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专利名称：脂蛋白相关磷脂酶a2(lppla2)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及ー种采用乳胶增强免疫比浊法測定人血清中髓过氧化物酶含量的试剂盒。
背景技术：
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)属于磷脂酶A2超家族，主要由炎症细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞等)分泌。Lp-PLA2是由441个氨基酸组成的蛋白质，分子量为45kDa，与磷脂酶A2家族其余成员不同的是，LP-PLA2不需要钙离子維持其催化活性。LP-PLA2具有降解血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)的活性，因此也被称为血小板活化因子こ酸水解酶(platelet-activating factor acetylhydro-lase, PAF-AH)。血小 板活化因子有促进血小板聚集、中性粒细胞和单核细胞趋化以及促进白三烯等炎症介质释放，从而促进血栓形成和炎症反应。而LP-PLA2能将PAF水解为无活性的溶血PAF，故能减少炎症和血栓的形成，具有抗炎和抗动脉粥样硬化作用。脂蛋白相关磷脂酶A2除水解PAF外，还能水解Sn-2位含有多不饱和脂肪酰基的氧化磷脂，循环中低密度脂蛋白low densitylipoprotein, LDL)相关Lp-PI A2复合物经管腔进入内膜，在内膜LDL被氧化，LDL上的卵磷脂变成氧化卵磷脂。Lp-PLA2随即水解氧化卵磷脂生成溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸。后二者是促炎介质，能刺激粘附因子和细胞因子的产生，从而促进单核细胞由管腔向内膜聚集。单核细胞在内膜聚集后衍生为巨噬细胞，巨噬细胞吞噬氧化型LDL变成泡沫细胞。泡沫细胞聚集成动脉粥样硬化性斑块，脆弱斑块的破裂，易导致血栓形成和心血管事件的发生。因此，Lp-PLA2同时又具有促动脉粥样硬化形成的作用。尽管Lp-PLA2能水解PAF而抗炎，但其在血浆中占优势的作用是水解氧化卵磷脂生成大量溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸，而后二者又表现出很强的促动脉粥样硬化形成的作用，临床及实验室的研究结果均证实了这一点。

发明内容
本发明的目的是建立ー种新的检测方法，通过羊抗人的髓过氧化物酶抗体(或者单抗)与胶乳颗粒偶联，采用胶乳增强比浊法来測定人体血清中LP-PLA2的含量，运用该方法的试剂应具有不需要预处理标本，操作简单，准确度高，重复性好，且能够在全自动生化分析仪或者特种蛋白仪以及分光光度计上使用。为了解决上述的技术问题，本发明实现了以下技术I. ー种采用胶乳增强免疫比浊法检测LP-PLA2含量的试剂盒，其特征在于，包含试剂Rl，R2以及校准品；所述试剂Rl PH值为6. 5-8. O的缓冲液，所述试剂R2为抗人LP-PLA2抗体胶乳试剂；所述标准品为含有定量的LP-PLA2的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然LP-PLA2。2.所述的LP-PLA2检测试剂盒中的Rl试剂主要包含缓冲液，无机盐，加速剂和防腐剂。3.所述的LP-PLA2检测试剂盒中R2试剂主要包含稳定剂，抗人单(多)克隆抗体胶乳颗粒，缓冲液，稳定剂和防腐剤。其中乳胶微球直径为60-300nm。4.试剂Rl所述的无机盐选自氯化钠，氯化镁，氯化钾ー种或几种。缓冲液为磷酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。加速剂为聚こニ醇4000，聚こニ醇6000，聚こニ醇 80005.试剂R2所选用的抗体为鼠抗人LP-PLA2单克隆抗体，羊抗人LP-PLA2单克隆抗体，兔抗人LP-PLA2单克隆抗体ー种或者几种混合。也可以选鼠抗人LP-PLA2多克隆抗体，羊抗人LP-PLA2多克隆抗体，兔抗人LP-PLA2多克隆抗体其中ー种。6.试剂R2中的稳定剂选自小牛白蛋白，甘氨酸，明胶，吐温20，曲拉通ー种或者几种。7.本发明所述的试剂R2为抗人LP-PLA2抗体胶乳试剂，采用的是抗人的LP-PLA2 抗体与胶乳颗粒相偶联。经过离心(过滤)的方法去掉未反应的偶联剂以及未反应的抗体，在含有稳定剂和防腐剂的缓冲液中分散而成。8.所述抗人LP-PLA2抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤。步骤I :将胶乳在PH6. 5的溶液中活化。步骤2 :洗涤去掉溶液中的碳化ニ亚胺，加PH7. 5-9. O的缓冲液，加入LP-PLA2抗体，在37度反应4小吋。步骤3 :将步骤2所得的液体用PH7. 5-9. O的固定液固定6小吋。步骤4 :将步骤3所得的液体用PH7. 5-9. O的封闭液体封闭12小时。步骤5 :将步骤4所得的液体洗涤去掉未结合抗体，溶液用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散即得。9.作为优选，步骤I中所用的缓冲液为PBS缓冲液，MES缓冲液，碳酸盐缓冲液中的任何一种缓冲液，且浓度在20-100mmol/L，PH在5. 5-6. 5之间。10.作为优选，步骤I中所用的胶乳可以是羧基化的聚苯こ烯胶乳或者是氨基化的聚苯こ烯胶乳。其孔径在60nm-150nm均可。11.作为优选，步骤I中含有I-(3_ ニ甲基氨基丙基)-3_こ基碳ニ亚胺、I-(3_ ニ甲基氨基丙基)-3_こ基碳ニ亚胺盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或者多种。12.作为优选，在步骤2中，去掉溶液I中所含的未反应的物质，采用的是高速冷冻离心机或者超微孔径的过滤膜进行过滤。13.作为优选，在步骤5中，所用的稳定剂是小牛血清白蛋白，明胶，甘氨酸，脱脂奶粉ー种或者几种相混合。14、本发明检测的原理是利用抗原抗体反应，先加入试剂R1，使血清中的LP-PLA2的位点暴露，当加入抗人的LP-PLA2胶乳颗粒溶液，使溶液中的抗原抗体反应形成不溶于溶液的抗原抗体复合物，从而产生一定的浊度，在人血清中LP-PLA2的含量在一定的范围内LP-PLA2的含量与浊度成正比。再通过标准曲线进行计算，从而得到LP-PLA2的含量。15、本发明与现有技术相比，具有如下特点I)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度，最低检测能够达到O. lng/L，操作简单，快速，从检测到出结果最多只需要10分钟，甚至更短。2)本发明的试剂盒R2试剂中的抗体乳胶的制备由于采用的化学偶联法，稳定性好，在2-8度至少可以保存12个月。而采用物理吸附法的胶乳抗体试剂，批间差异比较大，而且稳定性不好。3)本发明试剂盒与进ロ试剂盒对样品中LP-PLA2含量检测的数据经统计分析，无显著性差异，检测结果可靠，在临床上可以替代进ロ试剂或者化学发光试剂，大幅降低成本以及检测时间。


图I为本发明实施例I的校准曲线实施案例
本发明公开了ー种检测LP-PLA2含量的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进エ艺參数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明内。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围对本文所述的方法和应用进行改动或者适当变更与组合，本实现和应用本发明技木。一、LP-PLA2试剂R2即抗人LP-PLA2抗体胶乳试剂的制备I :将2g孔径大小为80nm的羧基化的胶乳加入到50ml的含有1_(3_ ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺200mg/L的PH6. O的O. 4mol/L的MES缓冲液中，反应30分钟。2 :将反应液分成25ml/管，在转速为16000转/分的高速冷冻离心机中离心30分钟后，去掉上清液，每管加浓度为O. 4mol/L的磷酸盐缓冲液5ml混匀。继续在速为16000转/分的高速冷冻离心机中离心30分钟后，去掉上清液，每管加浓度为O. 2mol/L的磷酸盐缓冲液25ml混匀。3，每管加入羊抗人LP-PLA2抗体25mg，在37度反应6小时。4 向每管中加入还有10g/L的6-氨基己酸PH8. O的磷酸盐缓冲液10ml。5 :每管液体加小牛白蛋白O. 8g，摇匀反应12小时。5 :将所得的液体通过2次离心，转速为16000转/分，洗涤去掉未结合抗体，溶液用含有O. 5g/L的明胶和O. 2g/L小牛白蛋白和O. 05%的曲拉通以及O. lg/L叠氮钠的O. 05mol/L PBS缓冲液分散即可。ニ、LP-PLA2试剂Rl即样品缓冲液的制备
磷酸ニ氢钠2. 86g/L
磷酸氢ニ钠28. 65g/L
氣化納6.87g/L
氣化镁0.34g/L
聚乙ニ醇 600016g/L乘氣納1.5g/L
纯水IL 三LP-PLA2试剂中校准品的制备I)校准品稀释液
_酸ニ氢钠2.86g/L
磷龍ニ钠2艮65g/L 氣化钠9g/L
小牛白蛋白50g/L
聲氣钠2· 5g/L
裤剂10g/L2)按照需要的LP-PLA2參考校准品浓度将相应的重组LP-PLA2纯品I. 6mg加入校准品稀释液Iml的缓冲液中，制备得到1600ng/ml浓度的LP-PLA2校准品在使用的时候在用缓冲液按照比例稀释成多个浓度。四LP-PLA2测定方法(日立7060全自动生化分析仪)校准品浓度1600ng/ml800ng/ml 400ng/ml 200ng/mll00ng/ml Ong/ml测定波长主波长340nm 副波长800nm试剂比例R1 R2 S = 200ul 50ul IOul校准方式spline读点方式在试剂Rl与样品加入，反应5分钟，读点Al，然后加入R2后，反应5分钟，再读点A2，计算吸光度的变化。校准曲线见图I五本发明所述试剂盒的分析性能评估I.灵敏度测定用本发明所述的试剂盒对空白样本(含有5%牛血清的生理盐水)重复测定20次，最低检测限度为空白的均值浓度加上ニ个标准差，得到最低检测限度为5ng/ml。2.线性范围。2.线性评估取浓度将近1600ng/ml (1340. 5ng/ml)的临床血清标本,进行稀释，至少稀释6个点，每个点重复测定3次，根据式(1)，(2)，(3)计算出直线方程y = a+bx:
t ηΣΧ,Υ,-ΣΧ, ΣΥ,...............................ハ、 “ ~nW^XF⑴ μμΜζ ................................. (2)
η
[_] ·.··..·.·.(3)
式中b_回归线的斜率；|a|-回归线截距的绝对值；r_回归系数；Xi-测定管溶液的浓度；Yi_3次重复测定的与測定管溶液浓度对应的吸光度均值；i-1,2,3, ......, η ；η-测定样本数。经计算得出，在O. lng/ml到1340ng/ml的范围内，本试剂盒能达到很好的线性。3与酶联免疫方法的试剂盒测定结果的相关性。通过测定100例标本(其中阳性血清70例，阴性血清30例)本试剂盒与酶联免疫方法的试剂盒的相关系数R2 = O. 987，相关方程为Y = O. 932X-6. 237。
权利要求
1.ー种采用胶乳增强免疫比浊法检测人血清中LP-PLA2含量的试剂盒，其特征在干，包含试剂Rl，R2以及校准液；所述试剂RlPH值为6. 0-8. O的缓冲液，所述试剂R2为抗入H-FABP抗体胶乳试剂；所述标准品为含有定量的LP-PLA2的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然LP-PLA2。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人H-FABP抗体的胶乳试剂的制备为化学包被，包括以下步骤。
步骤I :将羧化的胶乳在PH6. 5的溶液活化。
步骤2 :洗涤去掉溶液中的碳化ニ亚胺，加PH7. 5-9. O的缓冲液，加入H-FABP抗体，在37度反应4小吋。
步骤3 :将步骤2所得的液体用PH7. 5-9. O的固定液固定6小吋。
步骤4 :将步骤3所得的液体用PH7. 5-9. O的封闭液体封闭12小吋。
步骤5 :将步骤4所得的液体离心去上清液，取沉淀后用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散即得。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，步骤I所述溶液为含有I-(3- ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺、I-(3-ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或者ニ种。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，步骤3所述溶液含有6-氨基己酸，甘氨酸。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤4所述溶液含有的稳定剂选自甘氨酸，小牛血清，以及吐温-20、曲拉通等表面活性剂以及氯化钠、氯化镁中的一种或者几种。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，步骤4所述溶液含有的甘氨酸，小牛血清的浓度为O. 05-0. 5% (质量分数)吐温-20或者曲拉通浓度为O. 005-0. 01 % (体积分数)氯化镁、氯化钠的浓度为O. 05-0. 15% (质量分数)。
全文摘要
本发明涉及一种测定血清中脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)含量测定的试剂盒。所要解决的技术问题是提供一种适用于全自动生化分析仪以及特定蛋白仪使用的脂蛋白相关磷脂酶A2含量的试剂盒。技术方案是脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，包括；a、试剂R1缓冲液、防腐剂、加速剂、表面活性剂，其余为纯化水；b、试剂R2缓冲液、结合有抗人的脂蛋白相关磷脂酶A2的乳胶微球c、校准品缓冲液，稳定剂，防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组脂蛋白相关磷脂酶A2纯品，其余为纯化水。通过以上试剂组合，建立脂蛋白相关磷脂酶A2含量的校准曲线，在仪器上快速的测定血清中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量与酶联免疫方法测定的结果有很好的符合性。
文档编号G01N33/68GK102692507SQ20111021538
公开日2012年9月26日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者何仕钊 申请人:南京诺尔曼生物技术有限公司