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专利名称：一种零死体积毛细管柱连接方法及专用装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及毛细管电色谱柱，具体地说是一种零死体积毛细管柱连接方法及专用装置。
背景技术：
毛细管电色谱是近年来发展十分迅速的一种新型分离技术；它是将固定相填充在毛细管中，或键合、涂布到毛细管内表面，以电渗流作为流动相的推动力，根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异和在电场中电泳迁移速率的不同而实现分离的一种高效分离技术；毛细管电色谱可以看作是高效液相色谱和毛细管电泳相结合的产物；它同时具有高效液相色谱的高选择性和毛细管电泳的高效、分析速度快以及样品和试剂消耗量少等优点(文献1.Pretorious，R.C.，Hoppkins，B.J.，Schieke，J.D.，J.Chromalogr.1974，99，23-30.文献2.Jorgenson，J.W，Lukacs，K.D.，J.Chromatogra.1981，218，209-216.文献3.Tsuda，T.，Nomura，K.，Nakagawa，G.，J.Chromatogr.1982，248，241-247.)。因此自九十年代以来，毛细管电色谱受到了越来越广泛的关注；有关毛细管电色谱的文章每年呈指数形式增长，其分离模式基本上囊括了所有可在高效液相色谱上实现的分离模式，并已在环境、药物和生化等领域中得到了应用。在毛细管电色谱发展的初期，繁琐的装柱过程和封口的制作制约了其发展；封口的制作是十分关键的步骤，它不仅决定了柱系统的柱间重现性，而且直接影响到柱性能的发挥；目前，毛细管电色谱填充柱在使用中最常遇见的问题是柱系统中气泡的产生，其原因主要是由于流动相在通过封口时流速的变化所致，毛细管中产生的气泡会引起基线不稳甚至实验中断等问题。然而制备一个好的封口不仅需要精密的仪器控制，而且也有赖于操作者丰富的经验。
连续床层毛细管电色谱是近年来发展起来的新型毛细管电色谱柱模式，它是通过原位聚合或溶胶凝-胶法在毛细管中形成连续、整体和多孔的固定相床层的一种电色谱模式；由于连续床层可实现与管壁键合，不需要制备封口，从而避免了由封口所引起的所有问题，并且其制备过程同传统的颗粒填充柱相比大为简化；有关连续床层毛细管电色谱的研究目前十分活跃，其有望取代传统的颗粒填充型毛细管电色谱柱(文献4.Svec，F.，Peters，E.C.，Sykora，D.，Fréchet，J.M.J.，J.Chromatogr.A2000，887，3-29.文献5.Svec，F.，Peters，E.C.，Sykora，D.，Yu，C，Fréchet，J.M.J.，J.High Resolut.Chromatogr.2000，23，3-18.文献6.Zou，H.F.，Huang，X.D.，Ye，M.L.，Luo，Q.Z.，J.Chromatogr.A2002，954，5-32.文献7.Adam，T.，Unger，K.K.，Dittmann M.M.，Rozing，G.P.，J.Chromatogr.A2000，887，327-337.文献8.Rathore，A.S.，Horváth Cs.，Anal.Chem.1998，70，3069-3077.文献9.Ping.G，Schmitt-Kopplin，P.，Zhang，W.，Zhang，Y.，Kettrup，A.，Electrophoresis accepted.文献10.Rapp，E，Bayer，E.，J.Chromatogr.A2000，887，367-378.)。尽管人们在简化制柱过程和改进柱性能等方面进行了大量的尝试，但是毛细管电色谱柱在检测窗口位置易断的问题一直尚未得到很好地解决。偶联柱(如图1所示其前半部分为分离柱，后半部分为通常作为检测窗口，可更换)虽可很好的解决检测窗口易断的问题，断裂的检测窗口可方便地更换从而使毛细管电色谱柱再生。但是人们一直没有找到实用的、零死体积的毛细管连接办法。
目前虽然可以采用已商品化的零死体积二通来实现毛细管之间的连接，但二通的体积过大，限制了其应用。我们知道，毛细管电色谱实验大部分是在商品化的毛细管电泳上进行的，为了有效地控制毛细管电色谱柱的温度，毛细管一般安装在卡盒内，而二通的体积过大，无法安装在卡盒中进行实验，此外，商品化的零死体积二通大都由金属或聚醚醚酮(PEEK)不透明材料制成，毛细管连接质量的好坏无法直观辨别。另外在文献中，为了避免在毛细管连接时产生的碎屑问题，有人使用内径较大的聚四氟乙烯管进行毛细管连接，然后在330℃下加热，使聚四氟乙烯管收缩，从而达到紧密连接毛细管的目的(文献11.Rapp，E.，Bayer，E.，J.Chromatogr.A2000，887，367-378.)；但上述加热步骤会对固定相产生不利影响，即使是对热稳定性很好的以硅胶为基质的固定相来说，在330℃的高温下会引起固定相或多或少的流失，尤其使用的分离柱为聚合物整体柱时，高温会使聚合物分解，从而会影响其柱性能。

发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种实用、能较好地保持色谱柱柱性能的零死体积毛细管柱连接方法及专用装置。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为零死体积毛细管柱的连接；1)平整末端毛细管柱的制备将毛细管柱在砂纸上研磨(砂纸的目数越高，所获得的毛细管末端的平整性越高，以不小于500目即可，较优选的应为1000目以上)，在研磨过程保持砂纸平面与毛细管柱的轴向完全垂直，并且砂纸保持湿润状态；2)毛细管柱的连接a.采用内径比毛细管外径小的聚四氟乙烯管，用针头将其一端稍稍扩展，并使该扩展部分的聚四氟乙烯管的内径大于毛细管柱的外径，然后将毛细管柱从这一端插入聚四氟乙烯管，直至所需位置，并将疑有碎屑的插入端切除；b.取另一根毛细管柱，仍然从扩展端插入聚四氟乙烯管中，当两根毛细管柱的端口紧密接合并将接口移动至所需位置后停止，最后割除聚四氟乙烯管的扩展部分。
其中在毛细管柱研磨过程中，最好将毛细管柱的非研磨端与高压泵相连接并同时通水，在研磨时一直保持高压通水状态。
为实现上述方法的研磨过程，本发明设计一专用装置，其为高效液相色谱用二通(a)与手拧螺丝(b)螺纹连接而成，其中在高效液相色谱用二通(a)内装有PEEK刃环或不锈钢金属刃环。
本发明具有如下优点1.应用效果好。本发明采用聚四氟乙烯管连接毛细管柱可克服目前商品化的零死体积二通连接毛细管柱体积过大的弊端，其可安装在卡盒内进行实验，有效地控制毛细管电色谱柱的温度。
2.使用方便。商品化的零死体积二通大都由金属或PEEK不透明材料制成，毛细管柱连接质量的好坏无法直观辨别；而本发明采用的聚四氟乙烯管为半透明材料，毛细管柱连接后，可在显微镜下直接观察连接的情况。
3.能较好地保持色谱柱的柱性能。在文献中报道，为了避免在毛细管柱连接时产生的碎屑问题，有人使用内径较大的聚四氟乙烯管进行毛细管柱连接，然后在330℃下加热，使聚四氟乙烯管收缩，从而达到紧密连接毛细管的目的；但上述加热步骤会对固定相产生不利影响，即使是对热稳定性很好的以硅胶为基质的固定相来说，在330℃的高温下会引起固定相或多或少的流失；当所使用的分离柱为聚合物整体柱时，高温会使聚合物分解，从而会对柱性能产生十分不利的影响；而本发明不涉及加热步骤，与文献中的操作条件相比有利于保持色谱柱的柱性能。
4.采用本发明的装置而获得毛细管柱末端更平整，从而进一步保证了毛细管连接质量。
5.操作简易，柱性能好。对于毛细管电色谱聚合物整体柱，为了制备检测窗口，在制柱过程中大部分都通过采用部分填充的方式来实现，即检测窗口的前面有固定相，而检测窗的后面没有填料，这就要求在制备毛细管电色谱整体柱时，注入毛细管内的聚合物反应液的位置要严格控制。(这对于初学者来说，还有一定的难度)如果采用偶联柱，则在制备毛细管整体柱时可方便的将毛细管充满反应液，反应结束后截取所需长度，从而降低了实验难度；另外如果采用部分填充的方式来制备毛细管整体柱，通常会发现在固定相的末端即检测窗口的位置固定相不十分均匀，这可能与其在聚合时反应环境与其他部位不同有关，因为该部分在聚合时与空管部分的残留空气接触，空气中的氧为聚合反应的阻聚剂，进而影响了该部分聚合物的质量，该部分结构不均匀的固定相对整个毛细管整体柱的性能会产生负面影响；而采用偶联柱，可将该结构不均匀部分切除，从而消除其对毛细管整体柱性能的负面影响。
6.实用性强。本发明零死体积毛细管连接方法实用、简便、廉价、易于操作，又可增加电色谱偶联柱的柱性能，使其在实际中发挥应有的作用。


图1为偶联柱结构示意图。
图2为具有不同末端的毛细管柱的比较图。
图3为用于研磨毛细管柱末端的装置示意图。
图4为毛细管柱固定在图3装置中的示意图。
图5为毛细管柱的连接过程示意图。
图6为苯的同系物在使用部分填充柱(a)和偶联柱(b)上分离的电色谱图。
具体实施例方式
本实施例使用的毛细管电色谱柱为聚甲基丙烯酸酯类电色谱整体柱(该类毛细管电色谱整体柱的制备过程可按现有技术的常规方法进行，其具体过程可参阅(文献Svec，F.，Peters，E.C.，Sykora，D.，Fréchet，J.M.J.，J.Chromatogr.A2000，887，3-29和文献Svec，F.，Peters，E.C.，Sykora，D.，Yu，C.，Fréchet，J.M.J.，J.High Resolut.Chromatogr.2000，23).
1)平整末端毛细管柱的制备本发明采用自制的简易设备，如图3所示的装置，其为高效液相色谱用二通(a)与手拧螺丝(b)螺纹连接而成(本实施例中二通和手拧螺丝均购自大连依利特分析仪器有限公司)，其中在高效液相色谱用二通(a)内装有PEEK刃环；首先将毛细管柱插入长度为2.5cm且内径为300μm的聚四氟乙烯管中，然后将其固定图3的装置上，固定后如图4所示，其中PEEK刃环2为黑颜色部分，聚四氟乙烯管1为灰颜色部分；然后将1000目的砂纸放在平整的实验台上，手持图4装置中的二通部分在上述砂纸上湿研磨(在研磨的过程中，砂纸保持湿润状态)；所获得的毛细管柱的末端如图2A所示。
需要注意的是，在研磨过程一定要保证手拧螺丝的平面与砂纸的平面平行，这样才能确保毛细管柱末端的平面与毛细管柱的轴向完全垂直。
如果在实验中使用粒度更小的砂纸，如4000目砂纸，毛细管柱末端的平整性会更高。
另外，在研磨分离柱末端时，为了避免或减缓研磨时的碎屑进入毛细管柱中，可以将毛细管柱的另一端与高压泵相连接并同时通水，并且在研磨时一直保持高压通水状态。
2)毛细管柱的连接在得到了具有平整末端的毛细管柱之后，接下来就需要将分离柱与作为检测窗口的毛细管柱连接在一起；本发明是通过采用聚四氟乙烯管来实现的，为了保证两根毛细管柱的紧密接触，并且使接口可耐一定的压力，以确保在实验运行时不致发生漏液的现象，所以选用的聚四氟乙烯管的内径比毛细管外径小，为300μm，毛细管外径则为375μm；由于聚四氟乙烯的基质相对与熔硅毛细管来说较软，所以在毛细管柱连接的过程中，容易在毛细管柱的接口部分产生碎屑，碎屑会引起色谱峰展宽甚至堵塞毛细管柱；针对这一问题，本发明设计了一种毛细管柱连接方法，彻底解决了在接口部位的碎屑问题。
其具体过程如下(如图5所示)首先截取1.5cm长的聚四氟乙烯管(图5a)，用针头将聚四氟乙烯的一端稍稍扩展，其长度大约为3mm，并使该部分聚四氟乙烯管的内径大于毛细管外径，然后将毛细管柱从这一端插入聚四氟乙烯管(图5b)，在开始时，由于聚四氟乙烯管的内径小于毛细管柱的外径，所以会产生碎屑(图5c)，但随着毛细管柱逐渐穿透毛细管柱时，产生的碎屑会被完全推出(图5d)，此时继续移动毛细管柱，直至毛细管柱的另一端与聚四氟乙烯管的扩展端相距2mm(图5e)，并将疑有碎屑进入的毛细管一端切除少许，约为5mm；取另一根毛细管柱，仍然从扩展端插入聚四氟乙烯管中，因为扩展端聚四氟乙烯管的内径大于毛细管柱的外径，所以在两毛细管柱末端接触时，不会因为毛细管柱与聚四氟乙烯管的内壁摩擦而产生碎屑(图5f)，然后用力将第二根毛细管柱推入聚四氟乙烯管中，当两根毛细管柱的接口距聚四氟乙烯扩展端0.9cm时停止(图5g)，最后仔细地割除聚四氟乙烯管的扩展端(图5h)，约为3mm。
连接后毛细管柱的性能测定a.接口的耐压性为了考察该接口的耐压性，将偶联柱与高效液相色谱泵连接，因为填充毛细管柱具有柱压降，所以应将偶联柱的检测窗口端与色谱泵相连；在压力高达80bar时，未发生任何泄漏现象，说明采用该方法制成的偶联柱具有较高的抗压能力，从而为色谱柱的稳定运行奠定了良好的基础。
b.柱性能采用苯的同系物对偶联柱的性能进行了考察；毛细管柱电色谱实验是在Beckman P/ACE 5010系统上进行的。图6a和b分别为使用部分填充整体柱和偶联柱分离苯的同系物电色谱图；苯的同系物在在部分填充柱(a)和偶联柱(b)上的分离，实验条件固定相，甲基丙烯酸酯类整体柱；流动相，70％乙腈-30％2mM Tris，pH7.7，电压，12kV；柱温，25℃；检测波长，214nm；柱a的总长和有效长度分别为27cm和20cm，对于柱b，其总长和有效长度分别为27cm和18cm；色谱峰，硫脲作为电渗流标记物，峰1-7为苯的同系物(CnH2n+1C6H5，n＝1-7)。
结果如表1所示，可以看出溶质在两种色谱柱上获得的柱效相当；由于受仪器卡盒结构的限制，偶联柱的毛细管柱接口距检测窗口至少为2cm，该部分死体积对色谱柱的柱效是一个负贡献；对于部分填充整体柱，虽然不存在因为检测窗口与接口之间具有一定距离而引起的死体积，但固定相末端结构的不均匀性会引起柱效流失；两种因素可能对柱效的影响相当，从而表现出在两种柱上可获得大体相同的柱效。该现象说明了接口的存在对柱效不会产生显著的影响；如果减小毛细管柱接口与检测窗口之间的距离，可提高偶联柱的柱效。
表1.在部分填充毛细管整体柱和偶联柱上获得的苯同系物柱效的比较

溶质保留时间的重现性同时也是衡量色谱柱性能的重要指标之一；在10次连续运行中，死时间和苯同系物容量因子的相对标准偏差分别为0.8％和0.7％，说明该接口具有良好的稳定性。
比较例1在没有任何实验器械的帮助下直接手持毛细管柱在砂纸上研磨，因为在研磨过程中很难保证毛细管柱的轴向与砂纸平面垂直，从而得到的毛细管柱的往往如图2B所示，如采用具有该种末端的毛细管柱制成的偶联柱在接口部位的死体积则会过大，则很难进行应用。
比较例2毛细管柱的切割是通过商品化的毛细管切管器实现的，但通过该方法而获得的毛细管柱末端在显微镜下观察并不十分平整，尚不能满足偶联柱对毛细管柱末端平整性的要求；也不能进行应用。
权利要求
1.一种零死体积毛细管柱连接方法，其特征在于1)平整末端毛细管柱的制备将毛细管柱在目数不小于500目的砂纸上研磨，在研磨过程保持砂纸平面与毛细管柱的轴向完全垂直，并且砂纸保持湿润状态；2)毛细管柱的连接a.采用内径比毛细管柱的外径小的聚四氟乙烯管，用针头将其的一端稍稍扩展，并使该扩展部分的聚四氟乙烯管的内径大于毛细管柱的外径，然后将毛细管柱从这一端插入聚四氟乙烯管，直至所需位置，并将疑有碎屑的毛细管柱插入端切除；b.取另一根毛细管柱，仍然从扩展端插入聚四氟乙烯管中，当两根毛细管柱的端口紧密接合后停止，最后割除聚四氟乙烯管的扩展部分。
2.按照权利要求1所述零死体积毛细管柱连接方法，其特征在于所述步骤1)平整末端毛细管柱的制备过程中，将毛细管柱的非研磨端与高压泵相连接并同时通水，在研磨时一直保持高压通水状态。
3.按照权利要求1所述零死体积毛细管柱连接方法，其特征在于所述砂纸目数不小于500目。
4.一种权利要求1所述零死体积毛细管柱连接方法的专用装置，其特征在于其为高效液相色谱用二通(a)与手拧螺丝(b)螺纹连接而成，其中在高效液相色谱用二通(a)内装有PEEK刃环或不锈钢金属刃环。
全文摘要
本发明涉及毛细管电色谱柱，是一种零死体积毛细管柱连接方法及专用装置。其连接操作为1)将毛细管柱在砂纸上研磨；2)采用内径比毛细管柱的外径小的聚四氟乙烯管，用针头将其的一端稍稍扩展，将毛细管柱从这一端插入聚四氟乙烯管；取另一根毛细管柱，仍然从扩展端插入聚四氟乙烯管中，当两根毛细管柱的端口紧密接合后停止，最后割除聚四氟乙烯管的扩展部分。所述专用装置为高效液相色谱用二通(a)与手拧螺丝(b)螺纹连接而成，其中在高效液相色谱用二通(a)内装有PEEK刃环或不锈钢金属刃环。本发明应用效果好，使用方便，柱性能好，实用性强。
文档编号G01N30/60GK1499201SQ0214458
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月8日 优先权日2002年11月8日
发明者平贵臣, 张玉奎, 张丽华, 张维冰, 段继诚 申请人:中国科学院大连化学物理研究所