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专利名称：含铝离子的用于蛋白质染色的处理液和使用它的染色方法
技术领域：
本发明涉及包含铝离子的、用于蛋白质染色的染色液和使用该处理液的染色方法。
背景技术：
蛋白质组学中对于实验结果的分析重要的蛋白质染色是使二维空间的蛋白质变得可见的步骤。此后，说明书中所述的“着色(dying)”指“染色(staining)”。
双向凝胶电泳(此后称作“2-D凝胶电泳”)是在二维空间中利用作为蛋白质特征的分子量和电荷的差异将细胞中的蛋白质展开的方法。各种条件下蛋白质表达差异的对比分析就是在2-D凝胶电泳的基础上进行的。
传统上，基于蛋白质组学中2-D凝胶电泳的蛋白质染色通过诸如银染、基于荧光的染色和CBB染色如G250或R250的染色技术进行。
通过银染料的银染虽然表现出优异的灵敏性，但它具有一个缺陷，即灵敏性依赖于蛋白质的类型。
和其他染料相比，无论如何CBB染色都具有经济优势，因为它们不需要昂贵的器具。另外，CBB染色具有容易的实验过程，相对不依赖于蛋白质的类型。结果，CBB染色已经通过2-D凝胶电泳有效地用于分析各种条件下的蛋白质。
虽然CBB染色通常用于蛋白质组学，但它具有约30ng/条带或更高的低检测限。使用包含铵离子的染色液通过促进CBB染色过程中染料和蛋白质的疏水反应来提高染色灵敏性。需要约1至2天对蛋白质进行染色和脱色，该方法具有相对长的加工时间。

发明内容
提供了包含铝离子的、用于蛋白质染色的染色液和使用其进行蛋白质染色的方法。
下文将详细描述本发明。
在通过CBB染色对蛋白质进行染色时，提供了包含铝离子的染色液。
具有3+阳离子的铝离子(Al3+)增加染色速度，强化染料CBB与蛋白质的相互作用。
铝离子优选由选自硫酸铝、氯化铝和醋酸铝的铝盐提供，最优选由硫酸铝提供。
优选的是，铝离子的存在量在总染色液的1％至40％范围内。如果铝盐的量少于1％，对染色时间和染色效力的影响减小。但是，如果高于40％，则鉴定不到蛋白质，因为背景部分深度染色。
染色液包含含量在总染色液的5％至40％范围内的醇化合物。对于适当蛋白质染色来说，醇化合物是染色液中的必要元素。如果醇化合物的量低于5％，则染色推迟。但是，如果高于40％，染色不能适当地进行。
醇化合物优选选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和异丁醇，较优选乙醇。
然后，提供了使用包含铝盐的上述染色液进行蛋白质染色的方法，包括下列步骤(a)用去离子水洗涤凝胶，所述的凝胶通过将一定程度纯化的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(以后称作“SDS-PAGE”)获得；(b)用第一溶液和第二溶液处理所得的凝胶；(c)在包含铝离子的第三溶液中处理所得的凝胶；(d)往所得的包括凝胶的第三溶液中加入包含CBB染料的第四溶液。
在步骤(a)中，对一定程度纯化的蛋白质进行SDS-PAGE之后，从玻璃板取下的凝胶用去离子水洗涤。
在步骤(b)中，步骤(a)所得的凝胶用包含30％乙醇和2％磷酸的第一水溶液处理三次，然后用包含2％磷酸盐的第二水溶液处理三次。
在步骤(c)中，步骤(b)所得的凝胶浸在包含1％至40％铝离子、5％至40％醇化合物和2％磷酸的第三水溶液中。
在步骤(d)中，作为CBB染色液的包含2％G250的第四水溶液和0.2g/L叠氮钠加入浸有步骤(c)所得凝胶的第三溶液中。这里，调节第四溶液使之具有0.5至2范围内的终浓度。当凝胶的尺寸为7×10cm时，使用的第一至第四溶液的量为50ml，当尺寸为20×24cm时，使用量为250ml。在第一至第三溶液中的处理时间分别是30分钟。在包含CBB染料的第四溶液中的处理时间为30min至48小时。较长的处理时间是适用的。
图1a至1d是说明从兔、E.coli、牛或蛋中分离的蛋白质进行双向凝胶电泳之后各种蛋白质的染色结果以表现本发明效果的图。
图1a是说明使用根据本发明的、包含15％铝离子的处理液的各种蛋白质CBB染色结果的图，图1b是说明使用根据本发明的、包含5％铝离子的处理液的各种蛋白质CBB染色结果的图。
另一方面，图1c是说明使用包含铵离子的处理液的各种蛋白质CBB染色结果的图，图1d是说明使用酸性银的各种蛋白质的酸性银染结果的图。
图1a至1d所示的各个泳道示出了每个蛋白质的分子量(单位kDa)。泳道依次表示兔骨骼肌肌浆球蛋白(200kDa)、E.coli磷酸化酶b(116kDa)、兔骨骼肌半乳糖苷酶(97kDa)、牛血清白蛋白(66kDa)、蛋清卵清蛋白(45kDa)和牛碳酸酐酶(31kDa)。图上方的数字表示蛋白质的稀释程度(2倍系列稀释)，数字越大，稀释程度越大。
当说明使用包含铝离子的处理液的CBB染色结果的图1a和1b与说明使用包含铵离子的处理液的CBB染色结果的图1c相比较时，图1a和1b中的蛋白质在高稀释倍数的情况下染色良好。这里表明本发明具有更高的灵敏性。
根据本发明的蛋白质的检测限低于0.5ng/条带。使用包含铝离子的处理液时的染色灵敏性比使用包含铵离子的处理液时提高约2至10倍。
当说明使用包含铝离子的染色液的CBB染色结果的图1a和1b与说明银染结果的图1d相比较时，银染表现出依赖于蛋白质的类型，因为第一泳道的肌浆球蛋白几乎未染色；而CBB染色表现出不依赖于蛋白质的类型，因为所有的蛋白质都得到了检测。
图2是说明染色力依赖于处理时间的相对变化的图。当蛋白质用包含铝离子的染色液进行CBB染色时，染色强度优于使用包含铵离子的处理液进行染色时。这里表明染色时间大大缩短。
和使用铵离子时相比，使用铝离子时染色时间缩短了10倍(10％)。90％以上的蛋白质得以染色需要两小时。
图3是说明从兔大脑组织获得的100μg蛋白质的CBB染色结果的图。如图3中不同的点所示，通过使用公开的、包含铝离子的染色液进行CBB染色，所有的蛋白质都得以染色。
当没有蛋白质时，染料和凝胶结合，从而形成背景。但是，在本发明中，即使在不进行脱色步骤的时候，通过调节上述铝离子、醇化合物和CBB染色液的量来测定蛋白质的位置和量也是没有问题的。


图1a是说明凝胶电泳之后，使用根据本发明的、包含15％铝离子的染色液的各种蛋白质CBB染色结果的图。
图1b是说明凝胶电泳之后，使用根据本发明的、包含5％铝离子的染色液的各种蛋白质CBB染色结果的图。
图1c是说明凝胶电泳之后，使用包含铵离子的染色液的各种蛋白质CBB染色结果的图。
图1d是说明凝胶电泳之后，使用酸性银的各种蛋白质银染结果的图。
图2是说明染色强度依赖于处理时间的相对变化的图。
图3是说明从兔大脑组织获得的100μg蛋白质的CBB染色结果的图。
优选实施方案下文将参考优选的实施方案来解释本发明。本发明的实施方案是示例性的，并不局限于所公开的具体形式。
实施例使用7×10cm的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶将由兔骨骼肌肌浆球蛋白、E.coli磷酸化酶b、兔骨骼肌半乳糖苷酶、牛血清白蛋白、蛋清卵清蛋白和牛碳酸酐酶组成的纯化蛋白质进行电泳之后，从玻璃板上取下的凝胶用去离子水简单地洗涤。凝胶用包含30％乙醇和2％磷酸水溶液的第一溶液(50ml)三次处理30分钟，并用包含2％磷酸水溶液的第二溶液(50ml)三次处理30分钟。
然后，将凝胶在包含15％硫酸铝、20％乙醇和2％磷酸盐溶液的第三溶液(50ml)中浸泡30分钟。然后，往其中加入包含2％G250和0.2g/L叠氮钠的第四溶液，使具有总溶液1％的终浓度(CBB G250的终浓度为0.002％)。这里，通过将染色时间调节至120分钟对蛋白质进行所公开的CBB染色。
工业应用公开的、包含铝离子的、用于蛋白质CBB染色的染色液具有较低的检测限，从而可以提高灵敏性，缩短染色时间，且其进行不需要脱色步骤。
权利要求
1.一种包含铝离子的、用于蛋白质染色的染色液，其中蛋白质由考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)(CBB)染料染色。
2.权利要求1的染色液，其中铝离子由选自硫酸铝、氯化铝和醋酸铝的铝盐提供。
3.权利要求1的染色液，其中铝离子的存在量在总染色液的1％至40％范围内。
4.权利要求1的染色液，其中染色液包括含量在总染色液的5％至40％范围内的醇化合物。
5.一种蛋白质染色的方法，包括以下步骤(a)用去离子水洗涤凝胶，所述的凝胶通过将一定程度纯化的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(以后称作“SDS-PAGE”)获得；(b)用第一溶液和第二溶液处理所得的凝胶；(c)在包含铝离子的第三溶液中处理所得的凝胶；(d)往所得的包括凝胶的第三溶液中加入包含CBB染料的第四溶液。
6.权利要求5的方法，其中铝离子由选自硫酸铝、氯化铝和醋酸铝的铝盐提供。
7.权利要求5的方法，其中铝离子的存在量在第三溶液的1％至40％范围内。
8.权利要求5的方法，其中第三溶液包括含量在第三溶液的5％至40％范围内的醇化合物。
全文摘要
本发明涉及包括铝离子的、用于蛋白质染色的处理液和使用该处理液的染色方法。更具体地说涉及包括铝离子的、用于蛋白质染色的处理液和使用该处理液的染色方法，所述处理液在通过考马斯亮蓝CBB染料对蛋白质染色时使用。所公开的包含铝离子的、用于蛋白质CBB染色的处理液可以降低检测限，从而提高灵敏性，缩短染色时间，并可省略脱色步骤。
文档编号G01N33/68GK1642972SQ03806729
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月24日 优先权日2002年3月23日
发明者姜撤勋, 徐命九 申请人:姜撤勋