专利名称：鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法
技术领域：
本发明涉及鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法，特别涉及用玉米籽粒含油量作为 标记鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法。
背景技术：
玉米是雌雄同株异花、进行有性生殖的作物。玉米育种工作中主要是利用玉米 有性生殖的方式选育玉米自交系、配制玉米组合、繁制玉米杂交种。但是在培育玉 米自交系的过程中，必须经过多代的自交和选择。通常选育一个品种需要上十年的 时间，需要消耗大量的人力、物力和财力。因此如何縮短育种进程、提高育种效率 是育种家们一直追求的目标。
玉米单倍体是配子体无融合生殖的产物，包括孤雄生殖和孤雌生殖两大类。对 获得的单倍体进行人工加倍，只需一个世代就可以获得纯合二倍体，大大縮短育种 时间。自从Guha (Guha S， Maheshwari S C. In vitro production of embryos from anther of Dature[J]. Nature, 1964， 204:497)经过花药培养单倍体而揭示了通过实验 途径可以获得单倍体后，通过组培途径选育自交系的方法被认为很有希望的方法。 但是由于花药培养难度大，技术操作复杂，并且基因型依赖性很强，并且选育出的 自交系不一定是优良的自交系，难以在生产中利用。
孤雌生殖单倍体可以通过生物诱导和非生物诱导如化学诱导等途径产生，但非 生物诱导的问题与花药组培一样存在很多困难，很难在育种上应用。生物诱导是利 用生物诱导材料使诱导对象产生单倍体。Coe (Coe EH. A line of maize with high haploid frequency [J] .Am Nat， 1959,93:381-382)在1959年发现了玉米孤雌生殖 诱导系Stock6。后来在其基础上不断改造，如转入Navajo (ACR-nj)遗传标记基因， 通过籽粒颜色和植株颜色鉴定出单倍体，从而使杂交诱导单倍体进行单倍体育种成 为了可能。但是在实践应用中也发现，Stock6的诱导率也很低(约为3%)，并且存 在很多严重的缺陷，如雄花对温度敏感，自交结实性差，穗粒腐病严重，Navajo 遗传标记较弱。因此，利用Stock6诱导单倍体的关键是要在保持其诱导能力的前 提下克服上述缺点。国外在这方面起步较早，并已取得了较大进展，成功选育出了 一些优良的诱导系，如法国的WS14 (Lashermes P， Beckert M. Genetic control of
maternal haploidy in maize (Zea mays L.) and selection of haploid inducing lines [J]. Theor Appl Genet, 1988， 76(3): 405-410)、前苏联的KEMS (Shatskaya 0 A. et al， Mass induction of maternal haploids in corn[J].Maize Genet Coop Newslett， 1994,68:51)，摩尔多瓦的MHI (ChalykST. Creating new haploid-inducing lines of maize[J]. Maize Genet Coop Newslett, 1999， 73: 53 -54)，德国的 RWS(F. K. Rober et al. ， In vivo haploid induction in maize-Performance of new inducers and significance of doubled haploid lines in hybrid breeding[J].Maydica， 2005， 50:275-283)等等。这些新选的诱导系不但适应当地的 环境，而且其诱导率及遗传标记也进一步提高，利用价值已经大大超出了Stock6，
单倍体诱导率的大大提高使生物诱导单倍体育种的可行性大大提高，但是单倍 体的鉴定还是一个挑战。目前单倍体的鉴定主要依赖于A1A2C1C2BP1R-nj显性标记 系统。它首先根据籽粒Navajo标记性状(由AlA2ClC2R-nj基因控制)分拣出可能 的单倍体籽粒，再经过苗期植株颜色(由A1A2BP1基因控制)来确定单倍体植株的 真伪。但是在实践中发现，该标记系统的基因型选择性比较强，不同的材料标记表 达差别很大，有的材料几乎不能用籽粒Navajo标记鉴定；而且不同的环境条件对 标记的表达影响也很大。另外利用籽粒颜色进行单倍体鉴定需要花费大量的人力物 力。因此开发出新的标记以高效鉴定单倍体对单倍体育种非常重要，同时机械化迸 行单倍体挑选也是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种快速、高效地鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法。 本发明所提供的鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法，包括以下步骤
(1) 用玉米单倍体诱导系作为父本与母本玉米进行杂交，收获杂交当代籽粒；
(2) 确定鉴别标准值；
(3) 检测待测单个所述杂交当代籽粒的含油量，若所述待测单个杂交当代籽 粒的含油量《所述鉴别标准值，则所述待测单个杂交当代籽粒为单倍体；
所述鉴别标准值可以按照如下方法确定随机抽取所述杂交当代籽粒，计算所
述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值和标准差，再按照如下公式计算所述鉴
别标准值
所述鉴别标准值二所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值-AX所述随机 抽取的杂交当代籽粒的含油量标准差；1. 96《所述A《2. 58。
其中，所述A具体还可以按照如下方法确定
(1) 当参考值K参考值2时，A值为2.58;
(2) 当参考值2 <参考值1 <参考值3时，A值为2. 24;
(3) 当参考值3<参考值1<参考值4时，A值为1.96;
(4) 当参考值4<参考值1时，A值为1.96;
所述参考值1=随机抽取的自交当代籽粒的含油量平均值+1. 96X随机抽取的自 交当代籽粒的含油量标准差；
所述参考值2=所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值-2. 58X所述随机
抽取的杂交当代籽粒的含油量标准差；
所述参考值3=所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值-2. 24X所述随机 抽取的杂交当代籽粒的含油量标准差；
所述参考值4=所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值-1. 96X所述随机 抽取的杂交当代籽粒的含油量标准差；
所述随机抽取的自交当代籽粒按照如下方法获得用所述母本玉米进行自交. 收获自交当代籽粒，随机抽取所述自交当代籽粒。
一般情况下，所述随机抽取所述杂交当代籽粒大于等于50粒即可；所述随机 抽取所述自交当代籽粒大于等于50粒即可。
所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值和标准差是按照如下方法得到 的从所述随机抽取的杂交当代籽粒中去掉含油量异常的杂交当代籽粒，然后再计 算得到所述平均值和标准差；所述含油量异常的杂交当代籽粒为含油量与所有随机 抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值相差2个百分点以上的籽粒；
所述随机抽取的自交当代籽粒的含油量平均值和标准差是按照如下方法得到 的从所述随机抽取的自交当代籽粒中去掉含油量异常的自交当代籽粒，然后再计 算得到所述平均值和标准差；所述含油量异常的自交当代籽粒为含油量与所有随机 抽取的自交当代籽�：土康钠骄迪嗖�2个百分点以上的籽粒。
所述玉米单倍体诱导系的籽粒含油量大于等于6% (质量百分含量)。
本发明的另一个目的是提供另一种鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法，该方法是 将上述油份鉴定方法与籽粒颜色鉴定方法相结合。
本发明所提供的另一种鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法，包括以下步骤 (1)用玉米单倍体诱导系作为父本与母本玉米进行杂交，收获杂交当代籽粒;
7 (2) 鉴定所述杂交当代籽粒的颜色，将胚乳为紫色、胚芽非紫色的所述杂交
当代籽粒鉴定为拟单倍体籽粒；将胚乳为紫色、胚芽为紫色的所述杂交当代籽粒鉴 定为非单倍体籽粒；
(3) 确定鉴别标准值；
(3)检测待测单个拟单倍体籽粒的含油量，若所述待测单个拟单倍体籽粒的 含油量《所述鉴别标准值，则所述待测单个拟单倍体籽粒为单倍体
所述鉴别标准值按照如下方法确定随机抽取所述非单倍体籽粒，计算所述随 机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值和标准差，再按照如下公式计算所述鉴别标 准值
所述鉴别标准值=所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值-AX所述随机 抽取的非单倍体籽粒的含油量标准差；1. 96《所述A《2. 58。 其中，所述A还可以按照如下方法确定
(1) 当参考值K参考值2时，A值为2.58;
(2) 当参考值2<参考值1<参考值3时，A值为2.24;
(3) 当参考值3<参考值1<参考值4时，A值为1.96;
(4) 当参考值4 <参考值1时，A值为1. 96;
所述参考值1=随机抽取的自交当代籽粒的含油量平均值+1. 96X随机抽取的自 交当代籽粒的含油量标准差；
所述参考值2=所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值-2. 58X所述随机 抽取的拟单倍体籽粒的含油量标准差；
所述参考值3=所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值-2. 24X所述随机 抽取的拟单倍体籽粒的含油量标准差；
所述参考值4=所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值-1. 96X所述随机 抽取的拟单倍体籽粒的含油量标准差；
所述随机抽取的自交当代籽粒按照如下方法获得用所述母本玉米进行自交， 收获自交当代籽粒，随机抽取所述自交当代籽粒。
所述随机抽取所述非单倍体籽粒大于等于50粒；所述随机抽取所述自交当代 籽粒大于等于50粒。
所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值和标准差是按照如下方法得到 的从所述随机抽取的非单倍体籽粒中去掉含油量异常的杂交当代籽粒，然后再计
算得到所述平均值和标准差；所述含油量异常的非单倍体籽粒为含油量与所有随机 抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值相差2个百分点以上的籽粒；
所述随机抽取的自交当代籽粒的含油量平均值和标准差是按照如下方法得到 的从所述随机抽取的自交当代籽粒中去掉含油量异常的自交当代籽粒，然后再计 算得到所述平均值和标准差；所述含油量异常的自交当代籽粒为含油量与所有随机 抽取的自交当代籽�：土康钠骄迪嗖�2个百分点以上的籽粒。
所述玉米单倍体诱导系的籽�：土看笥诘扔�6% (质量百分含量)。 所述母本可为符合育种目标或者研究目标的玉米自交系、玉米基础群体或玉米
杂交种。
其中，所述的基础群体指由多个自交系或品种按一定方式混合授粉后形成的玉 米群体。
所述的杂交种指单交种、三交种或者双交种。
上述方法中，籽粒含油量可以通过核磁共振仪(醒R)或者近红外单粒测定仪 (NIR)等方法进行测定。
本发明油份鉴别方法只要通过检测籽粒的含油量即可鉴别出单倍体籽粒，其中 的油份标记性状很稳定；尤其是当选用高油型单倍体诱导系作杂交父本时，能使当 代杂交二倍体籽粒的含油量大大提高，提高了当代单倍体籽粒与当代杂交二倍体籽 �：土康牟钜欤佣辜ㄐ氏灾岣�。实验结果表明，与传统的籽粒颜色标 记鉴别方法相比，本发明鉴别方法鉴定效率提高了约12.7%。另一方面，传统的籽 粒颜色标记鉴别方法在诱导系不具有籽粒颜色标记、籽粒颜色表达受到抑制或者籽 粒颜色标记表达不明显时就会受到限制，而本发明油份鉴别方法不会受籽粒颜色深 浅的影响。因此，与传统方法比，本发明油份鉴别方法具有操作简便、省时省力、 鉴定效率高的特点。
本发明鉴别方法以油份作为新的遗传标记，为单倍体鉴定开辟了新的途径，使 鉴定不仅依赖于籽粒颜色和植株形态等方法，大大扩展了应用范围，并可以进行大 规模操作，为机械化进行单倍体挑选提供了可能，进而为提高育种效率提供了保证。
本发明的将油份鉴别和籽粒颜色鉴别相结合的方法，可以使单倍体鉴定的操作 更加灵活，可以先依靠籽粒颜色把那些非常明显肯定不是单倍体的籽粒去除掉，然 后再利用油份高效率地鉴定出单倍体籽粒，使鉴定的准确性更高。
图1为利用油份鉴定单倍体的方法流程图。 图2为籽粒颜色、油份含量结合的单倍体鉴定方法流程图。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明中所述的籽粒油份含量(或籽�：土�、或籽粒油份)是指每个玉米籽 粒中油的质量占籽粒总质量的百分比。
普通玉米含油量为4-5%，高油玉米是指籽粒油份含量较高的玉米， 一般指含 油量大于等于6% (质量百分含量)的玉米。
用核磁共振仪对籽粒进行油份的单粒测定方法采用宋同明描述的方法进行油 份测定(宋同明，脉冲核磁共振仪对作物种子含油量的快速测定，作物学报，1989， 15 (2) : 160-166)。
实施例l、单倍体油份的倍性效应
一、 实验材料
父本玉米孤雌生殖单倍体诱导系Stock6 (Coe E H. A line of maize w他high haploidfrequency[J].AmNat,1959，93:381-382)(中国农业大学)，含油量2. 95%;
母本杂交种农大108 (北京金色农华种业科技有限公司)、杂交种郑单958 (北京德农种业有限公司)、杂交种先玉335 (美国先锋公司)、杂交种ND5598 (黎 亮，C.Friedrich H.Longin，孙文涛等.华北平原夏玉米氮利用效率的遗传参数估 计[J].中国农业大学学报，2007， 12(6) :50-56)(高油品种，含油量约6. 5%)(中 国农业大学)；
二、 诱导单倍体及鉴定
1、 单倍体诱导
实验采用随机区组设计，共设如下4个处理，每个处理中杂交10穗，收获杂 交籽粒并风干。
实验处理l:用农大108作母本，玉米孤雌生殖单倍体诱导系Stock6作父本； 实验处理2:用郑单958作母本，玉米孤雌生殖单倍体诱导系Stock6作父本； 实验处理3:用先玉335作母本，玉米孤雌生殖单倍体诱导系Stock6作父本； 实验处理4:用ND5598作母本，玉米孤雌生殖单倍体诱导系Stock6作父本。
2、 单倍体鉴定
首先，采用颜色标记法进行初步鉴定，即依据杂交当代籽粒胚芽的Navajo标
记来进行鉴别糊粉层为紫色、紫色胚芽的杂交当代籽粒为杂合籽粒；糊粉层为紫 色、无紫色胚芽的杂交当代籽粒为拟单倍体籽粒。然后，将拟单倍体单粒测油后种 植于田间，通过植株形态和育性进一步判断，单倍体表现为植株弱小且高度不育。 由以上两步鉴定出单倍体籽粒。同时也将杂合籽粒(即杂交二倍体籽粒)用核磁共 振仪测定籽粒油份，以备下步的统计分析。 三、含油量统计分析
分别取每个处理诱导中的单倍体和非单倍体籽粒各100粒，统计其含油量。结 果如下
处理l (农大108):单倍体籽粒平均油份为3. 15%,杂交二倍体的籽粒的平均 油份为3. 63%，杂交二倍体籽粒比单倍体籽粒油份增加15. 27%;
处理2 (郑单958):单倍体籽粒的平均油份为3. 01%，杂交二倍体籽粒的平均 油份为3. 53%,杂交二倍体籽粒比单倍体籽粒油份增加17. 47%;
处理3 (先玉335):单倍体籽粒平均油份为2. 28%，杂交二倍体籽粒的平均油 份为2. 57%，杂交二倍体籽粒比单倍体籽粒油份增加12. 75%;
处理4 (ND5598):单倍体籽粒的平均油份为5. 09%，杂交二倍体籽粒的平均 油份为5. 38%，杂交二倍体籽粒比单倍体籽粒油份增加5. 62%。
以上结果表明，单倍体籽粒的油份略低于杂交二倍体籽粒的油份。
实施例2、高油型诱导系油份的花粉直感效应
油份的花粉直感效应指当用高油材料作父本时能提高当代杂交二倍体籽粒的. 油份。
一、 实验材料
父本(即诱导系)高油型诱导系农大高诱l号(刘志增，宋同明.玉米高频 率孤雌生殖单倍体诱导系的选育与鉴定.作物学报，2000， 26 (5) : 570-574)(中 国农业大学)；
母本178、 4F1、昌7-2、丹598、郑58，均来自于中国农业科学院作物品种 资源研究所国家作物种质库。
二、 实验方法
实验设计为完全随机区组设计，共设如下10个处理。
1、单倍体诱导处理每个处理杂交5穗，收获当代杂交籽粒并风干。
处理l:以178为母本，以农大高诱l号为父本； 处理2:以4F1为母本，以农大高诱l号为父本； 处理3:以昌7-2为母本，以农大高诱l号为父本； 处理4:以丹598为母本，以农大高诱l号为父本； 处理5:以郑58为母本，以农大高诱l号为父本。 2、对照处理每个处理自交3穗，收获当代自交籽粒并风干。 处理6: 178自交；处理7: 4F1自交；处理8:昌7-2自交；处理9:丹598 自交；处理10:郑58自交。
分别取每个处理的籽粒100粒，用核磁共振仪测定单籽粒油份。 三、实验结果
处理1收获籽粒的平均油份为5. 45%，处理6收获籽粒的平均油份为3. 77%; 处理1比处理6油份提高1. 68个百分点，提高了 44. 56%;
处理2收获籽粒的平均油份为5. 68%，处理7收获籽粒的平均油份为3. 42%。 处理7比处理2的籽粒平均油份提高了 2. 26个百分点，提高了 66. 08%;
处理3收获籽粒的平均油份为6. 18%，处理8收获籽粒的平均油份为3. 54%， 处理3比处理8的籽粒平均油份提高了 2. 64个百分点，提高了 74. 58%;
处理4收获籽粒的平均油份为4. 10%，处理9收获籽粒的平均油份为2. 51%, 处理4比处理9的籽粒平均油份提高了 1. 59个百分点，提高了 63. 35%;
处理5收获籽粒的平均油份为5. 03%，处理10收获籽粒的平均油份为3. 13%， 处理5比处理10的籽粒平均油份提高了 1. 90个百分点，提高了 60. 70%。
表明，高油型诱导系农大高诱1号具有花粉直感效应。
实施例3、利用油份进行单倍体鉴定
一、 实验材料
母本杂交种郑单958 (北京德农种业有限公司)；父本高油型诱导系农大 高诱l号(刘志增，宋同明.玉米高频率孤雌生殖单倍体诱导系的选育与鉴定作物 学报，2000， 26 (5) : 570-574)(中国农业大学)。
二、 单倍体诱导实验方法
田间种植郑单958，错期种植单倍体诱导系农大高诱1号，用高诱1号作父本 与郑单958杂交15穗，同时郑单958自交2穗，收获杂交当代籽�：妥越坏贝�
粒并风干。共收获5000粒杂交籽粒，500粒自交籽粒。 三、单倍体鉴定
(一) 按照籽粒颜色标记对杂交籽粒进行单倍体鉴定
标准如下胚乳为紫色而胚芽无紫色的为拟单倍体，胚乳紫色而胚芽紫色的为
非单倍体，胚乳为紫色而胚芽淡紫色的为可能单倍体。胚芽颜色判断是根据AATCC 六色九级卡进行的，紫色0-3级为无紫色，紫色4-6级为淡紫色，紫色7-9级为紫 色。胚芽颜色一共就有如上三种情况。将除了紫色(7-9级)以外的颜色都定义为 非紫色。
结果，从5000粒杂当代交籽粒中挑选出非单倍体籽粒4695粒，拟单倍体籽粒 210粒，可能单倍体籽粒95粒。
(二) 以油份作为标记进行单倍体鉴定(图l)
1、 随机抽取籽粒
从5000粒杂交籽粒中随机抽取100粒籽粒，进行单粒测油，并记录数据；从 500粒自交籽粒中随机抽取100粒籽粒，进行单粒测油，并记录数据。
2、 去掉含油量异常的籽粒
含油量异常的自交籽粒为含油量与所有随机抽取的100粒自交籽�：土康钠� 均值相差2个百分点的籽粒；含油量异常的杂交籽粒为含油量与所有随机抽取的 100粒杂交籽�：土康钠骄迪嗖�2个百分点的籽粒。去掉异常籽粒后，杂交籽 粒剩余95粒，自交籽粒剩余100粒。
3、 分别计算随机抽取的杂交籽�：妥越蛔蚜５钠骄岛捅曜疾� 计算公式如下<formula>formula see original document page 13</formula>
Xi为每粒的含油量；N为用于计算的籽粒的数目即去掉异常籽�：蟮淖蚜Ｊ浚� 去掉异常杂交籽�：螅Ｓ嗟脑咏蛔蚜５暮土科骄滴�6. 09%，标准差为 0. 56%;
去掉异常自交籽�：螅Ｓ嗟淖越蛔蚜５暮土科骄滴�3.53%，标准差为 0. 49%。
4、确定A值 (1)计算四个参考值
参考值1=自交籽粒油份平均值+1. 96 X自交籽粒油份标准差；参考值
1=3. 53%+0. 49% X 1. 96=4. 45%;
参考值2=杂交籽粒油份平均值-2. 58X杂交籽粒油份标准差；参考值2=4. 65%; 参考值3=杂交籽粒油份平均值-2. 24X杂交籽粒油份标准差；参考值3=4. 84%; 参考值4=杂交籽粒油份平均值-1. 96X杂交籽粒油份标准差；参考值4=4. 99%。 (2)比较4个参考值，确定A值
① 当参考值2 >参考值1时，A值选择2. 58;
② 当参考值2 <参考值1 <参考值3时，A值选择2. 24;
③ 当参考值3 <参考值1 <参考值4时，A值选择1. 96; 当参考值1 >参考值4时，A值也选择1. 96。
本实验中，比较结果表明，参考值K参考值2，属于第一种情况，因此将A 值确定为2.58。
5、 确定油份鉴定标准值
油份鉴定标准值的计算公式如下油份鉴定标准值:杂交籽粒油份平均值-AX 杂交籽粒油份标准差。
因此，油份鉴定标准值=4. 65%。
6、 油份比较进行鉴定
用核磁共振仪对上述5000粒杂交当代籽粒全部进行油份的单粒测定，然后将 单粒杂交籽粒的含油量与上述油份鉴定标准值(4.65%)进行比较，若籽粒油份小 于或等于标准值，则待测籽粒被认为是单倍体，若籽粒油份大于标准值，则待测籽 粒被认为是非单倍体。
结果表明，5000粒杂交籽粒中，255粒被鉴定为单倍体。 (三)田间种植鉴定
将上述5000粒杂交籽粒测油后，分别进行单粒播种，然后根据植株颜色、株 高、育性三个标准进行鉴定单倍体植株肯定表现为植株无紫色，如果植株紫色的 判断为非单倍体；单倍体植株一般表现相对矮�。绻仓攴浅８叽螅蚺卸衔�
单倍体；育性作为辅助判断的手段，单倍体一般表现为高度不育或部分可育，如果 表现为高度不育且植株绿色、株高相对矮小可判断为单倍体，高度可育且植株高大 或者高度可育且植株紫色都判断为非单倍体。
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结果表明，5000粒杂交籽粒中，245粒被鉴定为单倍体，4755粒被鉴定为非单 倍体。由此可统计出高油诱1号的单倍体诱导率为4.9% (诱导率=(205+40) /5000=4.9%)。
(四) 油份鉴定法和籽粒颜色鉴定法的效率比较
(1) 田间鉴定结果表明，5000粒杂交籽粒中，有245粒为单倍体(即田间鉴 定出的单倍体数为245)。
(2) 油份标记鉴定法结果，5000粒杂交籽粒中，有255粒为单倍体(即油份 法挑选出的单倍体总数为255);经田间鉴定后，被鉴定为单倍体的255粒中，实 际的单倍体数目为231个(即油份法挑选出的单倍体总数中的实际单倍体数为 231)，有24粒本来不是单倍体而被认为是单倍体(即误选数为24)，还有14粒 本来是单倍体，但是本方法没有鉴定出来(即漏选数为14)。
油份标记鉴定方法(简称油份法)的鉴定效率=油份法挑选出的单倍体总数中 的实际单倍体数/田间种植拟单倍体数，其中，田间种植拟单倍体数=田间鉴定出的
单倍体数-油份法漏选数+油份法误选数。
油份标记鉴定方法的鉴定效率=油份法挑选出的单倍体总数中的实际单倍体数 /田间种植拟单倍体数=231/ (245-14+24) =231/255=90.56%。
(3) 籽粒颜色标记鉴定方法，5000粒杂交籽粒中，拟单倍体籽粒210粒，可 能单倍体籽粒95粒。
籽粒颜色标记法的鉴定效率为籽粒颜色标记法的鉴定效率=田间鉴定出的单 倍体数/ (籽粒法鉴定出的拟单倍体籽粒数目+籽粒法鉴定出的可能单倍体籽粒数 目)=245/305=80. 33%。
以上两种鉴定方法的鉴定结果表明，本发明的油份标记鉴定方法的鉴定效率 (90. 56%)比籽粒颜色标记法的鉴定效率(80. 33%)提高了 12. 7%(90. 56%-80. 33%) /80. 33%=12. 7%。
(五) 以油份作为标记的鉴定效率
以田间鉴定结果为参考，对所有测油数据进行整理统计。统计表明，非单倍体 籽粒的油份和单倍体籽粒的油份都符合正态分布。非单倍体籽粒的平均油份为 6.09%，标准差为O. 56%;单倍体籽粒的平均油份为3. 71%,标准差为0. 61%。由此 可见杂交二倍体籽粒的油份大大高于单倍体籽粒的油份。
由于诱导的非单倍体籽�：偷ケ短遄蚜５挠头荻际撬婊植嫉模虼诵枰柚靡桓龊侠淼谋曜祭磁卸鲜欠裎ケ短澹庋饶鼙Ｖげ灰┑艉芏嗟ケ短澹惨� 证不要把很多非单倍体误判为单倍体从而降低鉴定效率。为此提出几个参数漏选 率、误选率、鉴定效率。
漏选率指实际为单倍体而被判断为非单倍体的比例，漏选率=被误判为非单倍 体的单倍体数/实际单倍体总数；
误选率指实际为非单倍体而被判断为单倍体的比例，误选率=被误判为单倍体 的非单倍体数/非单倍体总数；
油份标记鉴定方法(简称油份法)的鉴定效率=油份法挑选出的单倍体总数中 的实际单倍体数/田间种植拟单倍体数，其中，田间种植拟单倍体数=田间鉴定出的
单倍体数-油份法漏选数+油份法误选数。
当鉴定系数A值设为2.58、误选率为0.5%时，误选籽粒数为24粒，油份选择 的标准为4. 65%=6. 09%-2. 58X0. 56>。，此时漏选率为6%，即漏选籽粒数为14粒， 鉴定效率为90. 56%= (245-14) / (245-14+24);
当鉴定系数A值设为2. 24、误选率为1. 25%，误选籽粒数为60粒，油份的鉴 定标准为4.84%=6. 09%-2.24X0.56%，此时漏选率为3%，漏选籽粒为7粒，鉴定效 率为79. 9%= (245-7) / (245-7+60);
当鉴定系数A设为1.96、误选率为2.5%时，即误选籽粒为118粒，油份选择 标准为4.99%=6.09%-1.96X0. 56%，此时漏选率为1%，即漏选率为2粒，鉴定效率 为67%= (245-3) / (245-3+118)。
表明，随着A值的縮小，误选率越来越大，漏选率越来越�。ㄐ试嚼丛叫�。
在实际生产中，可以根据实际需要来选择A值。例如，若待选的籽粒非常多时， 应该尽量减小误选率，以保证鉴定效率，那么此时就应该选择较大的A值，可以将 A值定为2.58;若待选的籽粒不是很多时，误选率的大小对鉴定结果不会产生太大 的影响，此时A值的选择就可以灵活些，再根据其它不同的目的选择不同的值。还 可以根据上述步骤三(二)中所述方法确定A值。
实施例4、本发明油份鉴定方法与籽粒颜色鉴定方法的结合的效果检测(图2) 一、实验材料
母本普通杂交种先玉335 (美国先锋公司)、农大10S (北京金色农华种业
科技有限公司)，高油杂交种ND5598 (黎亮，C.FriedrichH.Longin，孙文涛等.华 北平原夏玉米氮利用效率的遗传参数估计[J].中国农业大学学报， 2007， 12(6) :50-56)(中国农业大学); 父本诱导系农大高诱l号。
二、 单倍体诱导
实验采取随机区组设计，共设如下3个处理。
处理l:以农大108作母本、农大高诱1号作父本进行杂交，共杂交10穗；同 时以农大108自交3穗为对照；收获自交当代和杂交当代籽粒并风干；
处理2:用先玉335作母本、农大高诱1号作父本进行杂交，共杂交10穗；同 时以先玉335自交3穗为对照；收获自交当代和杂交当代籽粒并风干；
处理3:用ND5598作母本、农大高诱1号作父本进行杂交，共杂交10穗；同 时以5598自交3穗为对照；收获自交当代和杂交当代籽粒并风干。
三、 用籽粒颜色标记法和油份标记法相结合进行单倍体鉴定
1、 方法
将每个处理收获的所有杂交籽粒根据籽粒颜色标记进行单倍体初步鉴定，标准
如下胚乳紫色而胚芽紫色的为非单倍体，胚乳为紫色而胚芽非紫色的为拟单倍体。
胚芽颜色判断是根据AATCC六色九级卡进行的，紫色7-9级为紫色，除了紫色(7-9 级)以外的颜色都认为是非紫色。
从每个处理的非单倍体籽粒中各随机抽取50粒，进行单粒含油量测定；再从 每个处理的自交籽粒中各随机抽取50粒，进行单�：土坎舛ǎ蝗缓蟀凑帐凳├�3 中所述的油份标记法确定油份鉴别标准值，再将所有拟单倍体籽粒的含油量分别与 油份鉴别标准值进行比较，以进行进一步鉴定。
将所有籽粒测完油后，再将各处理中的拟单倍体籽粒随机抽取IOO粒分别种植 于田间进行单倍体的田间鉴定。
2、 结果
结果表明，处理1非单倍体籽粒的油份为6. 13%±0. 76%，故杂交油份参考值分 别为4. 16%， 4.43%， 4.64%;自交籽粒的油份为3. 15%±0. 57%，故自交油份参考值 为4. 27%。根据油份鉴定标准的确定原则，油份标准值为4. 43%。
处理2非单倍体籽粒的油份为5. 05%±0. 61%，故杂交油份参考值为3. 48%， 3.68%,3.85%;自交籽粒的油份为2.81%±0.43%，故自交油份参考值为3. 65%。根据
油份鉴定标准的确定原则，油份标准值为3. 68%。
处理3非单倍体籽粒的油份为8. 97%±0. 96%,故杂交油份参考值为6. 49%， 6.81%， 7.09%;自交籽粒的油份为6.31%±0.41%，故自交油份参考值为7. 11%。根 据油份鉴定标准的确定原则，油份标准值为7.09%。
根据油份的鉴定标准将每种处理的拟单倍体籽粒分为两类，I类是油份小于或 等于标准值，即利用油份鉴定法认为是单倍体的籽粒；II类是油份大于标准值，即 利用油份鉴定法认为是非单倍体的籽粒。分别将每种处理的两类籽粒种植于田间进 行单倍体的进一步鉴定。
处理l:油份鉴定结果I类籽粒44粒，有41粒田间表现为单倍体；II类籽
粒有56粒，有2粒田间表现为单倍体；因此利用籽粒颜色标记和油份标记相结合 的方法的单倍体鉴定效率为41/44=93. 2%。
因此利用籽粒颜色鉴定单倍体鉴的效率为(41+2) /100=43%。
处理2: I类籽粒45粒，有43粒田间表现为单倍体；n类籽粒55粒，有8粒 田间表现为单倍体。因此利用籽粒颜色标记和油份标记相结合的方法的单倍体鉴定 效率为43/45=95. 6%;利用籽粒颜色的鉴定效率为(43+8) /100=51%。
处理3: I类籽粒52粒，有44粒田间表现为单倍体；n类籽粒48粒，有6粒 田间表现为单倍体。因此利用籽粒颜色标记和油份标记相结合的方法的单倍体鉴定 效率为44/52=84. 6%;利用籽粒颜色的鉴定效率为(44+6) /100=50%。
由此可见，利用籽粒颜色标记和籽粒油份标记相结合的方法也可以提高单倍体 的鉴定效率。
权利要求
1、一种鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法，包括以下步骤(1)用玉米单倍体诱导系作为父本与母本玉米进行杂交，收获杂交当代籽粒；(2)确定鉴别标准值；(3)检测待测单个所述杂交当代籽粒的含油量，若所述待测单个杂交当代籽粒的含油量≤所述鉴别标准值，则所述待测单个杂交当代籽粒为单倍体；所述鉴别标准值按照如下方法确定随机抽取所述杂交当代籽粒，计算所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值和标准差，再按照如下公式计算所述鉴别标准值所述鉴别标准值＝所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值-A×所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量标准差；1.96≤所述A≤2.58。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述A按照如下方法确定(1) 当参考值K参考值2时，A值为2.58;(2) 当参考值2 <参考值1 <参考值3时，A值为2. 24;(3) 当参考值3<参考值1<参考值4时，A值为1.96;(4) 当参考值4<参考值1时，A值为1.96;所述参考值1=随机抽取的自交当代籽粒的含油量平均值+1. %X随机抽取的自 交当代籽粒的含油量标准差；所述参考值2=所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值-2. 58X所述随机 抽取的杂交当代籽粒的含油量标准差；所述参考值3=所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值-2. 24X所述随机 抽取的杂交当代籽粒的含油量标准差；所述参考值4=所述随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均值_1. 96X所述随机 抽取的杂交当代籽粒的含油量标准差；所述随机抽取的自交当代籽粒按照如下方法获得用所述母本玉米进行自交， 收获自交当代籽粒，随机抽取所述自交当代籽粒。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述随机抽取所述杂交当 代籽粒大于等于50粒；所述随机抽取所述自交当代籽粒大于等于50粒。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述随机抽取的杂交当代籽粒 的含油量平均值和标准差是按照如下方法得到的从所述随机抽取的杂交当代籽粒 中去掉含油量异常的杂交当代籽粒，然后再计算得到所述平均值和标准差；所述含 油量异常的杂交当代籽粒为含油量与所有随机抽取的杂交当代籽粒的含油量平均 值相差2个百分点以上的籽粒；所述随机抽取的自交当代籽粒的含油量平均值和标准差是按照如下方法得到 的从所述随机抽取的自交当代籽粒中去掉含油量异常的自交当代籽粒，然后再计 箅得到所述平均值和标准差；所述含油量异常的自交当代籽粒为含油量与所有随机 抽取的自交当代籽�：土康钠骄迪嗖�2个百分点以上的籽粒。
5、 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述玉米单倍体诱导系的籽�：土看笥诘扔�6% (质量百分含量)。
6、 一种鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法，包括以下步骤(1) 用玉米单倍体诱导系作为父本与母本玉米进行杂交，收获杂交当代籽粒；(2) 鉴定所述杂交当代籽粒的颜色，将胚乳为紫色且胚芽非紫色的杂交当代籽粒鉴定为拟单倍体籽粒，将胚乳为紫色且胚芽为紫色的杂交当代籽粒鉴定为非单倍体籽粒；(3) 确定鉴别标准值；(3)检测待测单个拟单倍体籽粒的含油量，若所述待测单个拟单倍体籽粒的 含油量《所述鉴别标准值，则所述待测单个拟单倍体籽粒为单倍体；所述鉴别标准值按照如下方法确定随机抽取所述非单倍体籽粒，计算所述随 机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值和标准差，再按照如下公式计算所述鉴别标 准值所述鉴别标准值=所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值-AX所述随机 抽取的非单倍体籽粒的含油量标准差；1. 96《所述A《2. 58。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述A按照如下方法确定(1) 当参考值K参考值2时，A值为2.58;(2) 当参考值2 <参考值1 <参考值3时，A值为2. 24;(3) 当参考值3<参考值1<参考值4时，A值为1.96;(4) 当参考值4<参考值1时，A值为1.96;所述参考值1=随机抽取的自交当代籽粒的含油量平均值+1. 96X随机抽取的自 交当代籽粒的含油量标准差； 所述参考值2=所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值-2. 58X所述随机 抽取的拟单倍体籽粒的含油量标准差；所述参考值3=所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值-2. 24X所述随机 抽取的拟单倍体籽粒的含油量标准差；所述参考值4=所述随机抽取的非单倍体籽粒的含油量平均值-1. 96X所述随机 抽取的拟单倍体籽粒的含油量标准差；所述随机抽取的自交当代籽粒按照如下方法获得用所述母本玉米进行自交， 收获自交当代籽粒，随机抽取所述自交当代籽粒。
8、 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述随机抽取所述非单倍 体籽粒大于等于50粒；所述随机抽取所述自交当代籽粒大于等于50粒。
9、 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述随机抽取的非单倍体籽粒 的含油量平均值和标准差是按照如下方法得到的从所述随机抽取的非单倍体籽粒 中去掉含油量异常的杂交当代籽粒，然后再计算得到所述平均值和标准差；所述含油量异常的非单倍体籽粒为含油量与所有随机抽取的拟单倍体籽粒的含油量平均值相差2个百分点以上的籽粒；所述随机抽取的自交当代籽粒的含油量平均值和标准差是按照如下方法得到的从所述随机抽取的自交当代籽粒中去掉含油量异常的自交当代籽粒，然后再计 算得到所述平均值和标准差；所述含油量异常的自交当代籽粒为含油量与所有随机 抽取的自交当代籽�：土康钠骄迪嗖�2个百分点以上的籽粒。
10、 根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述玉米单倍体诱导 系的籽�：土看笥诘扔�6% (质量百分含量)。
全文摘要
本发明公开了鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法。本发明的一种鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法包括以下步骤(1)用玉米单倍体诱导系作为父本与母本玉米进行杂交，收获杂交当代籽粒；(2)确定鉴别标准值；(3)检测待测单个所述杂交当代籽粒的含油量，若所述待测单个杂交当代籽粒的含油量≤所述鉴别标准值，则所述待测单个杂交当代籽粒为单倍体。与传统方法比，本发明鉴别方法具有操作简便、省时省力、鉴定效率高的特点。本发明鉴别方法为单倍体鉴定开辟了新的途径，可以进行大规模操作，为机械化进行单倍体挑选提供了可能，进而为提高育种效率提供了保证。
文档编号G01N33/02GK101377481SQ200810223529
公开日2009年3月4日 申请日期2008年10月6日 优先权日2008年10月6日
发明者陈绍江, 亮 黎 申请人:中国农业大学
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