专利名称：抗乙型脑炎病毒的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物领域，涉及抗乙型脑炎病毒的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，属于黄病毒科黄病毒属，有包膜的单股正链RNA病毒，结构蛋白有3种C、M和E，分为4个基因型(I、II、III、IV型)。 三带喙库蚊为主要传播媒介，主要在亚洲流行，我国主要流行基因I型和III型，是�：ξ夜嗣裆靶竽烈档淖钪匾某婷讲《局唬梢鹧现氐纳窬低持⒆矗滤缆矢叽� 30%左右，另有50%的患者会留下永久性的神经系统后遗症。据统计，亚洲每年乙脑发病人数达16000例左右，死亡5000例左右，中国除新疆、西藏、青海外，其它各省均有发病与流行，脑炎发病数占世界总发病数的80%以上。近年来，该病的流行区域在不断扩大，成为严重的公共卫生问题。加强监测和诊断是十分重要的。目前，乙脑诊断方法主要有血清学诊断、分离培养和分子生物学方法。1、血清学检测传统的血清学方法有血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CT)、中和试验(NT)等。 目前主要应用的有酶联免疫法(ELISA)，免疫荧光(IFA)、滴金免疫法。血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验是流行病学调查常用的传统方法，需要采集急性期和恢复期双份血清进行检测，诊断费时费力，不能达到早期快速诊断的目的，特异性和敏感性不高，双份标本的采集有困难；酶联免疫包被技术、酶标记技术、单克隆抗体技术的发展推动了 ELISA检测乙脑IgM的应用和发展。现应用于诊断乙脑IgM的ELISA方法有捕获法和间接法；免疫荧光技术操作比较复杂，需要专业的人员及设备，而滴金免疫法则由于其简单，快速，有望推广生产使用。2、分离培养主要有乳鼠脑组织接种和BHK、Vero等细胞分离，是获得毒株进行分子流行病学研究和疫苗株构建的基础。通过分离培养取得毒株，进行分子生物学等鉴定，可研究其基因型、是否本地区主要流行株或外来输入株、是否发生变异等。3、分子生物学检测由于黄病毒间存在广泛的血清学交叉反应，发病早期部分患者还未产生抗体，使乙脑血清学诊断不能达到满意效果；乙脑患者毒血症期很短，病毒分离培养时间长，阳性率低RT-PCR技术的产生给病毒检测提供了早期、快速、敏感、特异的方法。JEV全基因序列测定取得的进展、分子生物学及生物信息学的发展，为乙脑的快速基因检测提供了可能。主要的检测方法有PCR-ELISA微板杂交法、RT-PCR、套式PCR、半套式PCR、实时荧光PCR和基因芯片。自1975年，Kohler和Milstein创立了杂交瘤技术。单克隆抗体制备技术因其很强的特异性和专一性，尤其是单抗的人源化技术的发展，广泛地运用于生物学及医学的各个领域。在乙型脑炎病毒的检测中，杂交瘤细胞技术和单克隆抗体技术在ELISA、中和试验、免疫荧光、免疫胶体金试剂盒、噬菌体展示技术等方面起到了举足轻重的作用。中和性的单克隆抗体则在疫苗及检测试剂盒的开发研制方面具有巨大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种分泌抗JEV的单克隆抗体的杂交瘤。本发明的另一目的是提供抗JEV的单克隆抗体。本发明的又一目的是提供该单克隆抗体的应用。分泌抗乙脑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B4，2011年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 51M。一种抗乙脑病毒的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No. 5124的杂交瘤细胞株2B4产生。所述的单克隆抗体在制备检测乙脑病毒的检测试剂中的应用。所述的单克隆抗体在体外抗原抗体反应中用于检测病原、病毒蛋白以及宿主细胞和动物实验中的中和作用。例如用于酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白质印迹(Western Blot)、间接免疫荧光(Indirect Immunof luorescence)、细胞及动物的中和实验以及流式细胞术(Flow Cytometry Assay)等的检测中，以检测其与抗原的结合性、特异性以及是否具有中和活性。本发明制得的抗JEV的单克隆抗体，为JEV的研究和建立新的乙脑病毒检测方法以及相关的诊断试剂盒和疫苗提供了有利的工具。有益效果本文利用BHK-21细胞培养出的JEV病毒，经过超速离心浓缩和蔗糖密度梯度离心纯化，作为抗原免疫BALB/C小鼠，经过常规的细胞融合、筛选及克隆化，建立了稳定分泌抗 JEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株QB4)。经过ELISA、Wfestern Blot等方法的鉴定，杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异性地识别乙型脑炎病毒，细胞和动物实验都表明该单克隆抗体具有中和活性。本发明抗JEV单克隆抗体的成功制备对于JEV的进一步研究以及建立更快速、灵敏、方便的检测方法以及开发相关的诊断试剂盒、试纸条和疫苗奠定了基础。本发明抗JEV单克隆抗体的应用(1)该抗体可以检测脑脊液和各种体液如血浆、淋巴液、血清等中的JEV的水平。(2)利用该单抗进行动物实验。(3)可以利用单抗进行药理学研究，用于治疗以JEV引起的乙型脑炎。
图1蔗糖密度梯度离心后各层样品的RT-PCR检测结果，其中泳道1为加样区一层吸取的样品，泳道2为45% -60% —层吸取的样品，泳道 3为30% -45% —层吸取的样品，泳道4为30% -加样区一层吸取的样品。图2电镜观察下的JEV病毒粒子，其中“-”均表示lOOnm，A为45% -60%—层吸取的样品，B为30% -45%—层吸取的样品。图3单抗2B4各稀释梯度的荧光图片，
A是单抗2B4稀释KT1的荧光图片，B是单抗2B4稀释10_2的荧光图片，C是单抗 2B4稀释10_3的荧光图片，D是单抗2B4稀释10_4的荧光图片，P为阳性对照，N为阴性对照。图4WeStern Blot检测单抗2B4与BHK细胞裂解液以及JEV细胞毒的特异性反应， 其中泳道1为BHK细胞裂解液+单抗2B4，泳道2为JEV细胞毒+单抗2B4。图5流式细胞术分析单抗2B4在自然条件下与BHK细胞以及感染JEV的BHK细胞的结合情况，其中A空白对照，B只加荧光二抗的阴性对照，C单抗2B4与BHK细胞的反应， D单抗2B4与感染JEV的BHK细胞的反应。图6细胞中和实验。图7中和实验-间接免疫荧光。图8单抗2B4检测患乙型脑炎乳鼠脑脊液的间接免疫荧光结果照片，其中，A D依次为本发明单抗2B4检测作10倍的梯度稀释(IO-1UO-2UO-3UO-4) 检测样品BS-V结果图，E为多抗的阳性对照(用常规方法免疫兔产生)，F为本发明单抗 2B4检测BS结果图，G为只加荧光二抗的阴性对照。生物样品保藏信息杂交瘤细胞株2B4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 5124，保藏日期2011年8月3日。
具体实施例方式实施例1制备纯的全病毒抗原步骤1病毒的增殖用BHK细胞(上海晶科生物有限公司)培养于含有8%的犊牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，100U/ml的青霉素，100 μ g/ml链霉素的DMEM中，长成细胞单层后倒掉营养液，用PBS (pH7. 2)或无血清的营养液洗1遍，接种JEV(SA14-14-2，湖南中岸生物药业有限公司)，37°C作用 1. 5-2h，然后用 PBS (NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HP04 4. 3mmol/L, KH2P041. 4mmol/L)或无血清的营养液洗1遍，加2%的维持液，置37°C C02培养箱培养，2 3天后显微镜下观察，当细胞病变(CPE)达85%时，-20°C冻存待用。步骤2病毒的浓缩与纯化将收集的病毒反复冻融3次，悬液5000r/min离心20min，取上清(Si)待用，将沉淀用0. OlM的PBS重新悬�。贸呀庵�100W, 30S/次，反复3次。再用6000r/min离心20分钟取上清(S》，弃去沉淀。将Sl和S2混合，加入NaCl和PEG6000，使其终浓度分别达到2% -3%和7%，在4°C下搅拌过夜，次日7000r/min离心20分钟，弃去上清，沉淀用 TNCdOmM TrisUOmM NaCl 和 2mMCaC12,pH7. 8)，缓冲液悬浮至 240ml，再以 27000r/min 离心(SW^转子)2小时，弃去上清，用TNC悬浮沉淀至12ml。将此病毒悬液轻轻加于30%、 45%、60%的非线性蔗糖密度梯度上，再以lOOOOOg/min离心池，分别收集各梯度区带上的蛋白提取物。再分别用TNC稀释各梯度区带上的蛋白提取物，以27000r/min离心2小时， 弃上清，用少量TNC悬浮沉淀，冻存待用。步骤3RT-PCR鉴定以及电镜观察此步骤整个过程除水浴锅及PCR部分以外均在生物洁净工作台操作。对实施例1步骤2中所收集的各梯度区带上的蛋白提取物，即四组样品(加样区，30% -加样区、30% -45%,45% -60% ；离心管各组分加入顺序是60%的蔗糖溶液，45%的蔗糖溶液，30%的蔗糖溶液，样品；加样区就是指加样时加入样品的那段体积，然后分别取相邻两种不同密度蔗糖溶液界面上的样品。)提RNA，依照JEV Cap蛋白的体系做RT-PCR， 鉴定病毒所在区域，并对四组样品进行电镜观察，过程如下(I)RT-PCR每组样品取250 μ 1，并加PBS稀释到500 μ 1，加入700 μ 1 Trnzol (裂解)，上下温和混勻，静置2min。加入氯仿200 μ 1 (去蛋白)，剧烈震荡后静置2min, 12000r/min离心 15min。取上清，并加入等体积异丙醇(沉淀RNA)，于-20°C放置15min以上。然后，12000r/ min离心20min，弃上清，并用75%的乙醇洗涤一次，充分晾干。最后，用20 μ IRNAse free H2O重悬。按体系(dNTP-4 μ 1 ；Oligo DT-I μ 1 ；样品，即上述步骤中提取的RNA-5 μ 1 ；RNAse free Η20_3 μ 1)加好所有的组分，放入65°C水浴锅5min后，再置于冰盒上aiiin。然后，按照体系(5XFsbuffer-4y 1 ；DTT-2 μ 1 ；RNA酶抑制剂-0. 5 μ 1)加好所有的组分，放入37°C 水浴锅2min，然后置于冰盒加入0.7μ 1鼠逆转录酶，然后放入PCR仪中，设置37°C 50min, 75 °C 15min。按照PCR体系IOXFs buffer5μ 1 ；dNTP4μ 1 ；上游引物为(SEQID NO. 1) 1 μ 1 ；下游引物为(SEQID NO. 2) 1 μ 1 ；rTag 酶0. 5 μ 1 ；RNAse free H2O34 μ 1 ；样品5μ1加好所有的组分后放入PCR仪，95 °C预变性Imin，扩增条件为94 V Imin, 570C lmin，72°C lmin，35cycles，72°C延伸 Imin0最后，跑胶鉴定(水平电泳系统购自Bio Rad公司产品)，如图1所示，在 30% -45%和45% -60%之间有病毒。(2)电镜观察对实施例1步骤3中所提到的4组样品进行电镜观察，结果如图2，30% -45% — 层样品中有比较多的病毒粒子，而45%-60%—层样品中含量比较少，且有许多杂蛋白，因此，比较而言，30% -45% —层样品中的病毒比较纯，测浓度后作为以下实施例中免疫原备用。实施例2杂交瘤细胞系的建立步骤1小鼠免疫以实施例1中纯化的30% -45%的乙脑全毒免疫3只BALB/C小鼠(6_8周龄，购自人民解放军军事医学科学院实验动物中心):i第一次免疫乙型脑炎病毒150 μ g/只， 加等体积福式完全佐剂(CFA，sigma公司)充分混勻后以Iml/只皮下多点注射BALB/C小鼠，0. 2ml/点，间隔3周。ii第二次免疫剂量及途径同上，此次加等体积福式不完全佐剂 (IFA, sigma公司)，间隔3周。iii第三次免疫剂量同上，不加佐剂，改用等体积的生理盐水，腹腔注射BALB/C小鼠；10天后取被免疫小鼠的眼球血(采集后即置4°C冰箱过夜，次日以2000r/min离心IOmin后，留上清备用)。以纯化的乙脑病毒包被，通过ELISA测定血清效价。iv第四次加强免疫剂量及途径同第三次免疫，取血清效价大于1 10000的小鼠于融合前3天腹腔注射。步骤2ELISA法检测被免疫小鼠的血清效价流程检测前一天，用包被缓冲液(0. 05mol · L^NaHCO3-Na2CO3缓冲液，pH9. 6)稀释纯化的乙脑病毒(实施例1制备或纯化的30% -45%的乙脑全毒)加入酶联免疫吸附板中， 每孔100μ 1，置4°C冰箱过夜；次日到出已包被的酶联免疫吸附板孔内的液体，以洗涤缓冲液(每IL PBS加入0. 5ml Tween-20，PH7. 4)洗涤共3次，每次拍干，加入封闭液150 μ 1/ 孔(每IOOml的PBS加入IgBSA, ρΗ7· 4，BSA购自北京鼎国生物技术有限公司)，置37°C作用2小时；用上述方法洗涤3遍，拍干，加入PBST进行梯度稀释的待检血清(稀释度分别为1 100,1 1000,1 2000,1 4000,1 8000,1 16000) 100 μ 1/孔，以未免疫的BALB/C小鼠的血清为阴性对照，以免疫后抗体效价大于1 10000的BALB/c小鼠眼球血中分离的血清为对照阳性血清，置37°C作用恒温箱1小时；再次用PBST洗涤，方法同上， 拍干，每孔加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(北京鼎国昌盛生物技术有限公司，用PBST进行1 20000稀释)100 μ 1，置37°C作用恒温箱1小时；洗涤3遍，拍干，每孔加TMB显色液 (现配现用；底物缓冲液为0. 05mol · L-1PH5. 0磷酸-柠檬酸；TMB使用液为每IOml底物缓冲液中加入100 μ 1 TMB和75%的双氧水35 μ 1，TMB购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司)100μ 1，置37°C作用恒温箱15-20min ；然后加入终止液(2M H2S04) 100 μ 1/孔，用酶标仪检测0D450nm值，以空白对照调零，S为各检测孔的值，N为阴性对照的平均值，P为阳性对照的平均值。在P/N彡3的情况下，S/N =待检孔的0D450nm值/阴性对照孔的0D450nm， 平均值彡3时判定为阳性。步骤3骨髓瘤细胞、脾细胞及饲养细胞的制备(1)骨髓瘤细胞的制备在融合前2周复苏骨髓瘤SP2/0细胞(上海雅吉生物科技有限公司)，于液氮罐取出后在37 °C水浴中迅速解冻，1500r/min离心8min，弃上清后用20%胎牛血清的 1640 (Gibco公司)培养基重悬，置37°C、5 % C02培养箱中培养，次日换液，连续培养几天待骨髓瘤瘤细胞的活性恢复后，用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞，1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植(其目的是为了使细胞处于对数生长期)。融合前1 换液一次。融合当天，将细胞从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心管内，IOOOr · HiirT1离心5-lOmin，弃上清。将沉淀细胞用30mL不完全培养基，同法离心一次，然后重悬于IOml无血清的1640中混勻。加0. 4%台酚蓝染色液作活细胞计数，备用，约 4X107/ml。(2)脾细胞的制备取免疫后抗体效价为阳性的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清为抗体检测时的阳性对照血清。脱颈处死小鼠，浸入75%酒精中消毒5min，放入超净工作台中，无菌打开腹腔，取出脾脏，置于含IOmL不完全1640培养基的平皿中，轻轻洗涤，剥离脾脏表面的结缔组织，然后将脾脏放在另一个含IOmL不完全1640培养液的平皿中，并置于200目筛网中，用注射器内芯轻轻研磨，使其释放出脾细胞。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液，IOOOr · HiirT1离心5-lOmin，用不完全培养基离心洗涤1_2次，然后将脾细胞重悬于含IOmL 不完全1640培养液的50mL V形离心管中，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用，约2X108/ ml ο(3)饲养细胞的制备在细胞融合前1-2天制备饲养细胞(腹腔巨噬细胞)按上述采小鼠(6周龄的 BALB/C小鼠)脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用无菌剪刀剪开腹部皮肤以暴露腹膜，用酒精棉球擦拭消毒，用无菌注射器每次注射IOml不完全1640培养液至腹腔， 反复冲洗，吸出冲洗液放入50ml离心管中(共约40ml)，以lOOOr/min离心5_10分钟，弃上清后先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬�。菁剖峁辜拥�2 X 105/ml，加入96孔细胞培养板，100 μ 1/孔，放入37°C 5%的(X)2细胞培养箱培养。步骤4细胞融合过程a将50% PEG(pH8. 0) Iml预热至40°C，将不完全培养基(20-30ml)预热至37°C。b将1 X IO8脾细胞与3 X IO7个骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50ml融合管里，补加不完全培养基至30ml，充分混勻。lOOOr/min离心5-lOmin，尽量将上清吸干净(很重要， 会影响融合作用效率)。用手轻轻拍打融合管底，使沉淀细胞松散均勻，置40°C中水浴中预热。c用Iml吸管沿管壁在4 左右加预热的50% PEG，边加边轻轻搅拌。用IOml吸管在90s内沿管壁加预热的不完全培养基，37°C静置lOmin，1000r/min离心5min，弃上清。d加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混勻，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。e分装至96孔细胞培养板，100-500 μ 1/孔，将培养板置于37°C 5%的(X)2细胞培养箱培养。5天后用HAT (Sigma公司)培养基换出1/2培养基。7_10天后用HT (Sigma公司)培养基患处HAT培养基，14天以后可用普通完全培养基。f观察杂交瘤细胞的生长状态，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测用。步骤5杂交瘤的筛选融合2周左右可以开始筛�。凑帐凳├�2步骤2进行操作，不同之处是用包被缓冲液稀释纯化的乙脑病毒至15 μ g/ml ；加入待检杂交瘤细胞上清稀释度分别为1 100、 1 1000、1 2000、1 4000、1 8000、1 16000，结果阳性值高的孔便进行克隆化。步骤6杂交瘤的克隆化、扩大培养及冻存杂交瘤的克隆化采用有限稀释法进行，具体方法如下a制备饲养细胞悬液方法同实施例2步骤3中(3) —致。b制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2. 5、 15和50个细胞3种不同的稀释度，按5X IO4-I XlO5Ail的比例分别加入腹腔巨噬细胞。每种杂交瘤细胞分装一块96孔板，每个稀释度32孔，200 μ 1/孔，每孔的数量分别为0. 5、3、 10。c37°C 5%的(X)2细胞培养箱培养7_10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测，将阳性孔中细胞进行下一次的克隆化，如此重复3次后便得到能稳定分泌单抗的杂交瘤(进行克隆化的一株细胞下一次克隆化的所有单克隆孔均为阳性)。
d选取阳性最强的单克隆孔中的细胞2B4转入M孔板中培养(一孔转一孔)，3天后于M孔板中分成2孔，再3天后分成4孔，再隔2天后将此4孔的细胞一并转入50ml细胞培养瓶中扩大培养，从而得到了分泌抗JEV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，送交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 杂交瘤细胞株2B4保藏号为CGMCC No. 5124，保藏日期2011年8月3日。e杂交瘤细胞的冻存待50ml培养瓶内细胞铺满瓶底约70%时，将培养瓶中的细胞用吸管吹打至完全悬浮起来，将细胞悬液移于50ml无菌离心管内并计数，离心1200r/ min,6min ；弃上清，以细胞冻存液(30%胎牛血清、60%不完全1640培养液、10% DMS0)(胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMSO购自上海凌峰化学试剂有限公司)重悬沉淀，调节细胞密度为lX107ml ；分装于冻存管，lml/支，置4°C冰箱lh，再转入-20°C冰箱放置lh，再转入_40°C冰箱lh，再转入液氮罐口过夜，次日将冻存的细胞浸入液氮冻存。实施例3体内诱生腹水法制备单抗取10只6-8周龄的BALB/C小鼠，腹腔注射液体石蜡0. 4ml/只预致敏，7d后用杂交瘤细胞2B4 (CGMCC No. 5124)以1 X IO6个/只(等量生理盐水稀释成500 μ 1/只)的量腹腔注射上述预致敏的小鼠，10-14d后观察小鼠，腹胀明显、行动迟缓、不思饮食且毛发错乱时即处死采腹水，用注射器将腹水收集到离心管中，2000r/min，离心lOmin，取上清即为大量单克隆抗体2B4的腹水，置4°C冰箱备用，长期保存则冻_20°C或-40°C。实施例4单克隆抗体亚类的鉴定Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit 1 ^: (Pierce ^W]), 骤参照其说明书如下(1)取出酶标板，每个标本需要6孔，将细胞培养上清50 μ 1/孔加入酶标板，每个标本加6孔，阳性对照和阴性对照也是各加6孔每孔50 μ 1，然后每孔再加入50 μ 1标本稀释液，贴上封板膜37°C温育30-40min。(2)洗板机(ΒΙ0-ΤΕΚ公司产品)洗5遍，再在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗(IgGl\IgG^i\IgG2b\IgG3\IgM\IgA)各100μ 1，通用阳性对照的6孔也一样，在加样图上或酶标板上做好标记，贴上封板膜37°C温育30-40min。(3)洗板机洗5遍，每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50 μ 1，换一张新的封板膜贴板避光37°C显色20-30min，终止反应判定结果。测定结果，杂交瘤细胞株2B4(CGMCC No. 5124)分泌的单抗为IgGl，κ。实施例5单抗的纯化用HiTrap affinity columns (GE公司)进行腹水的纯化，步骤如下(1)腹水用 binding buffer (20mM Na2HPO4, PH 8-9)稀释成 3 倍，用 0. 22 的滤器
过滤ο(2) 10倍柱体积的binding buffer洗柱子，排掉恒流泵上样管中的气泡，流速为 Iml · min—1O(3)用恒流泵加入上述(1)中过滤好的腹水样品。(4)用 5-10 倍柱体积的 binding buffer 洗涤(5)用2-5柱体积的elution buffer (0. IM柠檬酸，PH4. 5-6. 0)洗脱单抗并收集于提前准备好的收集管中(每管加60-200 μ 1的IM Tris-HCl, ρΗ 9. 0)
(6)每管各取15 μ 1进行SDS-PAGE分析其纯化效果，并测浓度，浓度为2. 173mg/ ml ο实施例6单抗的特性鉴定步骤1杂交瘤细胞培养上清及单抗的效价测定两种测定的方法基本一致按照实施例2步骤2进行操作，不同之处是加入待检细胞上清(杂交瘤CGMCC No. 5124 上清)稀释度分别为1 100,1 200,1 400,1 800,1 1600,1 3200， 测腹水效价时稀释度为1 IOOOU 3000,1 9000,1 27000,1 81000。以未免疫的 BALB/C小鼠的血清为阴性对照，用抗JEV的兔血清多抗(以常规方法制备)作为阳性对照 (1 50)，多抗相应的二抗为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白HRP-SPA(1 5000，构自武汉博士德试剂公司)结果如表1和表2，可见杂交瘤细胞CGMCC No.51M上清的效价大于1 2500，单克隆抗体2B4(实施例4纯化)的效价为1 80000左右。表1、2B4的细胞上清的效价测定
权利要求
1.分泌抗乙脑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B4，2011年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 51M。
2.一种抗乙脑病毒的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测乙脑病毒的检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明属于生物领域，涉及抗乙型脑炎病毒的单克隆抗体及其应用。分泌抗乙脑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B4，2011年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5124。一种抗乙脑病毒的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No.5124的杂交瘤细胞株2B4产生。该单克隆抗体能够特异性地识别乙型脑炎病毒，细胞和动物实验都表明该单克隆抗体具有中和活性，可在制备检测乙脑病毒的检测试剂中应用。本发明抗JEV单克隆抗体的成功制备对于JEV的进一步研究以及建立更快速、灵敏、方便的检测方法以及开发相关的诊断试剂盒、试纸条和疫苗奠定了基础。
文档编号G01N33/577GK102286431SQ20111027233
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者周斌, 曹瑞兵, 苏小东, 邓文蕾, 陈溥言 申请人:南京农业大学
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