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专利名称：：检测日本血吸虫抗体的elisa试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物检测领域，尤其涉及检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒，及对应的检测方法和应用。
背景技术：
：日本血吸虫病是一种广泛流行于亚洲的中国、菲律宾等国家的人畜共患寄生虫病，目前针对日本血吸虫病只有一种有效的治疗药物一吡喹酮。由于长期大规模使用这种药物，有可能使血吸虫产生抗药性，血吸虫病的诊断仍然是防治血吸虫病的重要手段。血吸虫的诊断技术是寻找并确定指示血吸虫在机体存在的直接或间接的证据，为血吸虫感染的临床诊断提供依据。通过诊断结果还可以了解疾病的传播情况，有可能在感染的初期及时发现，随即采取相应的措施有效地控制疾病的大规模传播。虽然KatoKatz的粪检方法仍然是日本血吸虫病诊断的金标准，但该方法在中度或低度血吸虫病流行区域的敏感性并不令人满意，漏检率较高。另外，在评估血吸虫病流行情况尤其是连续收集同一个体的粪样时，有些居民对于反复检査显得并不是十分配合。为了解决这一问题，至今逾半个世纪研究者们一直致力于免疫学诊断方法的研究，研制出来多种免疫学诊断方法并做了相关的优化。据估计，中国血吸虫病免疫学诊断方法的数量为全球之最。免疫学诊断因其良好的敏感性、特异性以及实用性等优点，已经成为当前血吸虫病的常用诊断方法。目前常用于日本血吸虫病的免疫诊断方法主要包括间接血凝试验(IHA)、免疫酶联吸附试验(ELISA)、胶体金标记技术等。免疫酶联吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的检测方法，属于一种标记免疫技术，在各种诊断方法中，ELISA是人们研究的最为详细的一种。1971年Engvall和Perlmann用ELISA对IgG进行了定量的测定。严自助和吕再缨首先用ELISA检测日本血吸虫感染家兔的特异性抗体，取得较好的效果(严自助，吕再婴.免疫酶标记技术及应用的初步研究.中华医学杂志，1978,88:470-473)。由于循环抗体在患者接受有效治疗后仍可以长期存在故不能区别现症感染和既往感染，不宜作疗效考核之用，而循环抗原常提示有活虫存在，因此一般认为可通过检测循环抗原来判断现症患者和考核疗效。随着杂交瘤技术的引入，多用特异性较高的单抗检测循环抗原。在我国多种单克隆抗体被用于研究检测血吸虫病患者体内的循环抗原，但对低感染度的受检者，检测循环抗原的灵敏度是尚有待于解决的难题。曾报导的有:McAblIID10(娄文娴，钱宗立，薛纯良，等.抗日本血吸虫单克隆抗体的制备及其在诊断中的应用.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1991,9(4):254-257)、1B10A(严自助，吕再缨，王文，等.单克隆抗体Dot-ELISA检测血吸虫病循环抗原的研究II.中国血吸虫病防治杂志，1990，2(2):39-41)、3D8A(严自助，王文，吕再缨，等.单克隆抗体Dot-ELISA检测日本血吸虫病循环抗原的研究I.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，19卯，8(3):161-163)、8SE4(裘丽姝，薛海筹，陆键，等.抗血吸虫成虫表膜抗原单克隆抗体检测循环抗原及免疫复合物的实验研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1990,8(3):177-179)、NP30(管晓红，仇镇宁，马磊，等.日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的建株及初步鉴定.中国寄生虫病与寄生虫血杂志，1991,9(4):261-264)等，但这些单克隆抗体对于慢性血吸虫病患者的敏感性仍然有待提高。传统制备单克隆的方法是通过杂交瘤技术获得只分泌一种特异性抗体的杂交瘤细胞，ChenDX等人用构建噬菌体展示抗体文库的方法来制备单克隆抗体，为了获得抗血吸虫的一种单链可变片段抗体(sc-Fv)，所构建的文库用ELISA的方法以日本血吸虫成虫代谢抗原来检测，结果显示了sc-Fv在血吸虫诊断中的潜在价值，同时也为大批量制备抗日本血吸虫单克隆抗体提供了一种新的选择。裘丽姝等用多抗和单抗夹心ELISA法检测日本血吸虫病患者血清循环抗原，在受检的150例血吸虫病患者中，敏感性平均为84.7%，40例正常人未出现假阳性反应74例其他寄生虫感染者中，有2例并殖吸虫病患者阳性，其余均未出现交叉反应，结果表明该法是一种较为理想的循环抗原检测方法(裘丽姝，冯正，张永红，等.多克隆抗体与单克隆抗体夹心ELISA法检测日本血吸虫病患者血清循环抗原[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2000,18(2):92-93)。如今ELISA已经发展成为了一种类型众多的免疫学诊断方法。1.斑点画ELISA(Dot画ELISA)Dot-ELISA以硝酸纤维素膜作为载体，吸附微量抗原与受检样品反应加入二抗显色后用肉眼即可判断结果，不需要特殊仪器，比较适合用于现场。中国寄生虫病预防控制所(1986)首先用该法诊断日本血吸虫病，在受检的63名确诊血吸虫病人的阳性率为89%97%，65名健康人均为阴性。Janitschke等报道Dot-ELISA具有较高的特异性和敏感性。国内研究者用抗CCA的单克隆抗体来检测血吸虫病人体内的循环抗原，对急性和慢性血吸虫病患者的敏感性分别为90.6%和83.2%,在非疫区人员检测中没有发现假阳性反应，和其他寄生虫病的交叉反映也很低，并且与绝大多数治愈后一年的患者都呈阴性反应，表明这种方法可以用于疗效期的考核，接下来研究人员进行大量的研究工作和实验，使得Dot-ELISA广泛地应用于现场。沈定文等利用Dot-ELISA检测急性日本血吸虫病患者血清特异性IgG抗体，并用常规ELISA作对照，Dot-ELISA和常规ELISA的阳性率分别为94.0%和97.4%，高于粪检测的阳性率(92.3%)，两法检测结果的符合率为97.2%，结果表明两法在检测的敏感性和特异性方面相似，检测结果无显著差异，而Dot-ELISA操作简便，诊断快速，具有一定的实用诊断价值(沈定文，陈嘉圭，等.Dot-ELISA快速检测日本血吸虫病的实验研究.咸宁医学院学报，2001，15(1):36-38)。2.快速-ELISA(FAST-ELISA)在1986年，Hancock禾口Tsang首先将美国FalconAssayScreeningTest系统(简称FAST系统)引用于动力学酶标测定，用以检测曼氏血吸虫病患者血清中抗曼氏血吸虫成虫微粒抗原，获得满意结果。王秀珍等(王秀珍,黎世涛.快速ELISA诊断血吸虫病的研究及应用.中国血吸虫防治杂志,1990,2(4):31-35)对Fast-ELISA进行了一系列的研究，并研制成为试剂盒，其敏感性为93.88%96.39%，特异性为94%99.22%，Youden指数为0.93，其重复性也达到了90%以上，与其他寄生虫病的交叉反应较低。另外，深圳康百得公司研制的Fast-ELISA试剂盒较为成熟，在全国各大疫区普遍使用。与传统的ELISA相比，Fast-ELISA整个操作时间仅需20-30分钟，无需携带专门仪器，但在疗效考核期上稍有所欠缺。3.生物素一亲和素ELISA(ABC-ELISA)生物素一亲和素酶联免疫吸附试验(avidinbiotincomplexELISA,ABC-ELISA)是一种借助了亲和素和生物素之间极强的亲和力的免疫学诊断方法，既具有免疫反应的特异性，又比常规标记物的灵敏度提高数倍，有助于低抗体水平患者的诊断。研究者用单克隆抗体纯化过的循环阴极抗原(CCA)建立的ABC-ELISA来检测日本血吸虫病患者血清中的特异性抗体，其特异性高达99.0%，在急性患者和慢性患者的敏感性分别可达96.2%和94.1%。其高度的特异性和敏感性是其它ELISA法不可比拟的，整个反应时间仅需1.5h,并且该法可重复，在现场诊断中具有较大的应用价值，国内相关的报道较少(张悟澄，曾庆仁，周金春，等.应用生物素-亲和素系统诊断日本血吸虫病.寄生虫学与寄生虫病杂志，1986,4(1):8-11)。由于ABC-ELISA的标记物昂贵，并且由于其高度灵敏，在提高阳性反应的同时也有可能提高本底反应，目前还没有广泛应用。血吸虫病免疫学诊断方法的灵敏度与特异性，除与选择实验的方法的不同有关外，主要与所用诊断抗原的特性有关。目前常用粗制的成虫与虫卵抗原用于血吸虫病诊断的敏感性虽较高[MottKE，DixonN,CarterCE,etal.collaborativestudyonantigensforimmunodiagnosisofschistosomajaponicuminfection.BullWHO,1987，65(2):233-244]，但由于其常混有宿主抗原及含有其它寄生虫如肝吸虫、肺吸虫的共有抗原成分，易产生交叉应，特异性较低[冯正，裘丽姝，陈名刚等.从平行检测和监测结果分析我国血吸虫病诊断试剂的现状.中国寄生虫学与寄生虫病杂志.1998;16(5):321-325]。此外由于传统抗原多为虫源性，来源较少，耗资大，难以适应大规模査病的需要。随着分子生物学技术的发展，用基因重组方法生产合成抗原用于诊断寄生虫病已成为可能，国内外也有研究证实，使用血吸虫特异性的、纯化的天然或重组的抗原不仅可以提高血吸虫病诊断的敏感性和特异性，而且检测抗某些特异抗原的短程抗体具有一定的疗效考核价值。通过基因工程方法制备抗原，所获抗原纯度高，可以大量生产，易于质量控制。不仅可以解决大量诊断抗原的来源，而且利于检测方法的标准化。SJE16与曼氏血吸虫的SME16基因具有较高的同源性。SME16被认为是虫卵阶段特异的钙结合蛋白，但其在虫卵中的功能尚不清楚。1992年Moser在体外重组表达了曼氏血吸虫虫卵中的一种钙结合蛋白Sml6(SME16)，该蛋白可为免疫兔血清识别，被认为是一种具潜力的诊断抗原。其后Rao的研究发现Sml6具有抗感染的作用，是一种免疫调节蛋白在血吸虫的免疫逃避中起着重要作用，重组表达的Sml6具有强烈的免疫活性可为多克隆的免疫兔血清所识别。值得注意的是，钙结合蛋白是一类重要的参与调节细胞活动的蛋白家族，该类蛋白与耙蛋白结合后可使后者发生构象改变，从而激发一系列生物学反应，如肌肉收縮、神经递质释放、酶激活和细胞生长等[SilvaAC,ReinachFC.Calciumbindinginducesconformationalchangesinmuscleregulatoryproteins.TrendsBiochemSci1991;16(2):53-7]。鉴于SME16在虫卵中的高表达和f丐结合蛋白的重要生理功能，有理由认为，SME16在调节虫卵细胞活动过程中必然发挥着重要而独特的作用。有意思的是SME16与童虫、成虫特异的钙结合蛋白sm20[AvercroftJC,HugginsMC,DunneDW,etal.CharacterisationofSm20，a20-kilodaltoncalcium-bindingproteinofSchistosomamanoni.MolBiochemParasitol1990;38(2):211-9]以及尾呦特异的8-KDaf丐结合蛋白[AmD，GrossmanZ,MarkovicsA，etal.RapidchangesintheexpressionofageneencodingacalciumbindingproteininSchistosomama謂ni.MolBiochemParasitol1989;34(2):167-75]除了具有相似的钙结合位点外，相互之间并不具有明显的同源性。免疫素(Immunophilin)是免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)的受体，属FK506结合蛋白(FKBP)超家族，与热休克结合免疫素p59等结构相似。其具有肽基脯氨酸顺反异构酶(PPIase)活性，是蛋白折叠中重要的伴侣分子，并可与多种胞内受体蛋白结合。存在于血吸虫体内的免疫素可与人体内FKBP12相互作用，在血吸虫感染中起重要作用。由于SJP50和Smp50在核苷酸水平氨基酸水平上的一致性达到了71%，可认为他们很可能也具有相似的功能。Smp50的研究显示P50属FK506结合蛋白(免疫素)超家族，与热休克结合免疫素P59等结构相似，具有PPIase活性，可帮助血吸虫体内的蛋白组装和蛋白折叠，而且能够与热休克蛋白90相互作用，一起构成类固醇激素受体复合物的成分。已知宿主的激素对血吸虫的生长发育有调节作用，但到目前为止，人们尚未直接证据表明血吸虫体内有类固醇激素受体存在。而SJP50和Smp50的存在可能对验证类固醇受体提供一些支持。以前的研究显示，P50可以被曼氏血吸虫可溶性抽提物以及表皮抽提物所识别，说明Smp50可能存在于表皮，且抗P50的抗血清不能识别Hda细胞和大肠杆菌的抽提物，说明来源于不同物种的FKBP虽然在一般结构上有许多相似性，但在全部结构以及序列上的差异足以产生不同的抗体反应。
发明内容本发明要解决的技术问题是，提供一种具有高敏感性和特异性的快速检验日本血吸虫病的试剂盒，以及对应的检测方法和应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供一种检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒，包括己包被日本血吸虫抗原的固相载体、酶标记的日本血吸虫抗原、酶的底物、阴性对照品和阳性对照品、包被液、洗涤液以及酶反应终止液，所述固相载体上包被的日本血吸虫抗原来源于重组的抗原蛋白SJE16或SjP50，所述的重组的抗原蛋白SJE16具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，所述的抗原蛋白SJP50具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。所述的包被液采用碳酸钠和氢氧化钠的混合溶液。优选地，所述的包被液通过1.5g的碳酸钠和2.9g的氢氧化钠混合定容至1000ml时制得。所述的酶标记抗原分为两种，包括1号酶结合物，采用生物素标记的抗人IgG(H+L)(BiotinylatedAnti-HumanIgG(H+L));1号酶结合物的工作溶液配置用样本稀释液按1:10000比例稀释，充分混匀，即配置成1号酶结合物工作溶液，此处需要即用即配；2号酶结合物，采用辣根过氧化物酶链(霉)亲和素(HorseradishPeroxidaseStreptavidin);2号酶结合物的工作溶液配置用样本稀释液按1:5000比例稀释，充分混匀，即配置成2号酶结合物工作溶液，此处亦需要即用即配。所述的酶反应终止液采用硫酸溶液。在本发明的另一个方面，提供一种检测日本血吸虫抗体检测方法，包含如下步骤1、样本稀释用样本稀释液将待检血清按1:100稀释；2、加样反应(1)、样本检测孔每孔分别加已稀释样本血清100ul，每个样本平行检测2孔，同时设阴性、阳性及空白对照各2孑L，取阴性、阳性对照品各100ul分别加入反应孔内，空白对照孔仅加入100ul样本稀释液；(2)、37"C避光反应60分钟后甩去孔内液体，每孔用样本稀释液或洗涤液注满，立即甩去，再注满样本稀释液或洗涤液，静置2分钟，鬼去液体，重复洗涤3次，每次均需静置2分钟，最后一次甩去拍干；3、加酶反应(1)、每孔加1号酶结合物的工作溶液100ul，37。C避光反应60分钟后甩去孔内液体，如上洗涤，拍干；(2)、每孔加2号酶结合物的工作溶液100ul，37。C避光反应30分钟后甩去孔内液体，如上重复5次洗涤，拍干；4、显色反应每孔加配好的底物显色液100ul，室温反应1分30秒，加终止液50ul，混匀，终止反应，立即用酶标仪测读；5、酶标仪测读数将已终止反应的酶标板立即测读，以空白对照调零于490nm读取OD值。在本发明的另一个方面，提供上述ELISA试剂盒在检测血吸虫病中的应用。本发明的检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒及检测方法在防治和治疗日本血吸虫病中有着重要的作用。具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1日本血吸虫病酶联诊断试剂盒的制备1.包被抗原的固相载体固相载体可以选用聚苯乙烯或聚氯乙烯，采用微量滴定板或小试管的形式。将抗原蛋白SJE16或SJP50包被于聚苯乙烯或聚氯乙烯反应孔中。1.溶液配制3.1包被缓冲液的制备将1.5gNaC03和2.9gNaHC03加蒸馏水定容至1000ml。3.2制备酶结合物(酶标记抗原)这里酶标记抗原分为两种，包括1号酶结合物，采用生物素标记的抗人IgG(H+L)BiotinylatedAnti-HumanIgG(H+L)。(VectorLaboratories,CAT:BA-3000)1号酶结合物的工作溶液配置用样本稀释液按l:10000比例稀释，充分混匀，即配置成1号酶结合物工作溶液，此处需要即用即配。2号酶结合物，采用辣根过氧化物酶链(霉)亲和素HorseradishPeroxidaseStreptavidin。(VectorLaboratories,CAT:SA-5004)2号酶结合物的工作溶液配置用样本稀释液按l:5000比例稀释，充分混匀，即配置成2号酶结合物工作溶液，此处亦需要即用即配。3.3酶的底物液(显色液)a.OPD储存液的配置将C6H807'H20(柠檬酸)2.1g，OPD(邻苯二胺)混合，稀释到100ml的蒸馏水定容，并小分量分装，于-20。C环境下冻存。b.将0.1M的Na2HP0442H20重量为7.2g，稀释到200ml蒸馏水定容。在使用时，将a溶液取出融解，并将a、b于a:b^:2的配比混合，再加入3%的过氧水&02G0ul/10ml)即配置成酶的底物液。3.4样本稀释液或洗涤液配置选用如下样品及重量1)Na2HP04*12H2011.6g2)NaH2P04*2H201.2g3)NaCl18g4)Tween-202ml5)Water2000ml配置成为样本稀释液。3.5终止液配置选用100ml蒸馏水，并将12.4ml112804加入蒸馏水中，混合过程需缓慢进行，配置成2M的H2S04终止液。实施例2检测方法及操作程序1.样本稀释用样本稀释液将待检血清按l:100稀释，如将5ul血清中加入500ul稀释液，充分混匀。阴、阳对照品不用稀释。2.加样反应2.1样本检测孔每孔分别加已稀释样本血清100ul，建议每个样本平行检测2孔。同时设阴性、阳性及空白对照各2孔，取阴性、阳性对照品各100ul分别加入反应孔内，空白对照孔仅加入100ul样本稀释液。2.237"C避光反应60分钟后甩去孔内液体，每孔用样本稀释液或洗涤液注满，立即甩去，再注满样本稀释液或洗涤液，静置2分钟，甩去液体，重复洗涤3次，每次均需静置2分钟，最后一次甩去拍干。3.加酶反应3.1每孔加1号酶结合物的工作溶液(即用即配)100ul，37X:避光反应60分钟后甩去孔内液体，如上洗涤，拍干。3.2每孔加2号酶结合物的工作溶液(即用即配)100ul，37。C避光反应30分钟后甩去孔内液体，如上重复5次洗涤，拍干。4.显色反应每孔加配好的底物显色液100ul，室温反应1分30秒。加终止液50ul，混匀，终止反应。立即用酶标仪测读。5.酶标仪测读数将已终止反应的酶标板立即测读，以空白对照调零于490nm读取OD值。这里需要注意的是，本体系显色反应快，在显色、终止及测取读数时，必须每块逐次进行，否则极易造成误差。6.结果判断仪器判断待检孔OD值大于或等于阴性对照2.1倍者为阳性。当阴性对照OD值低于0.05时按0.05计算。7.注意事项(1)在使用排枪加样时，必须避免枪头触及ELISA板孔内壁；(2)试剂盒在2-8"C下保存，其中1号酶结合物(1号液)、底物(3号液)、阴性对照品、阳性对照品需保存于-2(TC，每次取出时先平衡至室温后使用；(3)洗涤时将稀释液或洗涤液注满孔内，每次停放2分钟后甩去孔内液体。禁用自来水等其它水源。实施例3进一步将人体血清作为阴性对照和阳性对照品对本发明的试剂盒进行检验，并与常用的试剂盒进行对比，以得出本试剂盒的检验效果及临床上的应用前景。1.评价重组抗原SjP50和SjE16用于治疗前后疫区人群ELISA诊断的敏感性和疗效采血方法以江西、四川、安徽、湖北四省的疫区人群为采血对象江西、四川、安徽(用于疗效考核的现场评估)(1)选择一定数量的粪检阳性者(A组)和孵化法确认的粪检阴性者(B组)；在治疗前采集第一次血样，同时治疗A组。(2)化疗后3、4(江西、四川)、5(安徽)个月用集卵孵化法复检A组和B组，采集A组孵化阴性者和B组孵化阴性者的第二次血样。湖北(日本血吸虫病诊断试剂盒现场考核)在疫区采集562人份血样，对这562人用改良加藤法进行虫卵计数(二送三检)，对粪检阴性者进行集卵孵化。全部血样重新编号，达到单盲法(湖北)、双盲法(江西、四川、安徽)的要求。2.ELISA检测2.1血吸虫病检测试剂盒采用深圳康百得试剂公司出品的检测试剂合2.2实验室检测诊断抗原SjP50、SjE162个蛋白等比例联合包被ELISA:生物素/亲和素阳性标准以非疫区(北京)正常人的血清为参照。3.统计结果对四个现场采集的血样分别采用单盲法、双盲法进行了ELISA的检测，检测的总样本数为1506例，其中江西424例、四川409例、安徽111例、湖北562例，同时，选用经考核评选后，被推荐用于每年血吸虫病流行区疫情监测的ELISA试剂盒进行同步检测。结果表明，以对重组抗原用于日本血吸虫病诊断试剂盒现场考核为目的(湖北)的血清组ELISA结果联合抗原的敏感性达到97.3%，接近商品试剂盒的敏感性(98.6%)高于单个抗原的敏感性，而SjP50特异性达到31.1%，高于联合抗原(27.4%)和试剂盒(27.2°/。)。以评价重组抗原用于疫区疗效考核为目的的血清(江西组、四川组、安徽组)的检测结果治疗后3个月的转阴率江西组SjE为20.3%、SjP50为15.3。/。、联合抗原为10.9%、试剂盒为0，四川组SjE的为23.5。/。、SjP50为22.4。/。、联合抗原为12%、试剂盒为1.6%;治疗后4个月的转阴率江西组SjE为11.4%、SJP50为18.1%、联合抗原为7.6%、试剂盒为3.8%，四川组SjE为22.9。/。、SjP50为50。/。、联合抗原为3.4%、试剂盒为1.5%;治疗后5个月的转阴率安徽组SjE为3.7%、SJP50为29.2%、联合抗原为39.2%、试剂盒为9.7%。具体统计结果如下表1-4所示。表1.SJE16和SJP50ELISA诊断法在江西疫区疗效考核的盲法评估结果诊断抗原粪检EL1SANo.No.No.阳掛阳性率％化疗后转阴化疗后转阴受检阳性粪阳性(非疫区(非疫区正常率％(非疫区正率％(疫区Kato正常人为对照)人为对照)常人为对照)阴性者为对照)3M4M3M4MSjE16412510382.420.311.427.143.2SjP5016412511088.015.318.151.561.4SjE+SjP5016412511692.810.97.623.438.5商品试剂盒(深圳康16412511692.803.803.8百得)_*表示以同时采集的疫区Kato阴性者为阴参对照，**表示以同时采集的疫区Kato阴性者为阴参照表2SjE和SJP50ELISA诊断法在四川疫区疗效考核的盲法评估结果的评估结果诊断抗原粪检EL1SA!No-No.阳No.No.阳誠检阳性率》/。阴性符合化疗后5M转化疗后5M转受检性阴性阳性(非疫区(非疫区正常率*/*(与阴率％(非疫阴率％(疫区正常人为对人为对照>粪检)区正常人为Kato阴性者为照对照)对照)SjE1611140403587542.53.77.4SJP50111404032肌057.529.258.3SjE16+SjP50m404036卯.O47.539.275.0商品试剂盒m40404010022.59.7(深圳康百得)安敏省血防所iii40403895.017.50提供诊断试剂盒(IHA)18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>康百得)*表示以非疫区正常人为对照，**表示以商品试剂盒提供的阴参为对照，无外源性阴参对照，表示以疫区粪检阴性为对照，其中假阳性率ELISA假阳性数/粪检阴性总数xl00%。4.结果分析目前血吸虫病现场检测通常采用尼龙绢集卵孵化法和改良加藤法(简称粪孵和加藤法)来确诊病人，由于方法敏感性和其他干扰因素的影响，这两种方法的检测结果都不能如实的反映实际的患病人数。而病人在治愈后的很长时间，其抗体滴度仍维持在一个高水平。因此，一种操作简便、敏感性和特异性较高的诊断试剂盒的开发对血吸虫病的防治尤为重要。本发明通过对日木血吸虫功能基因的研究发掘可能的诊断靶分子，利用分子生物学实验室技术，获得了2个具有诊断价值的重组蛋白，并通过对疫区人群的血清学检测，结果表明，重组抗原可作为诊断试剂盒用于现场检测，其敏感性接近成熟试剂盒，特异性略高于试剂盒。而作为疗效考核的诊断检测，其治疗后3、4、5个月的转阴率均高于试剂盒，因此，这2个重组抗原均有进一步开发为诊断试剂盒的前景。序列表〈110〉中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所上海人类基因组研究中心<120〉检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒及其检测方法和应用<130〉NP-08-12557〈160〉2〈210〉1〈211〉145<212〉PRT〈213〉日本血吸虫(6b/i"os謹力p。m'c，)<400>1MSDENRWIAVFNSLDKDGNKLLTRDEIEQCLKSLGVSESFAEKIIKETDL50NKDGKISLDEYLKALRKIPPRDKCSSVERWKEVFQSIDKDNSGKVSAKEL100DEFLKSTGND頂KSCLE匪ATND認KDGELDYAEFLAYVRQTYE145〈210〉2〈211〉425<212〉PRT〈213〉日本血吸虫(5b力j'W。扁a力/o/i，)<400〉2MSETPKQSEEEYLKDFIDLSPSGDRGILKKVVREGYSDIKPCDGDTVIVH50YVGTNFGGEKHGEVFDSSRA認EKFEFTIGKGSVIKAWDIGVAT服LGEV100CELIASPEYAYMDGKSLKFEVELFETMGSDVSRNKDGSIRKSIIKKGRDI150HNPVAGAEATIVFRNLLNLTEETEVTYCVGDPPSNVPDELDQSVRH丽TG200EVSRIVVYKDGHSLTSGDSDKDRIVYELTLKSFEKTKHLSGITSFPERIA250YANTLKEKANNFLKDSKFDSAIELYKRLDDELQYVVANGPTRQRNCLGFT300VAVQLNLALVYLKLCKPRQCIEFCKKVLDNFSDNEKALFRIGQAHLLRKD350HEEAVVYFKGLYPKILTMHLLYNRFKSVRKRLEEPKDIERKKFRHIFERC400KDTGIKLDAQNHEDGVVVNDEKSAL4252权利要求1、一种检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括已包被日本血吸虫抗原的固相载体、酶标记的抗原、酶的底物、阴性对照品和阳性对照品、包被液、洗涤液以及酶反应终止液，所述的固相载体上包被的日本血吸虫抗原来源于重组的抗原蛋白SjE16或SjP50，所述的重组的抗原蛋白SjE16具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列，所述的抗原蛋白SjP50具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。2、根据权利要求1所述的检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的包被液采用碳酸钠和氢氧化钠的混合溶液。3、根据权利要求2所述检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的包被液通过1.5g的碳酸钠和2.9g的氢氧化钠混合定容至1000ml时制得。4、根据权利要求1所述的检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的酶标记抗原分为两种，包括1号酶结合物，采用生物素标记的抗人IgG(H+L);1号酶结合物的工作溶液配置用样本稀释液按l:10000比例稀释，充分混匀，即配置成1号酶结合物工作溶液，此处需要即用即配；2号酶结合物，采用辣根过氧化物酶链(霉)亲和素；2号酶结合物的工作溶液配置用样本稀释液按l:5000比例稀释，充分混匀，即配置成2号酶结合物工作溶液，此处亦需要即用即配。5、根据权利要求1所述的检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的酶反应终止液采用硫酸溶液。6、一种日本血吸虫抗体的检测方法，包含如下步骤步骤l、样本稀释用样本稀释液将待检血清按l:100稀释；步骤2、加样反应(1)样本检测孔每孔分别加已稀释样本血清100ul，每个样本平行检测2L同时设阴性、阳性及空白对照各2孔，取阴性、阳性对照品各100ul分别加入反应孔内，空白对照孔仅加入100ul样本稀释液；(2)37'C避光反应60分钟后甩去孔内液体，每孔用样本稀释液或洗涤液注满，立即甩去，再注满样本稀释液或洗漆液，静置2分钟，甩去液体，重复洗涤3次，每次均需静置2分钟，最后一次甩去拍干；步骤3、加酶反应(1)每孔加1号酶结合物的工作溶液lOOul,37。C避光反应60分钟后鬼去孔内液体，如上洗涤，拍干；(2)每孔加2号酶结合物的工作溶液100ul，37"C避光反应30分钟后甩去孔内液体，如上重复5次洗涤，拍干；步骤4、显色反应每孔加配好的底物显色液100ul，室温反应1分30秒，加终止液50ul，混匀，终止反应，立即用酶标仪测读；步骤5、酶标仪测读数将已终止反应的酶标板立即测读，以空白对照调零于490nm读取OD值。7、一种如权利要求1所述的ELISA试剂盒在检测血吸虫病中的应用。全文摘要本发明公开了一种检测日本血吸虫抗体的ELISA试剂盒，及对应的检测方法和应用。本发明的ELISA试剂盒的抗原采用重组的日本血吸虫抗原SjE16或抗原SjP50。本发明的检测方法具有高敏感性和特异性，并能快速检验出日本血吸虫病，本发明的ELISA试剂盒在血吸虫病防治和诊断中拥有广阔的应用前景。文档编号G01N33/535GK101685097SQ200810043808公开日2010年3月31日申请日期2008年9月26日优先权日2008年9月26日发明者正冯,斌徐,王志勤,薇胡,韩泽广申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所;上海人类基因组研究中心