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一种用斑马鱼对药物功效的评价方法
【专利摘要】本发明公开了一种为斑马鱼应用于中药安全性评价和鱼类生理学的研究提供基础资料的药物功效评价方法，包括如下步骤，1)、试验材料的准备：a）、药品，b）、实验仪器，c）、实验鱼驯养；2)、试验方法：a）、设置浓度梯度，b）、排除消化过程差异，c）、药物处理，d）、实验鱼恢复平静，e）、记录窒息时间的准备，f）、记录窒息时间，g）、实验鱼的乳酸的测定，h）、计算实验鱼体内乳酸的含量，i）、实验鱼的乳酸脱氢酶的测定，j）、统计分析。通过本发明，证明斑马鱼应用于中药药物筛选安全性评价是可行的，本研究可为斑马鱼应用于中药安全性评价和鱼类生理学的研究提供基础资料。
【专利说明】一种用斑马鱼对药物功效的评价方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种药物功效的评价方法，特别是涉及一种用斑马鱼对药物功效的评价方法。

【背景技术】
[0002]红景天系蔷薇目景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhod1la L.),多年生草本或亚灌木野生植物，因花、根、茎之浸液均成红色而得名。主要生长于高寒、缺氧、狂风、紫外线照射强、昼夜温差大、海拔2000?5000m的岩石缝隙和高山砾石中，恶劣的生存环境使红景天从遗传上具备了特殊的适应性物质，是一种珍稀的药用植物。
[0003]在药物的开发过程中，临床应用之前的药物药效筛选和安全性评价是一个重要的环节。目前药物非临床安全性评价研究主要包括体内(动物)实验和体外(细胞、分子)实验。体内毒性试验周期长，药物用量大，操作难度大，不利于少量药物的快速毒性筛选。而体外细胞实验不能精确地模拟药物在体内的真实过程，实验结果往往难以在体内得到重现。要解决新药开发过程中的瓶颈问题，就要建立经济、快速、有效的毒性评价动物模型，进行体外大规模筛选，建立哺乳动物鉴定之前的中间验证体系。
[0004]斑马鱼由于其自身的特点，可克服体外细胞和化学筛选模型的局限性，在短期内进行大规模药物筛选，观察药物对多种复杂生理过程的效果,从整体上直观地评估药物的治疗效果、不良反应及毒副作用；能够更便捷地获得实验数据，明显缩短研发周期，降低研发成本，加快新药开发过程。


【发明内容】

[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种为斑马鱼应用于中药安全性评价和鱼类生理学的研究提供基础资料的药物功效评价方法。
[0006]为实现上述目的，本发明提供了一种用斑马鱼对药物功效的评价方法，其包括如下步骤:
1)、试验材料的准备:
a)、药品:由三普药业股份有限公司销售三普红景天胶囊。由南京建成生物工程研究所销售的乳酸测定试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒；
b)、实验仪器:可见光分光光度计，酶标仪；
C)、实验用鱼驯养:以购自广东的斑马鱼作为实验鱼，首先进行为期4周的驯养实验，以小型颗粒饲料为饵料，培养在水温25°C，溶氧大于6.5mg/L，光制为12:12的环境中；
2)、试验方法:
a)、设置浓度梯度，设置6个处理实验的红景天浓度梯度各为Omg/L、0.01mg/L、
0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L和0.16mg/L，各处理实验的实验鱼数量为20条；
b)、排除消化过程差异，实验前，斑马鱼禁食24h以排除消化过程差异，然后随机选取实验鱼分配到各处理组； C)、药物处理，红景天水溶液置于IL玻璃烧杯中，然后于恒温25°C水浴控制温度，采用小型气泵充氧，往水体中放入实验鱼后立即以塑料筛网罩住烧杯杯口 ；
d)、实验鱼恢复平静，药物处理结束后，小心移出斑马鱼，移出后的斑马鱼逐个放入预先注入恒温养殖水的25mL小口玻璃瓶中，充满水后，用塑料筛网罩住玻璃瓶口，放入恒温水浴，适应lOmin，使实验鱼恢复平静；
e)、记录窒息时间的准备，用小塑料管向玻璃瓶内注入饱和溶氧养殖用水，1s内使瓶内的水全部被换出后，盖紧橡胶塞，并以秒表开始计时；
f)、记录窒息时间，直至实验鱼身体失去平衡发生侧翻时，记录时间，为窒息时间；为消除个体大小对实验结果的影响，对体重差异进行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m),其中ts为校正后时间，ti为校正前时间为体重；将各浓度梯度试验校正后的时间ts与对应浓度关系制作成标准曲线；
g)、实验鱼的乳酸的测定，把用于测定缺氧窒息的实验鱼在实验结束后，在低于4摄氏度的环境中制成生理盐水匀浆液，再将此生理盐水匀浆液稀释10倍后离心取上清液，再将此上清液稀释5倍，再用乳酸测试盒按步骤加样，最后在530nm波长时用可见光分光光度计测其吸光值，并制作计算乳酸含量的标准曲线；
h)、计算实验鱼体内乳酸的含量，采用以下方法计算实验鱼体内乳酸的含量:
组织中乳酸的含量=c*50/1000
其中，c为通过乳酸含量的标准曲线计算得出的匀浆稀释液乳酸浓度，计算后绘制出各浓度试验的乳酸含量标准曲线图。
[0007]i)、实验鱼的乳酸脱氢酶的测定，上步操作制得的斑马鱼生理盐水匀浆液，离心取上清液，稀释20倍，用乳酸脱氢酶测定试剂盒按步骤加样，反应15min，用酶标仪在450nm波长时测其吸光度；并通过换算出每个浓度试验中乳酸脱氢酶的浓度，制作各个浓度试验中乳酸脱氢酶浓度的标准曲线。
[0008]j)、统计分析，采用单因素方差分析及多重比较分析不同浓度处理造成的差异。
[0009]优选的，所述的实验鱼平均体重在0.2g左右。
[0010]本发明的有益效果是:通过本发明，证明斑马鱼应用于中药药物筛选安全性评价是可行的，本研究可为斑马鱼应用于中药安全性评价和鱼类生理学的研究提供基础资料。

【专利附图】

【附图说明】
[0011]图1为本发明一一种用斑马鱼对药物功效的评价方法的不同浓度红景天溶液处理5天对斑马鱼窒息时间的影响曲线图。
[0012]图2为本发明一一种用斑马鱼对药物功效的评价方法的不同浓度红景天溶液处理5天对斑马鱼缺氧窒息后体内乳酸含量的标准曲线图。
[0013]图3为本发明一一种用斑马鱼对药物功效的评价方法的不同浓度红景天溶液处理5天对斑马鱼缺氧窒息后体内乳酸含量的影响曲线图。
[0014]图4为本发明一一种用斑马鱼对药物功效的评价方法的不同浓度红景天溶液处理5天对斑马鱼缺氧窒息后体内乳酸脱氢酶活性的影响曲线图。

【具体实施方式】
[0015]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
一种用斑马鱼对药物功效的评价方法，包括如下步骤:
一、试验材料的准备:
1、药品:由三普药业股份有限公司销售三普红景天胶囊。由南京建成生物工程研究所销售的乳酸测定试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒。
[0016]2、实验仪器:可见光分光光度计,酶标仪。
[0017]3、实验用鱼:以购自广东的斑马鱼作为实验鱼，首先进行为期4周的驯养实验，以江门市蓬江区海豚水族有限公司生产的海豚热带鱼粮微颗粒为饵料，培养在水温25°C，溶氧大于6.5mg/L,光制为12:12的环境中。
[0018]二、试验方法:
1、设置6个处理实验的红景天浓度梯度各为Omg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、
0.08mg/L和0.16mg/L，各处理实验的实验鱼数量为20条；
2、实验前，斑马鱼禁食24h以排除消化过程差异，然后随机选取实验鱼(平均体重0.2g左右)分配到各处理组；
3、红景天水溶液置于IL玻璃烧杯中，然后于恒温25°C水浴控制温度，采用小型气泵充氧，往水体中放入实验鱼后立即以塑料筛网罩住烧杯杯口 ；
4、药物处理结束后，小心移出斑马鱼，移出后的斑马鱼逐个放入预先注入恒温养殖水的25mL小口玻璃瓶中，充满水后，用塑料筛网罩住玻璃瓶口，放入恒温水浴，适应lOmin，使实验鱼恢复平静；
5、用小塑料管向玻璃瓶内注入饱和溶氧养殖用水，1s内使瓶内的水全部被换出后,盖紧橡胶塞，并以秒表开始计时；
6、直至实验鱼身体失去平衡发生侧翻时，记录时间，为窒息时间；为消除个体大小对实验结果的影响，对体重差异进行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m)，其中ts为校正后时间(min)，ti为校正前时间(min)，m为体重(g);将各浓度梯度试验校正后的时间ts与对应浓度关系制作成标准曲线——图1。
[0019]7、斑马鱼的乳酸和乳酸脱氢酶的测定，把用于测定缺氧窒息的实验鱼在实验结束后，在低于4摄氏度的环境中制成生理盐水匀浆液，再将此生理盐水匀浆液稀释10倍后离心取上清液，再将此上清液稀释5倍，再用乳酸测试盒按步骤加样(具体步骤按照南京建成生物工程研究所的乳酸测试盒使用说明书)，最后在530nm波长时用可见光分光光度计测其吸光值，并制作计算乳酸含量的标准曲线——图2。
[0020]8、计算斑马鱼体内乳酸的含量:
采用以下方法计算斑马鱼体内乳酸的含量:
组织中乳酸的含量=c*50/1000
其中，c为通过图2标准曲线计算得出的匀浆稀释液乳酸浓度(mmol/L)，50为稀释倍数(稀释为体重的50倍，单位为g);并绘制出各浓度试验的乳酸含量标准曲线图——图3。
[0021]9、上步操作制得的斑马鱼生理盐水匀浆液，离心取上清液，稀释20倍，用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒按步骤加样，反应15min，用酶标仪在450nm波长时测其吸光度；并通过换算出每个浓度试验中乳酸脱氢酶(LDH)的浓度，制作标准曲线——图4。具体的换算方法需参考查阅南京建成生物工程研究所的A020乳酸脱氢酶(LDH)测试盒说明书中的分析方法。
[0022]10、统计分析，数据采用Excel 2003进行运算，同时采用SPSS 13.0进行统计分析。采用单因素方差分析及多重比较(LSD)分析不同浓度处理造成的差异。
[0023]结果:
统计分析红景天药物处理5天，药物浓度与斑马鱼窒息所用时间的关系，
由图1可知，红景天药液处理5天之后，斑马鱼的窒息时间随浓度增高呈现明显的先增后降的趋势，当处理浓度为0.02mg/L时达到最大值，与对照组差异性显著。当处理浓度为0.04mg/L时,窒息时间最短,但与对照组差异不显著。当处理浓度为0.08mg/L、0.16mg/L时，窒息时间与对照组也没有明显差异。
[0024]测定了缺氧窒息实验后的斑马鱼体内乳酸的含量和乳酸脱氢酶(LDH)的活性，分析红景天药物处理浓度与斑马鱼体内乳酸的积累量、乳酸脱氢酶(LDH)活性的关系，得到图
3、图4所示的结果:
由图3可知，用不同浓度的红景天药液处理5天，缺氧窒息后，随着药物处理浓度的增大，斑马鱼体内乳酸含量呈现先增高，后降低，再增高的变化趋势。在处理浓度为0.01mg/L、
0.08mg/L时明显地高于对照组，在处理浓度为0.04mg/L时低于对照组，乳酸含量的变化出现了两个峰值，而其它浓度的处理组较对照组乳酸含量的变化不显著。
[0025]由图4可知，用不同浓度的红景天药液处理5天，缺氧窒息后，随着药物处理浓度的增大，斑马鱼体内乳酸脱氢酶(LDH)的活性呈现降低的趋势，各药物处理组之间差异不显著，当药物浓度大于0.02mg/L时，斑马鱼体内乳酸脱氢酶活性显著低于对照组。
[0026]结论:
本发明中，随药物处理浓度增高，斑马鱼耐低氧能力先迅速增高，然后降低，二者关系呈钟形曲线。低浓度处理后，斑马鱼耐低氧能力增强，提示红景天对鱼类有抗缺氧的效果，采用斑马鱼为实验动物进行药效评价应当可行。
[0027]本发明研究了缺氧窒息后斑马鱼体内乳酸含量和乳酸脱氢酶(LDH)的活性，当浓度为0.04mg/L时，乳酸含量显著低于对照组，这说明红景天在此浓度时起到了降低乳酸含量的作用。本实验中LDH活性随着浓度的增大而降低，说明红景天可能通过降低LDH活力从而减少乳酸的生成，发挥抗疲劳的作用。
[0028]中药药物抗疲劳、抗缺氧药性研究和安全性评价目前所用的实验动物一般是小鼠，通过本实验的研究，说明斑马鱼应用于中药药物筛选安全性评价是可行的，本方法可为斑马鱼应用于中药安全性评价和鱼类生理学的研究提供基础资料。
[0029]南京建成生物工程研究所的A020乳酸脱氢酶(LDH)测试盒说明书中的分析方法:速率A ;主波长:340nm ;副波长:405nm ;样品量:8.0ul ；R-1:320ul, R-2:80ul ;校准方式:K因子；反应方向:上升；测定温度:37°C。
[0030]样品与R-1混匀后反应5分钟，加入R-2混合后延迟53秒，测定104秒。
[0031]计算:

Δ ABS/minXVtX1000
LDH(U/L)=-

6.22XVsXd Δ ABS/min =每分钟平均吸光度变化； Vt =总反应体积(ml)；
1000 = U/ml到U/L的转换系数；
6.22 = NADH的毫摩尔吸光系数；
Vs =标本体积(ml)； d =比色杯光径(cm)。
[0032]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本【技术领域】中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【权利要求】
1.一种用斑马鱼对药物功效的评价方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)、试验材料的准备: a)、药品:由三普药业股份有限公司销售三普红景天胶囊；由南京建成生物工程研究所销售的乳酸测定试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒； b)、实验仪器:可见光分光光度计，酶标仪； C)、实验用鱼驯养:以购自广东的斑马鱼作为实验鱼，首先进行为期4周的驯养实验，以小型颗粒饲料为饵料，培养在水温25°C，溶氧大于6.5mg/L，光制为12:12的环境中； 2)、试验方法: a)、设置浓度梯度，设置6个处理实验的红景天浓度梯度各为Omg/L、0.0lmg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L和0.16mg/L，各处理实验的实验鱼数量为20条； b)、排除消化过程差异，实验前，斑马鱼禁食24h以排除消化过程差异，然后随机选取实验鱼分配到各处理组； C)、药物处理，红景天水溶液置于IL玻璃烧杯中，然后于恒温25°C水浴控制温度，采用小型气泵充氧，往水体中放入实验鱼后立即以塑料筛网罩住烧杯杯口 ； d)、实验鱼恢复平静，药物处理结束后，小心移出斑马鱼，移出后的斑马鱼逐个放入预先注入恒温养殖水的25mL小口玻璃瓶中，充满水后，用塑料筛网罩住玻璃瓶口，放入恒温水浴，适应lOmin，使实验鱼恢复平静； e)、记录窒息时间的准备，用小塑料管向玻璃瓶内注入饱和溶氧养殖用水，1s内使瓶内的水全部被换出后，盖紧橡胶塞，并以秒表开始计时； f)、记录窒息时间，直至实验鱼身体失去平衡发生侧翻时，记录时间，为窒息时间；为消除个体大小对实验结果的影响，对体重差异进行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m),其中ts为校正后时间，ti为校正前时间为体重；将各浓度梯度试验校正后的时间ts与对应浓度关系制作成标准曲线； g)、实验鱼的乳酸的测定，把用于测定缺氧窒息的实验鱼在实验结束后，在低于4摄氏度的环境中制成生理盐水匀浆液，再将此生理盐水匀浆液稀释10倍后离心取上清液，再将此上清液稀释5倍，再用乳酸测试盒按步骤加样，最后在530nm波长时用可见光分光光度计测其吸光值，并制作计算乳酸含量的标准曲线； h)、计算实验鱼体内乳酸的含量，采用以下方法计算实验鱼体内乳酸的含量: 组织中乳酸的含量=c*50/1000 其中，c为通过乳酸含量的标准曲线计算得出的匀浆稀释液乳酸浓度，计算后绘制出各浓度试验的乳酸含量标准曲线图； i)、实验鱼的乳酸脱氢酶的测定，上步操作制得的斑马鱼生理盐水匀浆液，离心取上清液，稀释20倍，用乳酸脱氢酶测定试剂盒按步骤加样，反应15min，用酶标仪在450nm波长时测其吸光度；并通过换算出每个浓度试验中乳酸脱氢酶的浓度，制作各个浓度试验中乳酸脱氢酶浓度的标准曲线； j)、统计分析，采用单因素方差分析及多重比较分析不同浓度处理造成的差异。
2.如权利要求1所述的一种用斑马鱼对药物功效的评价方法，其特征在于，所述的实验鱼平均体重在0.2g左右。
【文档编号】G01N33/15GK104165975SQ201410300100
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】范能全, 罗毅平, 彭兰, 林艳华 申请人:重庆市食品药品检验所