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一种蛋白质传感膜及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白质传感膜及其制备方法和用途，所述蛋白质传感膜由三层结构组成：底层是基片，中间层是纳米银粒子层，上层是无荧光基团的聚合物薄膜；蛋白质传感膜的制备方法如下：利用巯基硅烷偶联剂使基片硅烷化；将硅烷化的基片置于纳米银溶胶中浸泡，形成纳米银基底；将无荧光基团的聚合物溶解后旋涂在纳米银粒子层表面形成聚合物层，即得到基于自组装纳米银粒子的蛋白质传感膜，对某些具有荧光特性的蛋白质等物质的检测信号可增强到数倍，应用于具有荧光特性蛋白质的快速检测；本发明所提供的制备方法简单，易于实施，可操作性强。
【专利说明】一种蛋白质传感膜及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于自组装纳米银粒子的蛋白质传感膜及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]传感技术作为现代信息技术的三大支柱之一，在国家安全、科学试验、环境监测及医疗卫生等方面发挥着重要作用。生物传感技术是传感技术的一个重要分支，它与生物信息学、仿生学、生物计算机等学科一起，处在生命科学和信息科学的交叉领域。生物传感技术的研究重点是将生物活性材料与传感器有机结合，成为新型分析仪器和检测技术的重点发展领域。
[0003]传统的生物传感技术通常需要标记、灵敏度低、过程繁琐、效率低，其中大部分的工作量用于标记，使用放射性同位素、荧光基团做标示物，安全性和稳定性差，不能满足快速、灵敏、低污染的需求，迫切需要新型的高灵敏度、高效、方便、经济的生化分子检测方法和技术。因此，近年来椭圆偏振光、石英晶振微天平、表面等离子共振技术等无标记传感技术得到迅速发展。
[0004]金、银等金属纳米粒子具有高度活跃的外层电子，当光波辐射到粒径远小于其激发波长的金属纳米粒子时，产生的表面等离子体波被限域在纳米结构的附近，当入射光频率与自由电子集体震荡频率相当时则产生共振。当金属粒子与荧光体间距离在一定范围内时，金属粒子会使荧光体的辐射衰减速率增加或发生共振能量转移，使荧光体的荧光强度增强，大大提高了对目标物检测的灵敏度。以其方便快捷、灵敏度高等多项特点，深受研究人员的青睐。目前的研究大多将蛋白质等荧光生物大分子直接附着在金属粒子层表面，存在金属粒子裸露于空气中、且生物大分子与金属粒子之间距离不可调等问题，导致许多技术问题还没有解决，限制了其应用。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种蛋白质传感膜及其制备方法和用途。主要技术方案是在纳米银粒子层上覆盖一层无荧光基团的隔离层，通过纳米银的局域表面等离子体共振效应，利用隔离层吸附蛋白质，通过蛋白质等荧光物质的荧光光谱增强实现这些蛋白质的快速、灵敏检测。
[0006]本发明提供的一种蛋白质传感膜，其由三层结构组成:底层是基片，中间层是纳米银粒子层，上层是无荧光基团的聚合物薄膜，所述基片为玻璃片或石英片。
[0007]本发明还提供一种所述的蛋白质传感膜的制备方法，包括如下步骤:
(1)将纳米银前驱体、还原剂分别溶于蒸馏水，得到纳米银前驱体溶液和还原剂溶液；将纳米银前驱体溶液加热煮沸一段时间，然后边搅拌，边向其中滴加入还原剂溶液，继续加热一段时间后停止加热，冰水浴降至室温，离心除去上层清液，得到纳米银溶胶；
(2)将偶联剂溶于甲醇形成偶联剂溶液，将干净的基片通过等离子表面处理30min，然后常温下置于偶联剂溶液中浸泡一段时间，使基片表面硅烷化，自然风干后得到硅烷化基片;
(3)将步骤(2)中得到的硅烷化基片浸泡在步骤(1)得到的纳米银溶胶中一段时间，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成纳米银粒子层，得到纳米银基片；
(4)将无荧光基团的聚合物溶解于有机溶剂得到旋涂液，进而采用旋涂法在步骤(3)得到的纳米银基片上制备聚合物薄膜，自然风干后即得到蛋白质传感膜。
[0008]步骤(1)中所述纳米银前驱体为硝酸银、醋酸银中的一种，前驱体溶液中，前驱体与蒸馏水的质量比为0.1-0.5:500 ;前驱体溶液加热煮沸温度为120°C~140°C，加热煮沸时间为0.5^1h ;所述还原剂为柠檬酸钠，还原剂溶液中，还原剂与蒸馏水的质量比为f 10:500，向前驱体溶液滴加入还原剂溶液后保持温度不变，继续加热时间为5~20min ;前驱体溶液与还原剂溶液体积比1:1。
[0009]步骤(2)中所述偶联剂为Y-巯丙基三甲氧基硅烷、Y-巯丙基三乙氧基硅烷中的一种，偶联剂与甲醇的质量比为I~2:100 ;基片为玻璃片或石英片，基片在偶联剂溶液中浸泡时间为0.5~2h。
[0010]步骤(3)中所述的浸泡时间为0.5~lh。
[0011]步骤(4)旋涂液中，无荧光基团聚合物与有机溶剂的质量比为0.01-0.2:1000，所述无荧光基团聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇中的一种，聚甲基丙烯酸甲酯数均分子量为1.0 X IO5~1.6 X 105，聚乙烯醇平均聚合度为1600~3000，醇解度≥98%，有机溶剂为四氢呋喃、乙醇中的一种；旋涂法制备聚合物薄膜的转速为100(T3000rpm，时间为2(T60s。
[0012]本发明还提供一种蛋白质传感膜的用途，应用于具有荧光特性蛋白质的快速检测，具体是应用于骨形态发生蛋白或牛血清蛋白的快速检测。
[0013]本发明的有益效果:
本发明利用巯基与银的相互作用，采用自组装法在载玻片或石英片上负载了一层具有一定有序性的纳米银粒子，使其成为具有局域表面等离子体共振效应的基底。将亲水性聚合物旋涂在纳米银基底表面成膜，与纳米银基底相比，不仅可调节纳米银粒子与荧光物质之间的距离，进而调整荧光增强效应，而且还可以隔绝纳米银与空气，阻碍纳米银被氧化。本发明制备工艺简单，操作性强。
[0014]
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1为本发明基于自组装纳米银的蛋白质传感膜的结构示意图(其中:1为基片，2为纳米银粒子层，3为无荧光基团的聚合物薄膜)。
[0016]图2为本发明中实施例1硅烷化基片上纳米银粒子的扫描电镜图。
[0017]图3为本发明中实施例2硅烷化基片上纳米银粒子的扫描电镜图。
[0018]图4为本发明中实施例3硅烷化基片上纳米银粒子的扫描电镜图。
[0019]图5为本发明实施例1传感膜与石英基片上测定骨形态发生蛋白的荧光光谱对比图(图5a、b分别为石英基片与传感膜上骨形态发生蛋白的荧光光谱曲线)。
[0020]图6为本发明实施例2传感膜与石英基片上测定牛血清蛋白的荧光光谱对比图(图6c、d分别为石英基片与传感膜上牛血清蛋白的荧光光谱曲线)。
[0021]图7为本发明实施例3传感膜与石英基片上测定牛血清蛋白的荧光光谱对比图(图7e、f分别为石英基片与传感膜上牛血清蛋白的荧光光谱曲线)。
[0022]
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于下列实施例，应包括权利要求书中的全部内容。
[0024]实施例1
(I)将纳米银前驱体硝酸银、还原剂柠檬酸钠分别溶于蒸馏水，得到纳米银前驱体溶液和还原剂溶液，前驱体溶液中质量比硝酸银:蒸馏水为0.5:500，还原剂溶液中质量比柠檬酸钠:蒸馏水为10:500 ;将前驱体溶液加热至130°C煮沸lh，然后边搅拌，边向其中滴加入还原剂溶液，保持温度继续加热20min ;冰水浴降至室温，离心除去上层清液，得到纳米银溶胶。前驱体溶液与还原剂溶液体积比1:1。
[0025](2)将偶联剂Y-巯丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇形成偶联剂溶液，质量比Y-巯丙基三甲氧基硅烷:甲醇为1:100 ;将干净石英片通过等离子表面处理30min，然后常温下置于偶联剂溶液中浸泡2h，使石英片表面硅烷化，自然风干后得到硅烷化基片。
[0026](3)将步骤(2)中得到的硅烷化基片在步骤(I)得到的纳米银溶胶中浸泡0.5h，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成纳米银粒子层，得到纳米银基片。如附图2所
/Jn ο
[0027](4)将聚甲基丙烯酸甲酯(数均分子量为1.0X IO5)溶解于四氢呋喃得到旋涂液，质量比聚甲基丙烯酸甲酯:四氢呋喃为0.2:1000 ;进而采用旋涂法在步骤(3)得到的纳米银基片上制备聚合物薄膜，自然风干后即得到蛋白质传感膜。旋涂法制备聚合物薄膜的转速为lOOOrpm，时间为30s。
[0028](5)分别在石英基片和上述制备的蛋白质传感膜上滴加骨形态发生蛋白(BMP-2)的水溶液，真空干燥后测定荧光发射光谱，结果如附图5 (a)、图(b)所示。
[0029]实施例2
(I)将纳米银前驱体硝酸银、还原剂柠檬酸钠分别溶于蒸馏水，得到纳米银前驱体溶液和还原剂溶液，前驱体溶液中质量比硝酸银:蒸馏水为0.1:500，还原剂溶液中质量比柠檬酸钠:蒸馏水为1:500 ;将前驱体溶液加热至120°C煮沸0.5h，然后边搅拌，边向其中滴加入还原剂溶液，保持温度继续加热5min ;冰水浴降至室温，离心除去上层清液，得到纳米银溶胶。前驱体溶液与还原剂溶液体积比1:1。
[0030](2)将Y-巯丙基三乙氧基硅烷溶于甲醇形成偶联剂溶液，质量比Y-巯丙基三乙氧基硅烷:甲醇为2:100 ;将干净的玻璃片通过等离子表面处理30min，然后常温下置于偶联剂溶液中浸泡lh，使玻璃片表面硅烷化，自然风干后得到硅烷化基片。
[0031](3)将步骤(2)中得到的硅烷化基片在步骤(I)得到的纳米银溶胶中浸泡lh，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成纳米银粒子层，得到纳米银基片。如附图3所示。
[0032](4)将聚乙烯醇(平均聚合度为2400，醇解度> 98%)溶解于有机溶剂乙醇得到旋涂液，质量比聚乙烯醇:乙醇为0.01:1000 ;进而采用旋涂法在步骤(3)得到的纳米银基片上制备聚合物薄膜，自然风干后即得到蛋白质传感膜。旋涂法制备聚合物薄膜的转速为2000rpm，时间为 60s。[0033](5)分别在石英基片和上述制备的蛋白质传感膜上滴加牛血清蛋白(BSA)的水溶液，真空干燥后测定荧光发射光谱，结果如附图6 (C)、图6 (d)所示。
[0034]实施例3
(I)将纳米银前驱体醋酸银、还原剂柠檬酸钠分别溶于蒸馏水，得到纳米银前驱体溶液和还原剂溶液，前驱体溶液中质量比醋酸银:蒸馏水为0.3:500，还原剂溶液中质量比柠檬酸钠:蒸馏水为5:500 ;将前驱体溶液加热至120°C煮沸lh，然后边搅拌，边向其中滴加入还原剂溶液，保持温度继续加热20min ;冰水浴降至室温，离心除去上层清液，得到纳米银溶胶。前驱体溶液与还原剂溶液体积比1:1。
[0035](2)将偶联剂Y-巯丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇形成偶联剂溶液，质量比Y-巯丙基三甲氧基硅烷:甲醇为1.5:100 ;将干净的石英片通过等离子表面处理30min，然后常温下置于偶联剂溶液中浸泡lh，使石英片表面硅烷化，自然风干后得到硅烷化基片。
[0036](3)将步骤(2)中得到的硅烷化基片在步骤(I)得到的纳米银溶胶中浸泡0.8h，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成纳米银粒子层，得到纳米银基片。如附图4所
/Jn ο
[0037](4)将聚乙烯醇(平均聚合度为1600，醇解度> 98%)溶解于乙醇得到旋涂液，质量比聚乙烯醇:乙醇为0.2:1000 ;进而采用旋涂法在步骤(3)得到的纳米银基片上制备聚合物薄膜，自然风干后即得到蛋白质传感膜。旋涂法制备聚合物薄膜的转速为2000rpm，时间为 40s。
[0038](5)分别在石英基片和上述制备的蛋白质传感膜上滴加牛血清蛋白(BSA)的水溶液，真空干燥后测定荧光发射光谱，结果如附图7 (e)、图7 (f)所示。
【权利要求】
1.一种蛋白质传感膜，其特征在于:其由三层结构组成:底层是基片，中间层是纳米银粒子层，上层是无荧光基团的聚合物薄膜，所述基片为玻璃片或石英片。
2.—种权利要求1所述的蛋白质传感膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将纳米银前驱体、还原剂分别溶于蒸馏水，得到纳米银前驱体溶液和还原剂溶液；将纳米银前驱体溶液加热煮沸一段时间，然后边搅拌，边向其中滴加入还原剂溶液，继续加热一段时间后停止加热，冰水浴降至室温，离心除去上层清液，得到纳米银溶胶； (2)将偶联剂溶于甲醇形成偶联剂溶液，将干净的基片通过等离子表面处理30min，然后常温下置于偶联剂溶液中浸泡一段时间，使基片表面硅烷化，自然风干后得到硅烷化基片; (3)将步骤(2)中得到的硅烷化基片浸泡在步骤(1)得到的纳米银溶胶中一段时间，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成纳米银粒子层，得到纳米银基片； (4)将无荧光基团的聚合物溶解于有机溶剂得到旋涂液，进而采用旋涂法在步骤(3)得到的纳米银基片上制备聚合物薄膜，自然风干后即得到蛋白质传感膜。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中所述纳米银前驱体为硝酸银、醋酸银中的一种，前驱体溶液中，前驱体与蒸馏水的质量比为0.1-0.5:500 ;前驱体溶液加热煮沸温度为 120°C~140°C，加热煮沸时间为0.5^1h ;所述还原剂为柠檬酸钠，还原剂溶液中，还原剂与蒸懼水的质量比为广10:500,向前驱体溶液滴加入还原剂溶液后保持温度不变，继续加热时间为5~20min ;前驱体溶液与还原剂溶液体积比1:1。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述偶联剂为Y-巯丙基三甲氧基硅烷、Y _疏丙基二乙氧基硅烷中的一种，偶联剂与甲醇的质量比为I~2:100 ;基片为玻璃片或石英片，基片在偶联剂溶液中浸泡时间为0.5~2h。
5.权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述的浸泡时间为0.5~lh。
6.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)旋涂液中，无荧光基团聚合物与有机溶剂的质量比为0.01、.2:1000，所述无荧光基团聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇中的一种，聚甲基丙烯酸甲酯数均分子量为1.0X IO5UXlO5,聚乙烯醇平均聚合度为1600-3000，醇解度> 98%，有机溶剂为四氢呋喃、乙醇中的一种；旋涂法制备聚合物薄膜的转速为100(T3000rpm，时间为20~60s。
7.—种权利要求1所述的蛋白质传感膜的用途，其特征在于:应用于具有荧光特性蛋白质的快速检测，具体是应用于骨形态发生蛋白或牛血清蛋白的快速检测。
【文档编号】G01N21/64GK103995104SQ201410153514
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】易国斌, 刘念, 梁真飞, 俎喜红, 罗洪盛, 刘顺彭 申请人:广东工业大学