云南红药配方中主要药物为云南特产的民间中草药，其原料组份及其重量配比为三七100g重楼250g紫金龙50g玉葡萄根100g滑叶跌打95g大麻药75g金铁锁50g石菖蒲30g西南黄芩100g制黄草乌150g。以上十味按以下方法制备得到云南红药胶囊各位药材粉碎成细粉，过筛，混匀，制成颗粒，装入胶囊即得云南红药胶囊。云南红药已投放市场20多年，主要用于治疗胃肠、了宫、痔疮出血及咳嗽咯血出血.，对于治胃脘痛(胃、十二指肠溃疡及出血)、软组织损伤、风湿性关节炎等多种病症有显著疗效。云南红药胶囊中的制黄草乌是由黄草乌经过炮制而得。黄草乌为毛茛科植物黄草乌Aconitumvilmorinianumkomarov或滇南草乌AconitumaustroyunnanenseW.T.Wang的块根，经加工制成的直片或斜片。收载于《云南省药品标准》1996年版第76页。云南红药胶囊中的制黄草乌是一味毒性药材，目前尚无国家标准控制其毒性，我们于2002年制定了企业内控标准。本申请人曾获得的专利"云南红药片的质量控制方法"(专利号ZL200610010853.9),该专利针对云南红药片的整体配方进行质量控制方法，其中的毒性成分限量控制，是针对乌头碱的限量，且用薄层色谱法进行检测控制。但云南红药胶囊中的制黄草乌的主要活性成分是滇乌碱，也是最主要毒性成分。滇乌碱(Yunaconitine)，又名异乌头减，黄草乌减乙，Isoaconitine，GuayewuanineB，VilmorrianineB。分子式及分子量为C35H49N011;659.77。属萜类生物碱，无色棱晶(丙酮-石油醚)，mpl4卜143。C，[。]D21+37.7°(C=0.8，氯仿)。药理学研究表明，滇乌碱的毒性极高，具有较强的镇痛、抗炎和解热作用。我们制定的企业内控标准和对云南红药片的质量控制方法中对乌头碱的控制，均以不能满足对制黄草乌质量控制的需要，重新修订制黄草乌企业内控标准，并上升为国家标准，对控制云南红药胶囊产品乃至控制市场流通的制黄草乌质量，确保药品的安全性都具有重要意义。现有技术中对乌头属植物中含乌头碱的检测方法主要有中和法(主要测定生物碱)、分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)和色谱联用法等，乌头碱的检测方法较多，每种方法对乌头碱检测的侧重点各异，各有其优缺点；在实际的检测屮应根据实际情况选择测定方法(李路蛾等，乌头碱检测方法综述，成都大学学报(自然科学版)，2005,24(1):15-17)。照《中国药典》2005年版一部附录VIB薄层色谱法对乌头碱限量检査，仅用薄层色谱法对乌头碱作限量要求是不够的，还应同时制定其它生物碱的定量控制，并进行更准确的含量测定。照《中国药典》2005年版一部附录VID高效液相色谱法对云南红药胶囊处方中毒性成分滇乌碱进行了更准确的含量测定，并对滇乌碱进行了含量限定，准确的保证了毒性成分的控制。本申请人针对上述现有技术的不足，为了更好的控制云南红药胶囊产品及制黄草乌的质量，完善和研究出云南红药胶囊中毒性成分滇乌碱的质量控制方法。该方法由制黄草乌生药材的毒性控制、云南红药胶囊中滇乌碱含量控制、动物安全性试验控制制黄草乌生药材的毒性、高效液相色谱法(HPLC)检测毒性成分滇乌碱的含量四个步骤组成。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术质量标准中的不足，包括主要毒性成分滇乌碱未进行检测及仅用薄层色谱法对乌头碱作限量的方法较粗糙且未进行含量测定等缺陷，提供一种云南红药胶囊中毒性成分滇乌碱的质量控制方法，增强了云南红药胶囊产品的质量可控性，更好的确保药品的安全性。本发明的有益效果是1、试验表明本发明方法监控手段综合，增强了云南红药胶囊产品毒性成分的可控性。2、本发明方法操作简便、易于掌握，检测的准确度和精确度高，确保了处方中制黄草乌生药材的炮制合格，更好地确保药品的安全性。本发明方法的技术方案是由制黄草乌生药材的毒性控制、云南红药胶囊中滇乌碱含量控帝纟、动物安全性试验控制制黄草乌生药材的毒性、高效液相色谱法(HPLC)检测毒性成分滇乌碱的含量四个步骤组成，按以下步骤进行1、云南红药胶囊制黄草乌生药材的毒性控制按小鼠每千克体重计，将制黄草乌生药材细粉的毒性剂量控制在《2g/kg，按步骤3操作，小鼠不出现死亡为限量；当小鼠出现死亡时，则将黄草乌生药材按制黄草乌的常规方法进一步炮制，再通过步骤3操作，按小鼠每千克体重计，控制其制黄草乌生药材的毒性剂量《2g/kg;2、云南红药胶囊中滇乌碱含量控制在每粒《0.01mg，云南红药胶囊每粒重量为0.25g，当通过步骤4检测滇乌碱含量每粒>0.Olmg时，则通过步骤1和步骤4检测控制滇乌碱含量每粒《0.Olmg;3、动物安全性试验控制制黄草乌生药材的毒性(1)制黄草乌生药材的动物毒性试验药液的制备将制黄草乌生药材粉碎过80目筛，用纯化水配制成混悬液，制黄草乌生药材细粉给药剂量为2g/kg(按小鼠每千克体重计)。其药液浓度根据小鼠20g平均体重水平来计算确定，小鼠给药体积为0.2mL/10g，则每只小鼠给药体积为0.4mL，药液浓度为2g/kgX20g/0.4mL=0.1g/mL。(2)取小鼠20只灌胃，给药体积为0.2mL/10g，将上述混悬液一次灌入小鼠胃中，连续观察3d，小鼠不出现死亡，表明云南红药胶囊中制黄草的炮制合格。4、高效液相色谱法(HPLC)检测毒性成分滇乌碱的含量(1)供试品的制备取云南红药胶囊100粒，取胶囊中粉末置具塞锥形瓶中，加乙醚50ml及氨试液lmL，密塞，摇匀，放置过夜，滤过；药渣再加乙醚50mL，连续振摇lh，滤过，滤渣再用乙醚洗3-4次，每次20ml，滤过；合并滤液及洗液，60'C以下低温挥干乙醚。残渣加0.05mol/L硫酸液10ml使溶解，移入分液漏斗中，用硫酸液5ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用乙醚10ml振摇洗涤；酸液加氨试液调PH值至9，再用乙醚提取3次，每次10ml;合并醚液80'C以下低温蒸干；残渣加无水乙醇适量使溶解，移入10ml容量瓶中，用无水乙醇分次洗涤容器，洗液并入容量瓶内，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。(2)对照品的制备精密称取滇乌碱(纯度>98.0%)，加无水乙醇制成0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液。(3)色谱条件色谱柱U-bondapaKCN，7.8X300誦；流动相甲醇-水-氨水(35:65:0.5);柱温30°C;检测波长260nm;流量2mL/min;理论塔板数(按滇乌碱峰面积计算)应不低于0)4100。(4)测定方法分别精密取对照品溶液和供试品溶液10nl，注入高效液相色谱仪，按外标法计算，即得。具体实施例方式以下用实施例对本发明作进一步的说明，可以进一步清楚地了解本发明。实施例1云南红药胶囊制黄草乌生药材的毒性控制将制黄草乌生药材细粉的剂量，按小鼠每千克体重计，将制黄草乌生药材细粉的毒性剂量控制在《2g/kg，按步骤3操作，小鼠不出现死亡为限量；当小鼠出现死亡时，则将黄草乌生药材按制黄草乌的常规方法进一步炮制，再通过步骤3操作，按小鼠每千克体重计，控制其制黄草乌生药材的毒性剂量《2g/kg;'供试小鼠为ICR小鼠，日龄2530d，体重18~22g，雌雄各半，由昆明医学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(苏)2002-0011。取上述小鼠20只，灌胃给予制黄草乌，剂量为2g/kg，给药体积为0.2mL/10g，用蒸馏水将制黄草乌混悬后一次灌入小鼠胃中，连续观察3d，小鼠不出现死亡。受试药液浓度根据小鼠20g平均体重水平来计算确定，小鼠给药体积为0.2mL/10g，则每只小鼠给药体积为0.4mL，药液浓度为2g/kgX20g/0.4mL=0.1g/mL。实施例2高效液相色谱法(HPLC)检测毒性成分滇乌碱的含量Waters公司高效液相色谱仪；对照品滇乌碱由中国药品生物制品检定所提供(纯度>98.0%);样品制黄草乌药材、云南红药胶囊由本申请人云南植物药业有限公司提供。试剂甲醇、氨水、无水甲醇、乙醚和硫酸等，均为分析纯试剂。1、供试品的制备-取云南红药胶囊100粒，取胶囊中粉末置具塞锥形瓶中，加乙醚50ml及氨试液lmL，密塞，摇匀，放置过夜，滤过；药渣再加乙醚50mL，连续振摇lh，滤过，滤渣再用乙醚洗3-4次，每次20ml，滤过；合并滤液及洗液，60。C以下低温挥干乙醚。残渣加0.05mol/L硫酸液10ml使溶解，移入分液漏斗中，用硫酸液5ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用乙醚10ml振摇洗涤；酸液加氨试液调PH值至9，再用乙醚提取3次，每次10ml;合并醚液80。C以下低温蒸干；残渣加无水乙醇适量使溶解，移入10ml容量瓶中，用无水乙醇分次洗涤容器，洗液并入容量瓶内，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。2、对照品的制备精密称取滇乌碱(纯度〉98.0%)，加无水乙醇制成0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液。3、色谱条件色谱柱U-bondapaKCN(7.8X300mm);流动相甲醇-水-氨水(35:65:0.5);柱温3CTC;检测波长260nm;流量2mL/min;理论塔板数(按滇乌碱峰面积计算)应不低于(》)4100。4、测定方法分别精密取对照品溶液和供试品溶液10yl，注入高效液相色谱仪，按外标计算，即得。实施例3本发明方法的高效液相色谱法(HPLC)检测毒性成分滇乌碱的含量的测定条件试验1、色谱条件色谱柱U-bondapakCN(7.8X300mm);流动相甲醇-水-氨水(35:65:0.5);柱温30°C;检测波长260nm;流量2mLmin;理论塔板数(按滇乌碱峰面积计算)应不低于(》)4100。2、线性关系的考察精密吸取对照品溶液5，10,15，20，3(HU，按上述色谱条件测定峰面积；以峰面积积分值为纵坐标，滇乌碱进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算冋归方程，得回归方程Y=740538X-156707，r=0.9998，结果表明滇乌碱在2.0~16.0吗的检测范围内线性关系良好。3、精密度试验精密吸取对照品溶液各IOW，重复进样5次，测定滇乌碱峰面积积分值，计算相对偏差。测得滇乌碱峰面积积分值为3689669，3682072，3676388，3736132，3721764,相对偏差RSD=0.75%，表明本方法的精密度较好。4、重复性试验取同一供试品，分别进行供试品溶液的制备、测定，重复5次，测定滇乌碱的含量，计算相对偏差。测得滇乌碱含量为0.113%，0.118%,0.111%，0.105%,0.110%，相对偏差RSD4.02X，小于5%,符合要求。5、回收率试验采用加样回收法，取已知滇乌碱的含量的样品，分别加入不同量的滇乌碱对照品，按上述供试品溶液制备方法制备并测定，计算回收率，填入下表1，结果显示本发明方法回收率良好。表1回收实验结果表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4本发明的急性毒性试验(制黄草乌急性毒性实验)-1.材料1.1实验动物-ICR小鼠，日龄2530d，体重1822g，雌雄各半，由昆明医学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(苏)2002-0011。1.2受试样品制黄草乌由云南植物药业有限公司研发部提供，批号20070601。使用时将制黄草乌粉碎过80目筛，用纯化水配制成相应的混悬液。2.实验方法2.1小鼠LD50预测取小鼠20只，按序贯法进行预备试验，分5个剂量组，每组4只动物。测得小鼠口服制黄草乌的10(P/。致死率约为6.0g/kg，0%致死率约为1.5g/kg。连续观察7d。2.2」下式试验(LD50测定)参考药理实验方法学第二版(徐淑云主编)。按改良寇氏法进行LD50测定。取ICR小鼠40只，雌雄各半，分为4个组，每个剂量组10只动物，试验前禁食12h。确定高剂量对低剂量的组间剂量比为0.75。按0.2mL/10g,用蒸馏水混悬后一次灌入小鼠胃中，连续观察14d。各组受试药液浓度根据小鼠20g平均体重水平来计算确定。3.结果3.1急性中毒症状主要表现为精神萎靡，自发活动减少，出汗，张口呼吸，不食，肛周毛潮湿；给药后3d内死亡，尸检肉眼可见胃肠臌胀，其他脏器未见明显变化。3.2半数致死量(LD50)的计算结果见表l。LD50按以下公式计算LD50-log-1[Xm-i(5:p-0.5)]其中Xm为最大剂量组剂量的对数；i为相邻两组高剂量与低剂量的对数值之差；P为各组动物的死亡率，用小数表示；2p为各组动物死亡率的总和。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(其中2.67g/kg剂量组无死亡)LogLD50(X5G)的标准误(Sx5o)算法按下式Sx50=i.[S(P-P2)/n]1/2其中n为每组动物数，P为每组的死亡率。LD50的95。/。可信限按下式LD50的95%可信限=lg—1(X50±1.96SX50)LD50的平均可信限按下式LD50的平均可信限二LD50±(LD50高限-LD50低限)/2根据表2的结果最后算得LD50=4.624Sx50=0.0288LD50的95%可信限=4.0645.260g/kgLD50的95%平均可信限=4.624±0.598g/kg4.结论小鼠口服制黄草乌的LD50为4.624g/kg，其95%平均可信限为4.0645.260g/kg。参考此剂量，进行制黄草乌生药材毒性试验，得出本发明云南红药胶囊中制黄草乌生药材的毒性控制在制黄草乌生药材细粉剂量为2g/kg。权利要求1、一种云南红药胶囊中毒性成分滇乌碱的质量控制方法，其特征在于由制黄草乌生药材的毒性控制、云南红药胶囊中滇乌碱含量控制、动物安全性试验控制制黄草乌生药材的毒性、高效液相色谱法检测毒性成分滇乌碱的含量四个步骤组成，按以下步骤进行(1)云南红药胶囊制黄草乌生药材的毒性控制按小鼠每千克体重计，将制黄草乌生药材细粉的毒性剂量控制在≤2g/kg，按步骤(3)操作，小鼠不出现死亡为限量；当小鼠出现死亡时，则将黄草乌生药材按制黄草乌的常规方法进一步炮制，再通过步骤(3)操作，按小鼠每千克体重计，控制其制黄草乌生药材的毒性剂量≤2g/kg；(2)云南红药胶囊中滇乌碱含量控制在每粒≤0.01mg，云南红药胶囊每粒重量为0.25g，当通过步骤(4)检测滇乌碱含量每粒>0.01mg时，则通过步骤(1)和步骤(4)检测控制滇乌碱含量每粒≤0.01mg；(3)动物安全性试验控制制黄草乌生药材的毒性①制黄草乌生药材的动物毒性试验供试药液的制备将制黄草乌生药材粉碎过80目筛，用纯化水配制成混悬液，制黄草乌生药材细粉给药剂量按小鼠每千克体重计，其给药剂量为2g/kg；其药液浓度为0.1g/mL，小鼠给药体积为0.2mL/10g；②取小鼠20只灌胃，给药体积为0.2mL/10g，将上述混悬液一次灌入小鼠胃中，连续观察3d，小鼠不出现死亡，表明云南红药胶囊中制黄草乌的炮制合格；(4)高效液相色谱法检测毒性成分滇乌碱的含量①供试品的制备取云南红药胶囊100粒，取胶囊中粉末置具塞锥形瓶中，加乙醚50ml及氨试液1mL，密塞，摇匀，放置过夜，滤过；药渣再加乙醚50mL，连续振摇1h，滤过，滤渣再用乙醚洗3-4次，每次20ml，滤过；合并滤液及洗液，60℃以下低温挥干乙醚；残渣加0.05mol/L硫酸液10ml使溶解，移入分液漏斗中，用硫酸液5ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，用乙醚10ml振摇洗涤；酸液加氨试液调PH值至9，再用乙醚提取3次，每次10ml；合并醚液80℃以下低温蒸干；残渣加无水乙醇适量使溶解，移入10ml容量瓶中，用无水乙醇分次洗涤容器，洗液并入容量瓶内，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；②对照品的制备精密称取纯度>98.0％的滇乌碱，加无水乙醇制成0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液；③色谱条件色谱柱U-bondapaKCN，7.8×300mm；流动相甲醇-水-氨水，甲醇水氨水＝35650.5；柱温30℃；检测波长260nm；流量2mL/min；按滇乌碱峰面积计算，理论塔板数≥4100；④测定方法分别精密取对照品溶液和供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，按外标法计算，即得。全文摘要本发明公开了云南红药胶囊中毒性成分滇乌碱的质量控制方法，属药品
技术领域：
。该方法有制黄草乌生药材的毒性控制、胶囊中滇乌碱含量控制、动物安全性试验控制制黄草乌生药材的毒性、高效液相色谱法检测毒性成分滇乌碱的含量。其制黄草乌生药材的毒性剂量≤2g/kg，滇乌碱含量每粒≤0.01mg，色谱柱U-bondapaKCN，7.8×300mm；流动相甲醇-水-氨水(35∶65∶0.5)；柱温30℃；检测波长260nm；流量2mL/min；理论塔板数≥4100。该方法监控手段综合，操作简便易掌握，检测准确度和精确度高，增强了云南红药胶囊毒性成分的可控性，更好地确保了制黄草乌生药材的炮制合格及药品的安全性。文档编号G01N30/36GK101396492SQ20081005892公开日2009年4月1日申请日期2008年9月17日优先权日2008年9月17日发明者吕小波,敏周,文李,武正才,黄春球申请人:云南植物药业有限公司