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专利名称：一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结合了免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术的三碘甲状腺原氨酸(T3)的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术：
三碘甲状腺原氨酸(3，5，3’-三碘甲状腺原氨酸，T3)是一种分子量为651的碘化酪氨酸，与甲状腺素(T3) —样是一种重要的甲状腺激素。T3、T3在循环中均有结合态和游离态两种形式，正常情况下两种形式之间保持着动态平衡。Τ3的测定对诊断甲状腺机能紊乱和监测甲状腺机能低下非常有意义。对甲状腺机能亢进的病人来讲，大多数患者的总Τ3和总Τ3的水平是一致的。不过在某些病例中，甲状腺机能亢进仅仅是由于Τ3的产生增多引起的(Τ3型甲亢症)，因此在FT3 (血清游离甲状腺素)正常的甲亢患者，建议检测Τ3，尤其对于FT3和TSH (促甲状腺激素)均正常的患者(一般患者常首先检测FT3和TSH)，更应进一步检测Τ3。严重甲状腺机能减退患者的总Τ3水平通常偏低而中度甲状腺机能减退患者总Τ3水平可能正常。非甲状腺疾病的严重病人或是在术后，可见Τ3水平偏低而反Τ3的水平升高。新生儿及婴儿的Τ3水平一般较高，但在某些老年病例中Τ3水平也会偏低。目前Τ3的检测方法目前全部采用免疫学方法。临床免疫检测技术是利用抗原抗体反应原理检测生物体内物质的技术，该技术的引入使临床化学检验发生了革命性的变化检测项目不断增加，方法的灵敏度更高、特异性更强，自动化程度更高。自上世纪80年代以后，免疫学检测技术随着单克隆抗体、人工合成多肽、基因工程表达抗原及各种标记技术的成熟而迅速发展，放射免疫测定(RIA)和酶免疫测定(EIA)逐渐取代传统的免疫沉淀和免疫凝聚，使检测的敏感性、特异性都大大提高，随后化学发光技术的应用使免疫学检测的敏感性和线性范围得到进一步的提高。这些技术在临床检验中的应用为疾病的定量检测、疗效观察及病因探讨提供了更直接和客观的资料。Τ3是目前医院开展的常规免疫检测项目，对甲状腺疾病的诊断有无可替代的重要参考价值。目前我国已批准上市的Τ3免疫检测试剂有进口和国产两大类，其中进口试剂有贝克曼等跨国定量检测公司的产品，采用的方法学多为化学发光，而国产试剂中采用的方法学多数为放免法，近两年开始出现化学发光类产品。放免分析法存在线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。而化学发光免疫分析法具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多有点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。
磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。中国发明专利公开C N101949944A公开了一种了三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒及其制备方法，其中，试剂盒包括包被有二碘甲状腺原氨酸-明胶的磁微粒混悬液、三碘甲状腺原氨酸系列校准品、辣根过氧化物酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗体、发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液。使用该专利公开的试剂盒成功利用了磁微粒免疫检测技术实现了对三碘甲状腺原氨酸的准确检测。然而，该试剂盒的制备成本和使用成本高，原因是，一方面，在进行包被有二碘甲状腺原氨酸-明胶的磁微粒混悬液的制备时，不仅过程复杂，而且直接将二碘甲状腺原氨酸-明胶包被于磁微粒上的包被率较低，导致较高的成本；另一方面，其采取辣根过氧化物酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗体，该抗体的制备也是非常繁琐，且标记率低，限制其检测效果和导致成本增加。此外，试剂盒在制备工艺上所存在的不易控和稳定性较差的因素，除了导致如前所述的成本增加的问题外，还使得检测的批间差大，限制了检测方法的精密度。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现三碘甲状腺原氨酸准确和高精确地定量测定。本发明同时还提供一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，该方法工艺稳定，成本低，且所得试剂盒的精密度高。癌抗原所用的试剂盒的简便和低成本的制备方法。一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶(ALP)标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。优选地，该碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原由碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。进一步地，所述磁微粒试剂中，包被有荧光素抗体的磁微粒由荧光素抗体与磁微粒通过偶联剂相化学偶联。进一步地，所述第一试剂中的荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的浓度为
O.5^1 μ g/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的浓度为O. 02、.1 μ g/mL，所述第二试剂的pH为7_9。本领域技术人员应知晓，本发明的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物 溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本发明试剂盒来说并非必不可少。
本发明采取的又一技术方案是一种上述的三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及磁分离剂的步骤，其中所述第二试剂的制备过程如下①使三碘甲状腺原氨酸抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于2l°C下保存备用，其中所述的三碘甲状腺原氨酸抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg ；②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1.1 1. 3的比例混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得，其中碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为O. 5^1. 5mg/ml。优选地，步骤①中，取三碘甲状腺原氨酸抗原，加入二甲基亚砜溶解该抗原至浓度为2(T50mg/mL，加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯，室温反应2 3小时，用二甲基亚砜将反应液1:10稀释，于21 °C下保存备用。优选地，步骤②中，取浓度大于等于5mg/ml的碱性磷酸酶的磷酸盐缓冲液，用PHflO的碳酸氢钠缓冲液稀释至O. 5^1. 5mg/ml，加入步骤①所得反应液，室温静置反应20 60mino 进一步地，所述的第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为扩10的缓冲液，然后按照荧光素与三碘甲状腺原氨酸抗体的分子比为2(Γ200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9 10的缓冲液与三碘甲状腺原氨酸抗体的pH为9 10的缓冲液混合,混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液，接着用具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述的第一试剂。其中适当PH值的缓冲液可以为例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。进一步地，所述磁分离剂的制备方法如下将含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下，室温反应2 18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当PH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述的磁分离剂。其中所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为O. 5^2 μ m,每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于O. 4mmol ;所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万。优选地，上述的具有适当pH值的缓冲液为含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。本发明所述的荧光素可以是已知的各种荧光素，常用的有例如异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明等。本发明同时还提供了一种采用上述的试剂盒应用于三碘甲状腺原氨酸定量检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)免疫反应在检测管中加入待测样本原液，依次加入第一试剂和第二试剂，混匀，在25 40°C下进行第一次温育，然后加入磁分离试剂，混匀，在25 40°C下进行第二次温育；(2)洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬，然后磁分离，去除上清；(3)加底物溶液检测发光强度在检测管中加入碱性磷酸酶催化的化学发光底物，去除磁�。浞只煨蠹觳夥⒐馇慷戎�。进一步地，步骤(I)中所述第一次温育的时间可以为5 30mi n，通常为15min ；第二次温育的时间可以为2"!Omin,通常为5min。由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点1.申请人发现，采取辛二酸二琥珀酰亚胺酯作为交联剂进行碱性磷酸酶和三碘甲状腺原氨酸抗原的偶联时，具有和其它交联剂相比更高的偶联效率，在降低制备成本的同时，有利于提高检测效果。因此，本发明的试剂盒中的三种试剂均可以通过稳定的制备工艺制备得到，生产成本低，且由于制备工艺的稳定性，试剂盒分析批间差小，检测的分析间精密度提高。2.本发明的试剂盒中的含有碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液的制备方法，能够有效将三碘甲状腺原氨酸抗原与碱性磷酸酶偶联，偶联效率高，进一步降低试剂盒的成本低和确保试剂盒的检测效果。

3、采取本发明的试剂盒进行检测，准确度好，精密度高，灵敏度高，检测范围宽，样品无需预稀释，操作简单省时。与采用进口试剂盒进行检测的方法相比，本发明的检测方法在成本上具有显著的优势。


图1为测试校准品标准曲线；图2为灵敏度评价拟合曲线；图3为血清样本检测结果相关性(其中横坐标X为实施例4制备得的试剂盒样本测值，浓度单位为ng/mL，纵坐标y为雅培公司试剂盒样本测值，浓度单位为ng/mL)。
具体实施例方式实施例1第一试剂的制备(I)材料与仪器以磷酸盐缓冲液保存的三碘甲状腺原氨酸(T3)单克隆抗体(纯度超过95wt%，浓度为2mg/mL);异硫氰酸荧光素(FITC)，碳酸钠等试剂应达到化学纯；G_25凝胶纯化柱采购自GE公司。(2)制备步骤①用O.1 O. 2mol/L ρΗ9· (TlO. O的碳酸盐缓冲液配制O. 5mg/mL的FITC溶液；②按照三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体与FITC分子比为1:20的比例在抗体溶液中加入步骤①所配FITC溶液，混合均匀，室温静置12h小时，反应生成T3抗体-FITC连接物；③将经过步骤②的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的FITC，得到含有T3抗体-FITC连接物(即FITC标记的T3抗体)的溶液；④将步骤③所得含有T3抗体-FITC连接物的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA)ρΗ8· O的O. lmol/L的TRIS缓冲液稀释到T3抗体-FITC连接物浓度为O. 5 I μ g/mL,即为第一试剂。实施例2第二试剂的制备(I)材料与仪器T3抗原(固体粉末，纯度超过95wt%)；以磷酸缓冲液保存的碱性磷酸酶(ALP溶液，ALP纯度为约99%，比活性为约1500U/mg，浓度为10mg/mL);交联剂DSS购自THERMO公司，TRIS等化学试剂应达到化学纯；G_25凝胶纯化柱为GE公司产品。(2)制备步骤①取Img T3抗原，加入DMSO溶解该抗原至浓度为2(T50mg/mL，加入DSSO. 5mg,室温反应2小时，用DMSO将反应液1:10稀释，2-8 °C保存备用；②取Img的ALP溶液，用O.1M pH9. 5的NaHCO3缓冲液将ALP溶液稀释到lmg/ml，稀释后的ALP缓冲液中加入步骤①制备的T3-DMS0溶液进行连接反应，加入T3-DMS0溶液体积为ALP缓冲液体积的1/20，室温静置反应30min，用G-25凝胶柱除盐，2_8°C保存备用；③将步骤②的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白BSA) pH8. O的O. lmol/L的TRIS缓冲液稀释到O. 02 O.1 μ g/ml和pH9 10，即为第二试剂。实施例3磁分离试剂的制备(I)材料与仪器磁微粒的悬浮液磁微�：�5wt%，磁微�：然�(COOH)活性集团，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩尔(mmol)，具有超顺磁性，直径在O. 5_2μπι之间。

抗FITC抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，纯度为90wt%以上，稀释效价超过1:100万；2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、TRI S和其他试剂应达到化学纯。(2)制备步骤①取IOOmg磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用O. 05mol/L, pH4. 5 5MES缓冲液IOmL重悬；②加入2 4mg的抗FITC抗体，室温混悬3(T60min ；③加入O. 5 ImL新鲜配制的10mg/mL的EDC水溶液,室温混悬2 12h ；④磁分离，去上清，用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)pH8.0的0. lmol/L的TRIS缓冲液重悬到lmg/mL, pH8. O,即为磁分离试剂。实施例4三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒该试剂盒包括按照实施例1方法制备的第一试剂(浓度为0. 75 μ g/mL), 5mL ；按照实施例2方法制备的第二试剂(浓度为0. 06 μ g/mL), 5mL ；按照实施例3方法制备的磁分离试剂5mL。实施例5三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒该试剂盒包括按照实施例1方法制备的第一试剂(浓度为0. 5 μ g/mL), 5mL ；按照实施例2方法制备的第二试剂(浓度为0. 02 μ g/mL), 5mL ；按照实施例3方法制备的磁分离试剂5mL。实施例6三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒该试剂盒包括
按照实施例1方法制备的第一试剂(浓度为I μ g/mL), 5mL ；按照实施例2方法制备的第二试剂(浓度为O.1 μ g/mL), 5mL ；按照实施例3方法制备的磁分离试剂5mL。实施例7采取实施例4的试剂盒进行三碘甲状腺原氨酸的定量检测(I)检测步骤①免疫反应在检测管中加入30 μ L待测样本(血清或血衆)原液，然后加入50 μ L第一试剂，50 μ L第二试剂，混匀，37± I°C条件下温育15min ;加入50 μ L磁分离试剂，混匀，37±1°C条件下温育5min ；②洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入600 μ L的清洗液，去除磁�。鸬词勾盼⒘３浞只煨缓蟠欧掷耄コ锨澹淮瞬街柚馗�3次；③加底物溶液检测发光强度在检测管中加入150 μ L碱性磷酸酶化学发光底物溶液(北京阿匹斯生物技术有限公司APCL-1 )，震荡使磁微粒充分混悬，在5min内检测发光强度。(2)绘制校准品标准曲线校准品标准曲线参见图1。(3)灵敏度评价检测“O”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，并计算M-2SD值， 根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M-2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法的灵敏度不大于5ng/mL。其中A点发光值分别参见表1:表I
权利要求
1.一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂含突光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。
2.根据权利要求1所述的三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原由碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原通过交联剂辛二酸二琥拍酰亚胺酯连接构成。
3.根据权利要求1或2所述的三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述第一试剂中的荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的浓度为O. 02、.1 μ g/mL，所述第二试剂的pH为7_9。
4.一种如权利要求3所述的三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述含有荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液以及所述包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于所述含有碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液的制备过程如下①使三碘甲状腺原氨酸抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于2 8°C下保存备用，其中所述的三碘甲状腺原氨酸抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%,且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg ；②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1. Γ1. 3的比例混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，选择具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH值即得，其中碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为O. 5 1· 5mg/ml。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤①中，取三碘甲状腺原氨酸抗原，加入二甲基亚砜溶解该抗原至浓度为2(T50mg/mL，加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯，室温反应2 3小时，用二甲基亚砜将反应液1:10稀释，于2 8°C下保存备用。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于步骤②中，取浓度大于等于5mg/ml的碱性磷酸酶的磷酸盐缓冲液，用pH 9^10的碳酸氢钠缓冲液稀释至O. 5^1. 5mg/ml，加入步骤①所得反应液，室温静置反应2(T60min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为7、的缓冲液,然后按照荧光素与三碘甲状腺原氨酸抗体的分子比为20^200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为7、的缓冲液与三碘甲状腺原氨酸抗体的pH为7、的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去的荧光素，得到含有荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液，接着用具有适当PH值的缓冲液调整浓度和PH，即得第一试剂。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述磁分离剂的制备方法如下使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下，室温反应疒18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当PH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述的磁分离剂；其中所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为O. 5 2 μ m，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量大于等于O. 4mmol ;所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%,稀释效价大于1:100万。
9.根据权利要求4或7或8所述的制备方法，其特征在于所述的具有适当pH值的缓冲液为含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。
10.采用权利要求Γ3中任一项权利要求所述的试剂盒用于对三碘甲状腺原氨酸定量检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)免疫反应在检测管中加入待测样本原液，依次加入第一试剂和第二试剂，混匀，在25 4(TC下进行第一次温育，然后加入磁分离试剂，混匀，在25 4(TC下进行第二次温育；(2)洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁�。鸬词勾盼⒘３浞只煨缓蟠欧掷耄コ锨澹�(3)加底物溶液检测发光强度在检测管中加入碱性磷酸酶催化的化学发光底物，去除磁�。浞只煨蠹觳夥⒐馇慷戎�。
全文摘要
本发明涉及一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，该试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。本发明使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对三碘甲状腺原氨酸进行定量检测。
文档编号G01N33/535GK103048477SQ20121055022
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者于大为, 程晓蕾 申请人:苏州浩欧博生物医药有限公司