专利名称：采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法
技术领域：
本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及一种采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法。
背景技术：
烟草是全世界最主要的经济作物之一，中国的种植面积居世界首位，每年为国家增加财政收入2000 3000亿元。然而，随着产业的发展和种植面积的不断扩大，20世纪 70年代以后，烟草病毒病�：χ鹉昙又�。在烟草田间，常表现为多种病毒混合侵染，给烟草生产造成重大损失，重病田减产20% -50%，夏烟减产70%以上，并呈现出随栽培品种的单一化及栽种面积的不断扩大而逐步加重的趋势。�：χ泄难滩莶《局饕谢乒匣ㄒ恫《�(Cucumber Mosaic Virus, CMV)、马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)、马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、烟草蚀纹病毒 (Tobacco Etch Virus, TEV)、烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus, TMV)和烟草脉带花叶病毒(Tobacco Vein BandingMosaic Virus,TVBMV)等十几种病毒。其中 CMV、PVY、TEV、 TMV和TVBMV危害最严重，可影响烟叶的产量和质量，造成重大经济损失。目前烟草病毒病日益呈现复合侵染的趋势，对�：ρ滩莸牟《窘杏行Ш涂焖偌觳庠谠し篮涂刂蒲滩莶《静∩暇哂惺种匾南质狄庖�。准确灵敏的病毒检测方法是植物病毒防治的基础。目前普遍采用的检测方法主要有指示植物法、电镜技术、免疫学技术和分子生物学检测等。但上述方法均存在不同的缺点，例如，所需试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。环介导等温核酸扩增(Loop-mediatedisothermalmplification, LAMP)是由 Τ. Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列(Notomietal， 2000)。迄今已建立了针对多种病原性细菌、病毒、真菌、寄生虫等的LAMP检测方法，在耐药性基因检测、家畜早期胚胎性别判定等方面也有相关报道。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。本发明根据烟草病毒的外壳蛋白基因保守区设计了 LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测烟草五种主要病毒的方法。为烟草病毒的快速检测提供了新的手段。
发明内容
本发明提供了一种采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法，其中该方法包括烟草病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和电泳检测，确定病毒种类，其中烟草病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2种或2种以上，优选地引物组包含如下5组引物中2组或2组以上引物的引物组第1组引物，用于CMV病毒的RT-LAMP反应
夕卜弓I物(F3禾口 B3)SEQ ID NO. 1 :5，-TCTACCGTGTGGGTGACA-3，；SEQ ID NO. 2 :5，-GAGCACGGCGTACTTTCG-3，；内引物(FIP 和 BIP)SEQ ID NO. 3 5' -CCGTCCGCGAACATAGCAGAG-GTCCGTAAAGTTCCTGCCTC-3，；SEQ ID NO. 4:5’ -GCTGCATCTGGAGTCCAAGCC-TGTCGCCAATATCAGCGC-3’ ；第2组引物，用于PVY病毒的RT-LAMP反应外引物(F3和 B3):SEQ ID NO. 5 :5，-CGCGCTATGCCTTTGACTT-3，；SEQ ID N0.6 :5，-TTGGAGAGACATCCTCGGT-3，；内引物(FIP 和 BIP)SEQ ID NO. 7 5' -CAATGCTGCGGCCTTCATTTGA-GGTCACATCACGAACACCAG-3，；SEQ ID N0.8 :5， -TCAGCCCAACCTCGACTTTTCG-GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT-3，；
第3组引物，用于TEV病毒的RT-LAMP反应外引物(F3和 B3):SEQ ID NO. 9 :5，-AAAACGCGCAGCCAACAT-3，；SEQ ID NO. 10 :5’ -CGTACTGCAGCAGCTTTCA-3’ ；内引物(FIP 和 BIP)SEQ ID NO. 11 :5，-GGCATGTATGGTCGTTCCCTGT-GACACACTTCAGTGACCTGG-3，；SEQ ID NO. 12 :5’ -TTGTCACGCTATGCGTTCGACT-TTGCATATGCGCCTCCCT-3’ ；第4组引物，用于TMV病毒的RT-LAMP反应外引物(F3和 B3):SEQ ID NO. 13 :5，-GGAAACCTTCACCACAAGT-3，；SEQ ID NO. 14 :5，-TATAGCGCTCCTTATGGC-3，；内引物(FIP 和 BIP)SEQ ID NO. 15 :5’ -GCTGTGACTAACGGATCTAATACCG-AGGTTCCCTGACAGTGAC-3，；SEQ ID NO. 16 :5’ -GAAGTTGAAAATCAGGCGAACCC-TGCGTCGTCTACTCTACG-3，；第5组引物，用于TVBMV病毒的RT-LAMP反应外引物(F3和 B3):SEQ ID NO. 17 :5，-AACGGAATGTGGGTCATG-3，；SEQ ID NO. 18 :5，-TGTCATGTCAGTCAAATTGC-3，；内引物(FIP 和 BIP)SEQ ID NO. 19 :5’ -TGTTGGTTTGGCATGTTCCA-GATGGTGATGAACAGGTTG-3，；SEQ ID NO. 20 :5’ -TAGACAAATCATGGCACACTTTAGC-GGCATATACGGTTTCTCTGC-3，。在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法，其包括如下步骤1)病毒总RNA的提取提取感染2种或2种以上病毒的烟草叶中的病毒总RNA ；2) RT-LAMP 反应
使用所述引物组中的外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行 RT-LAMP反应，得扩增产物；3)电泳检测对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判定烟草是否带在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法，其包括如下步骤1)病毒总RNA的提取提取感染2种或2种以上病毒的烟草叶中的病毒总RNA ；2) RT-LAMP 反应使用所述引物组中的外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行 RT-LAMP反应，得扩增产物；3) SYBR Green I绿色荧光法检测扩增产物加入STOR Green I后直接用肉眼观察，确定是否感染病毒。在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的引物浓度比例为外引物(F3和B3)内引物(FIP和BIP) = 0. 3-0. 4 1. 2-1. 6 ；优选地外引物(F3 和 B3)内引物(FIP 和 BIP) =1:4。在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的反应温度优选为59-65°C ；对于PVY引物的反应温度更优选为65°C，对于CMV、TEV、TMVjP TVBMV引物的反应温度更优选为63°C。在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的Mg2+浓度优选为高于5mM，更优选为5mM。烟草病毒病常为复合侵染，本发明经过优化和摸索实验条件建立了检测中国五种主要烟草病毒的方法，极大地提高检测效率，降低检测成本。本发明的方法具有快速、灵敏、 高度特异性等特点。本发明的方法已经成功地应用于室内和田间烟草病毒病害复合侵染的同步检测。本发明证明了 RT-LAMP是一种检测植物病毒的有效手段。
图1为RT-LAMP结果电泳图，其中Ml =MarkerIV, 1为TEV感病样品，2为阴性对照， M2 为 Marker I ；图2为RT-LAMP荧光染料结果图，其中左边翠绿色为阳性，右边桔黄色为阴性对照。图3为RT-LAMP结果电泳图，其中Ml =MarkerIV, 1-4TEV所用温度分别为65°C、 63°C、61°C、59°C，M2 =Marker I 图 4 为 RT-LAMP 结果电泳图，其中 Ml =MarkerIV, 1、2、3、4、5 分别为 CMV、PVY、TEV、 TMV、TVBMV样品，6为阴性对照，M2为Marker I ；图 5 为 RT-LAMP 荧光染料结果图，其中 1、2、3、4、5 分别为 CMV、PVY、TEV、TMV、TVBMV 感病样品，6为阴性对照图6为RT-PCR结果电泳图，其中Ml =Marker I，1-6分别为pMD18_T_TEV质粒浓度为 170ng/y lU30ng/y lUOOng/μ l,75ng/y l、50ng/μ l、25ng/μ 1，7-8 为阴性对照，Μ2 MarkerIV ；图7为RT-LAMP结果电泳图，其中Ml =MarkerIV, 1-6分别为pMD18_T_TEV质粒浓度为 170ng/y l、130ng/y lUOOng/μ 175ng/y l、50ng/y l、25ng/y 1，7 为阳性对照，8 为阴性对照，M2 =Marker I ；图8为RT-PCR结果电泳图，其中Ml =Marker I，1-7分别为用pMD18_T_TEV质粒稀释IO3-IO9倍做模板，8为阴性对照，M2 =MarkerIV ；图9为RT-LAMP结果电泳图，其中Ml =Marker IV，1-7分别为用pMD18_T_TEV质粒稀释IO3-IO9倍做模板，8为阴性对照，M2 =Marker I ；图10为RT-LAMP荧光染料结果图，其中1_7分别为用pMD18_T_TEV质粒稀释 IO3-IO9倍做模板，8为阴性对照；图11为RT-PCR结果电泳图，其中Ml =Marker I，1-6为感病样品，7为健康样品，8 为阴性对照，M2 =Marker IV ；图12为RT-LAMP结果电泳图，其中Ml :Marker IV，1_6为感病样品，7为健康样品， 8为阴性对照，M2 =Marker I ；图13为RT-LAMP荧光染料结果图，其中1_6为感病样品，7为健康样品，8为阴性对照。
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。材料与试剂烟草健康叶片，病株叶片(CMV、PVY、TEV、TMV和TVBMV)分别采自中国陕西泾阳、 洛南等地，采集叶片保存于_80°C冰箱中。主要试剂Bst DNApolymerase 购自 NEB 公司；Betaine, MgSO4 购自 Sigma 公司；RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；M-MLV反转录酶购自Promega公司；Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；SYBR GreenI 购自 Invitrogen 公司；大肠杆菌(Escherichia,coli) JM109, DNA 标准 Markerl 购自 Voson 公司；胶回收试剂盒购自Bioteke公司。实施例11.引物设计首先本发明人从NCBI上下载了烟草五种主要病毒的CP基因的序列，(CMV， EF424775)(PVY, AM236802) (TEV, AY787757)(TMV, AF318213)(TVBMV, AM236820)使用 Primer4. O (http//primerexplorer. jp/e/v4_manual/index. html)设计了多组弓丨物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素选择了每种病毒的引物。最后为每种烟草病毒选择了 4条引物，包括2条外引物(F3和B3) 和2条内引物(FIP和BIP)。所述引物参见SEQID NO. 1_20。TEV的RT-PCR的引物，本发明使用郑轩等的引物，参见SEQID NO. 21-22。所有引物的信息见表1。表1引物序列SEQ ID NO. 1-22的信息
权利要求
1. 一种采用反转录环介导等温扩增技术检测多种烟草病毒的方法，其中该方法包括烟草病毒总RNA提�。琑T-LAMP反应和电泳检测，确定病毒种类，其中烟草病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2种或2种以上，其中RT-LAMP反应采用的引物是包含如下5组引物中的2组或2组以上引物的引物组第1组引物，用于CMV病毒的RT-LAMP反应 外引物(F3和B3)SEQ ID NO. 1 :5’ -TCTACCGTGTGGGTGACA-3’ ； SEQ ID NO. 2 :5’ -GAGCACGGCGTACTTTCG-3’ ； 内引物(FIP和BIP)SEQ ID NO. 3:5’ -CCGTCCGCGAACATAGCAGAG-GTCCGTAAAGTTCCTGCCTC-3，； SEQ ID NO. 4:5’ -GCTGCATCTGGAGTCCAAGCC-TGTCGCCAATATCAGCGC-3’ ； 第2组引物，用于PVY病毒的RT-LAMP反应 外引物(F3和B3)SEQ ID NO. 5 :5，-CGCGCTATGCCTTTGACTT-3，； SEQ ID NO. 6 :5，-TTGGAGAGACATCCTCGGT-3’ ； 内引物(FIP和BIP)SEQ ID NO. 7 :5’ -CAATGCTGCGGCCTTCATTTGA-GGTCACATCACGAACACCAG-3，； SEQ ID N0.8 :5， -TCAGCCCAACCTCGACTTTTCG-GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT-3，； 第3组引物，用于TEV病毒的RT-LAMP反应 外引物(F3和B3)SEQ ID N0.9 :5’ -AAAACGCGCAGCCAACAT-3，； SEQ ID NO. 10 :5，-CGTACTGCAGCAGCTTTCA-3’ ； 内引物(FIP和BIP)SEQ ID NO. 11 :5’ -GGCATGTATGGTCGTTCCCTGT-GACACACTTCAGTGACCTGG-3，； SEQ ID NO. 12 :5’ -TTGTCACGCTATGCGTTCGACT-TTGCATATGCGCCTCCCT-3’ ； 第4组引物，用于TMV病毒的RT-LAMP反应 外引物(F3和B3)SEQ ID NO. 13 :5’ -GGAAACCTTCACCACAAGT-3’ ； SEQ ID NO. 14 :5，-TATAGCGCTCCTTATGGC-3，； 内引物(FIP和BIP)SEQ ID NO. 15 :5’ -GCTGTGACTAACGGATCTAATACCG-AGGTTCCCTGACAGTGAC-3，； SEQ ID NO. 16 :5’ -GAAGTTGAAAATCAGGCGAACCC-TGCGTCGTCTACTCTACG-3，； 第5组引物，用于TVBMV病毒的RT-LAMP反应 外引物(F3和B3)SEQ ID NO. 17 :5，-AACGGAATGTGGGTCATG-3’ ； SEQ ID NO. 18 :5，-TGTCATGTCAGTCAAATTGC-3’ ； 内引物(FIP和BIP)SEQ ID NO. 19 :5’ -TGTTGGTTTGGCATGTTCCA-GATGGTGATGAACAGGTTG-3，；SEQ ID NO. 20 :5’ -TAGACAAATCATGGCACACTTTAGC-GGCATATACGGTTTCTCTGC-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物组中包含5组引物SEQID NO. 1_20。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括如下步骤1)病毒总RNA的提取提取感染2种或2种以上病毒的烟草叶中的病毒总RNA ；2)RT-LAMP 反应使用所述引物组中的外引物(F3和似)和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行 RT-LAMP反应，得扩增产物；3)电泳检测对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判定烟草是否带毒。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括如下步骤1)病毒总RNA的提取提取感染2种或2种以上病毒的烟草叶中的病毒总RNA ；2)RT-LAMP 反应使用所述引物组中的外引物(F3和B； )和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行 RT-LAMP反应，得扩增产物；3)SYBR Green I绿色荧光法检测扩增产物加入STOR Green I后直接用肉眼观察，确定是否感染病毒。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中RT-LAMP反应中的引物浓度比例为外引物 (F3 和 B3)内引物(FIP 和 BIP) =0.3-0.4 1.2-1.6。
6.根据权利要求5所述的方法，其中RT-LAMP反应中的引物浓度为外引物(F3和B3) 内引物(FIP 和 BIP) =1:4。
7.权利要求3或4所述的方法，其中RT-LAMP反应中的反应温度为59_65°C。
8.权利要求7所述的方法，其中RT-LAMP反应中，对于PVY引物的反应温度为65°C，对于CMV、TEV、TMVJP TVBMV引物的反应温度为63°C。
9.权利要求3或4所述的方法，其中RT-LAMP反应中的Mg2+浓度高于5mM。
10.权利要求9所述的方法，其中RT-LAMP反应中的Mg2+浓度为5mM。
全文摘要
本发明涉及采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法，其中该方法包括烟草病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和电泳检测，确定病毒种类，其中烟草病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2种或2种以上。本发明根据烟草病毒的外壳蛋白基因保守区设计了LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测烟草多种主要病毒的方法。为烟草病毒的快速检测提供了新的手段。
文档编号G01N21/64GK102286637SQ20111020510
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者吴云锋, 成巨龙, 满建云, 胡翠华, 赵磊, 郝兴安 申请人:西北农林科技大学, 陕西省烟草研究所
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