专利名称：检测诱导多能干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种检测诱导多能干细胞 的方法。
背景技术：
量子点结合抗体、抗原或DNA等物质后所构成的结合体被称为生物探针或荧光探 针。但是这类荧光探针仅只能对所标记的生物分子作定性或定量分析，不具备对欲作定性 或定量分析的生物分子进行采集或分离的功能。磁性纳米粒子因其具有良好的超顺磁性和 表面易功能化等特点而十分引人注意，它可以复合抗体、抗原或免疫球蛋白。在体内与欲分 离的目标物相结合，在磁场的作用下进行免疫磁分离，但本身不具备标记的功能。标记和分 离已经成为现代生物医学工程领域中的重要工作，如果标记和分离的工作能一步完成，必 将极大地推动生物科学技术的发展。因此，集磁性能和发光性能于一身的复合型纳米粒子 以其良好的应用前景备受关注。生物芯片技术在最近十几年发展迅速，已经广泛应用于基 因表达、功能基因组、蛋白质组等前沿领域。尤其在近几年，所涉及的领域从研究型场合迅 速扩展至应用型场合，在临床检验、疾病诊断、药物筛选等方面发挥了越来越重要的作用。 微阵列是一种可用于生物学研究的大规模、高通量的重要分析技术。近年来，蛋白质微阵列 技术已经在蛋白质组的功能研究、疾病诊断以及药物开发中显示出巨大的潜力。影响蛋白 质微阵列分析性能的主要因素包括蛋白质分子识别的特异性、蛋白质的固定化技术以及检 测方法等，其中蛋白质的固定和检测方法是开展蛋白质微阵列研究的最基本的技术。结合 临床上常用的酶联免疫技术成功开发了芯片技术和ELISA技术的结晶——微阵列酶联免疫 技术，该技术在保持了 ELISA方法学的成熟、方便、自动化程度高的基础上，又具有芯片技 术的高通量、低成本、高平行、微型化等特点。临床诊断上，可同时对单个样本进行多种疾病 指标的检测；样品用量�。涣槊舳群涂煽啃愿撸患觳獬杀镜停远潭雀撸焕诖蠊婺� 推广应用。在酶联免疫吸附试验技术和微阵列技术的基础上，终于形成新一代检测技术体 系一微阵列酶联免疫技术，建立了蛋白芯片技术平台。蛋白芯片检测技术在快速检测、多项 目联合检测上具有无可比拟的优势，它将引领体外诊断试剂行业的技术革命。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)是利用载体将 不同转录因子转入分化的体细胞中，使其重编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类型。近年 来，ips细胞成为生命科学领域的研究热点，并且ips细胞的突破性进展为许多疑难病的基 础医学研究以及临床应用方面带了巨大的希望，在干细胞研究领域、表观遗传学研究以及 生物医学研究领域都引起了强烈的反响。ips细胞的鉴定必须符合干细胞多能性的条件，具 有强大的自我更新能力和分化潜能，目前鉴定ips细胞的多能性手段有形态学标准、标志 分子的表达、生长特性、发育潜能、表观遗传学特征。对ips细胞确定可以通过标志分子的 表达来进行分析，目前现有的成熟手段是通过免疫荧光技术进行表面抗原的鉴定，有直接 染色法和间接染色法(1)直接染色法是将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经 一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。直接染色法的优点是特异性高，操作 简便，比较快速。⑵间接染色法是先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进 行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体(第二抗 体)与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光 素标记的抗抗体结合，形成抗原_抗体_抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧 光显微镜下可见荧光。间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查未知抗体；用一种 标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗 体，敏感性高。经对现有技术的文献检索发现Yamanaka等在《cell》(细胞)杂志2007年 第 131 期的 861 872 页上发表“Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult HumanFibroblasts by Defined Factors”(通过特定的转录因子诱导人成纤维细胞重组为 多能干细胞的研究)，该文中提出通过免疫荧光技术对ips细胞表面特异性标记物进行鉴 定，其不足之处在于由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较 难，操作繁琐，对照较多，时间长；带荧光染料的抗体成本高；有机荧光染料荧光强度低；短 时间内荧光会淬灭，有机荧光染料毒性大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测诱导多能干细胞的方法。 本发明的方法可实现同时对单个样本进行多种特异性分子的检测；样品用量�。涣槊舳群� 特异性高；检测成本低；操作简单，自动化程度高；检测速度快。本发明涉及一种检测诱导多能干细胞的方法，包括如下步骤步骤一，采用常规方法制备磁性纳米粒子和水溶性量子点；步骤二，取正硅酸四乙酯(TE0S)水解生成二氧化硅微球，采用反相微乳液法制备 荧光磁性纳米硅球；步骤三，表面改性荧光磁性纳米硅球，之后偶联抗体，得偶联抗体的荧光磁性纳米 硅球；步骤四，以内参蛋白为阳性对照，牛血清白蛋白(BSA)为阴性对照，利用抗诱导多 能干细胞表面表达的特异性标记物的抗体制备微阵列芯片；步骤五，利用步骤四的微阵列芯片检测样品，之后用步骤三所得的偶联抗体的荧 光磁性纳米硅球对微阵列芯片进行荧光标记，得检测结果。步骤一中，所述制备磁性纳米粒子具体为采用共沉淀法制备，将Fe2+与Fe3+按摩尔 比为1 2混合，之后加入1. 5M的NaOH的水溶液，剧烈搅拌，氮气保护、80°C下反应lh，磁 分离，得磁性纳米粒子。步骤一中，所述水溶性量子点为CdTe量子点。所述CdTe量子点的制备方法具体为在Cd2+盐的水溶液中加入巯基乙酸，用1M的 NaOH的水溶液调节pH为11，氮气保护、磁力搅拌下加入NaHTe的水溶液，100°C下回流1 24h，得CdTe量子点。步骤二中，所述反相微乳液法具体为将磁性纳米粒子与水溶性量子点混合，加 入到环己烷的油相微乳溶液中，剧烈搅拌，得油包水微乳反应体系，用体积分数为27%的NH3*H20调节pH值为碱性，然后加入正硅酸四乙酯(TE0S)水解反应24h，磁分离，得荧光磁 性纳米粒子硅球。步骤三中，所述表面改性具体为，将荧光磁性纳米粒子硅球分散在乙醇中，80°C油 浴下加入硅烷偶联剂，搅拌反应3h，磁分离，得到氨基化的荧光磁性纳米硅球；之后将氨基 化的荧光磁性纳米硅球分散在DMF溶液中，加入过量的丁二酸酐，25°C下搅拌反应24h，磁 分离，得改性后的荧光磁性纳米硅球。所述硅烷偶联剂为氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)。步骤四中，所述制备微阵列芯片具体为将抗诱导多能干细胞表面表达的特异性 标记物的抗体喷到硝酸纤维素膜上4X4微阵列结构的检测区，同时以内参蛋白作为阳性 对照区，BSA作为阴性对照，以中性蛋白封闭，干燥，然后将固化有检测区和对照区的硝酸纤 维素膜组装在高分子吸水纸上，最后组装在塑料外壳内放置，即得。步骤五中，所述得检测结果具体为先用PBST润湿芯片，再加入待测样品，之后用 PBST洗涤膜，去除未连接的抗原，再加入偶联抗体的荧光磁性纳米硅球，再次用PBST洗涤 膜，置于紫外灯下观察，如果待测样品中含有被硝酸纤维素膜上的相应抗体捕获的抗原，则 会在紫外照射下可以形成肉眼可分辨的彩色检测区。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果荧光磁性纳米硅球是一种复合型 纳米材料，使用其荧光性能解决了传统有机荧光染料容易淬灭和荧光强度低的问题，其磁 性能可以分离纯化未偶联的抗ips细胞表面表达的特异性标记物抗体以避免对样本检测 产生干扰；同时具有良好的生物安全性；一个待检样本可以在一个芯片上同时进行4种特 异性标记物的检测，并且同时具备阴性和阳性对照区域，因此可实现同时对单个样本进行 多种特异性分子的检测，操作简单，快速检测，省时省力；本检测方法样品用量小，检测成本 低，能够富集样品中的微量待检物，检出率和特异性均高于传统的免疫荧光技术；本发明的 检测方法参加反应的环节较少，受干扰的可能性也较�。虼司哂懈叩牧槊舳龋晃⒄罅行酒� 制备工艺简单，经济实惠。
图1为实施例1中的微阵列生物芯片结构示意图；图2为实施例2中的微阵列生物芯片结构示意图。
具体实施例方式以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的 条件。实施例1ips细胞表面表达特异性oct4，sox2, nanog，AP抗原的检测检测方法分析oct4，sox2, nanog, AP抗原在ips细胞中的表达，选用人的oct4， sox2, nanog, AP单克隆抗体作为检测手段，抗BSA单抗作为阴性对照，抗beta-tubulin单 抗作为阳性对照。
步骤一，称取1. 35g(0. 005mol)FeCl3 6H20 和 0. 69(0. 0025mol) FeS04 7H20 溶于 50ml的去离子水中，在氮气保护、80°C的环境下加入20mll. 5M的NaOH，剧烈搅拌反应lh 后，用磁分离的方法分离出黑色沉淀，并用去离子是水洗涤3次，得磁性纳米粒子，之后将 磁性纳米粒子分散在20ml去离子水中形成浓度为8mg/ml溶液；步骤二，取 1. 1417g(5mmol)CdCl2 2. 5H20 溶解 110ml 水中，再加入 1. 1053g(12mmol)TGA搅拌均勻，用lMNaOH调节pH到11，再用氮气保护，加入2. 5mmol新制 备的NaHTe水溶液，将此反应体系加热到100°C，回流4h，得到荧光发射波长为570nm，浓度 为4mg/ml的表面带有羧基的黄色CdTe水溶性量子点；步骤三，量取50ml的环己烷，10ml的Triton-100，8ml的正己醇，室温下剧烈搅拌 反应30min ；取步骤二制备的CdTe水溶性量子点4ml，乙醇8ml，按1 2体积比沉淀量子 点，然后用1ml磁性纳米粒子水溶液重悬沉淀后的量子点，并逐滴加入到已形成微乳结构 的油相体系中，然后再剧烈搅拌30min，加入体积分数为27% NH3 H20150ul调节反应体系 PH为碱性，然后加入500ul的TE0S搅拌反应24h，通过磁分离的方法收集样品，并分别用无 水乙醇和去离子水各洗涤3次，最后用5ml的去离子水重悬，形成水溶性的荧光磁性纳米硅 球溶液，磁分离，得荧光磁性纳米硅球，之后重悬于100ml乙醇溶液中，并添加2ml的APTS， 80°C的油浴中搅拌反应3h，磁分离收集氨基功能化的荧光磁性纳米硅球，再将氨基化的荧 光磁性纳米硅球分散在lOOmlDMF溶液中，加入3mg 丁二酸酐室温搅拌反应24h，利用磁分 离的方法分离得到羧基化的荧光磁性纳米硅球，最后用DMF洗涤3次，并重悬于3ml的无菌 PBS(pH7. 4)中待用；步骤四，取lml的羧基化的荧光磁性纳米硅球加入2.5ml磷酸盐缓冲溶液 (pH6. 0)，再加入125mg的EDC和125mgNHS反应30min活化羧基，最后加入300ug的oct4， sox2, nanog, AP单抗避光摇勻反应2h，然后4°C下过夜；步骤五，以pH 7.60.01!1101/1的磷酸盐缓冲液将1 8细胞表达的特异性标记物 (oct4，sox2, nanog, AP)相对应的抗体稀释为lmg/ml，如图1所示，以Bio-Dot点样仪喷到 0. 45um的硝酸纤维素膜上，通过计算机控制高速每针喷射InL的抗体溶液到微阵列为4X4 结构的硝酸纤维素膜上，同时以抗beta-tubulin抗体为阳性对照喷在4X4微阵列结构的 左上和右下对角方位，以抗BSA抗体为阴性对照喷在4X4微阵列结构的右上和左下对角方 位，然后用含有10mg/ml的PBS封闭、37°C干燥，最后将硝酸纤维素膜组装在高分子吸水纸 上并放入塑料外壳内并放置在4°C待用；步骤六，以含0. 05% Tween20的PBS缓冲液(PBST) 100ul润湿微阵列芯片，待PBST 渗透入硝酸纤维素膜后，加入200ul待检样品，待渗透入膜内后，加PBST洗涤3次去除未 连接抗原，再分别加入200ul的连接有oct4，sox2, nanog, AP抗体的荧光磁性纳米硅球，用 PBST溶液洗涤膜三遍，然后用紫外手提灯照射微阵列芯片，测试结果可以肉眼分辨出来， 如待检样品中含有被硝酸纤维素膜上的抗体捕获的oct4，sox2, nanog, AP抗原，则会在微 阵列芯片上出现肉眼可分辨的阳性黄色检测圆圈区域；而不管待检样品中是否含有oct4， sox2，nanog, AP抗原，beta-tubulin都将被捕获在喷涂有抗beta-tubulin的区域形成肉 眼可见的黄色圆圈区域为阳性对照，如芯片失效则在阳性区域不会出现黄色圆圈；而阴性 对照区域无论如何都不会出现显色区域。实施例2
ips细胞表面表达特异性SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81抗原的检测检测方法分析SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81抗原在ips细胞中的表达，选 用抗SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81的单克隆抗体作为检测手段，抗BSA单抗作为阴 性对照，抗GAPDH单抗作为阳性对照；步骤一，称取1. 35g(0. 005mol)FeCl3 6H20 和 0. 69(0. 0025mol) FeS04 7H20 溶于 50ml的去离子水中，在氮气保护、80°C的环境下加入20mll. 5M的NaOH，剧烈搅拌反应lh 后，用磁分离的方法分离出黑色沉淀，并用去离子是水洗涤3次，得磁性纳米粒子，最后将 磁性纳米粒子分散在20ml去离子水中形成浓度为8mg/ml溶液；步骤二，1.1417g(5mmol)CdCl2 .2. 5H20 溶解 110ml 水中，再加入 1. 1053g(12mmol) TGA搅拌均勻，用mNaOH调节pH到11，再用氮气保护，加入2. 5mmol新制备的NaHTe水溶 液，将此反应体系加热到100°C，回流4h，得到荧光发射波长为570nm，浓度为4mg/ml的表面 带有羧基的黄色CdTe水溶性量子点；步骤三，量取50ml的环己烷，10ml的Triton-100，8ml的正己醇，室温下剧烈搅拌 反应30min ；取上述步骤制备好的CdTe水溶性量子点4ml，乙醇8ml，按1 2体积比沉淀 量子点，然后用1ml磁性纳米粒子水溶液重悬沉淀后的量子点，并逐滴的加入到已形成微 乳结构的油相体系中，然后再剧烈搅拌30min，加入体积分数为27% NH3 H20150ul调节反 应体系PH为碱性，然后加入500ul的TE0S搅拌反应24h，通过磁分离的方法收集样品，并分 别用无水乙醇和去离子水各洗涤3次，最后用5ml的去离子水重悬，形成水溶性的荧光磁性 纳米硅球溶液，磁分离，得荧光磁性纳米硅球，之后重悬于100ml乙醇溶液中，并添加2ml的 APTS，在80°C的油浴中搅拌反应3h，磁分离收集氨基功能化的荧光磁性纳米硅球，再将氨 基化的荧光磁性纳米硅球分散在lOOmlDMF溶液中，加入3mg 丁二酸酐室温搅拌反应24h，利 用磁分离的方法分离得到羧基化的荧光磁性纳米硅球，最后用DMF洗涤3次，并重悬于3ml 的无菌PBS(pH7.4)中待用；步骤四，取1ml的羧基化的荧光磁性纳米硅球溶液加入2. 5ml磷酸盐缓冲溶液 (pH6. 0)，再加入125mg的EDC和125mgNHS反应30min活化羧基，最后加入300ug的SSEA-3， SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81单抗避光摇勻反应2h，然后4°C下过夜；步骤五，以pH 7. 60. 01mol/L的磷酸盐缓冲液将ips细胞表达的特异性标记 物(SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81)相对应的抗体稀释为lmg/ml，如图2所示，以 Bio-Dot点样仪喷到0. 45um的硝酸纤维素膜上，通过计算机控制高速每针喷射InL的抗体 溶液到微阵列为4X4结构的硝酸纤维素膜上，同时以抗GAPDH抗体为阳性对照喷在4X4 微阵列结构的左上和右下对角方位，以抗BSA抗体为阴性对照喷在4X4微阵列结构的右上 和左下对角方位，然后用含有10mg/ml的PBS封闭、37°C干燥，最后将硝酸纤维素膜组装在 高分子吸水纸上并放入塑料外壳内并放置在4°C待用；步骤六，以含0. 05% Tween20的PBS缓冲液(PBST) 100ul润湿微阵列芯片，待 PBST渗透入硝酸纤维素膜后，加入200ul待检样品，待渗透入膜内后，加PBST洗涤3次去 除未连接抗原，再分别加入200ul的连接有SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81抗体的荧 光磁性纳米硅球，用PBST溶液洗涤膜三遍，然后用紫外手提灯照射微阵列芯片，测试结果 可以肉眼分辨出来，如待检样品中含有被硝酸纤维素膜上的抗体捕获的SSEA-3，SSEA-4， TRA-1-60,TRA-1-81抗原，则会在微阵列芯片上出现肉眼可分辨的阳性黄色检测圆圈区域；而不管待检样品中是否含有SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60, TRA-1-81抗原，GAPDH蛋白都将被 捕获在喷涂有抗GAPDH抗体的区域形成肉眼可见的黄色圆圈区域为阳性对照，如芯片失效 则在阳性区域不会出现黄色圆圈；而阴性对照区域无论如何都不会出现显色区域。
权利要求
一种检测诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，制备磁性纳米粒子和水溶性量子点；步骤二，取正硅酸四乙酯水解生成二氧化硅微球，采用反相微乳液法制备荧光磁性纳米硅球；步骤三，表面改性荧光磁性纳米硅球，之后偶联抗体，得偶联抗体的荧光磁性纳米硅球；步骤四，以内参蛋白为阳性对照，牛血清白蛋白为阴性对照，利用抗诱导多能干细胞表面表达的特异性标记物的抗体制备微阵列芯片；步骤五，利用步骤四的微阵列芯片检测样品，之后用步骤三所得的偶联抗体的荧光磁性纳米硅球对微阵列芯片进行荧光标记，得检测结果。
2.根据权利要求1所述的检测诱导多能干细胞的方法，其特征是，步骤一中，所述制备 磁性纳米粒子具体为采用共沉淀法制备，将Fe2+与Fe3+按摩尔比为1 2混合，之后加入 1. 5M的NaOH的水溶液，搅拌，氮气保护、80°C下反应lh，磁分离，得磁性纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的检测诱导多能干细胞的方法，其特征是，步骤一中，所述水溶 性量子点为CdTe量子点。
4.根据权利要求3所述的检测诱导多能干细胞的方法，其特征是，所述CdTe量子点的 制备方法具体为在Cd2+盐的水溶液中加入巯基乙酸，用1M的NaOH的水溶液调节pH为11， 氮气保护、磁力搅拌下加入NaHTe的水溶液，100°C下回流1 24h，得CdTe量子点。
5.根据权利要求1所述的检测诱导多能干细胞的方法，其特征是，步骤二中，所述反相 微乳液法具体为将磁性纳米粒子与水溶性量子点混合，加入到环己烷的油相微乳溶液中， 剧烈搅拌，得油包水微乳反应体系，用体积分数为27%的NH3 H20调节pH值为碱性，然后 加入正硅酸四乙酯水解反应24h，磁分离，得荧光磁性纳米硅球。
6.根据权利要求1所述的检测诱导多能干细胞的方法，其特征是，步骤三中，所述表 面改性具体为，将荧光磁性纳米硅球分散在乙醇中，80°C油浴下加入硅烷偶联剂，搅拌反应 3h，磁分离，得到氨基化的荧光磁性纳米硅球；之后将氨基化的荧光磁性纳米硅球分散在 DMF溶液中，加入过量的丁二酸酐，25°C下搅拌反应24h，磁分离，得改性后的荧光磁性纳米 硅球。
7.根据权利要求6所述的检测诱导多能干细胞的方法，其特征是，所述硅烷偶联剂为 氨丙基三乙氧基硅烷。
8.根据权利要求1所述的检测诱导多能干细胞的方法，其特征是，步骤四中，所述制备 微阵列芯片具体为将抗诱导多能干细胞表面表达的特异性标记物的抗体喷到硝酸纤维素 膜上4 X 4微阵列结构的检测区，同时以内参蛋白作为阳性对照区，BSA作为阴性对照，以中 性蛋白封闭，干燥，然后将固化有检测区和对照区的硝酸纤维素膜组装在高分子吸水纸上， 最后组装在塑料外壳内放置，即得。
9.根据权利要求1所述的检测诱导多能干细胞的方法，其特征是，步骤五中，所述得检 测结果具体为先用PBST润湿芯片，再加入待测样品，之后用PBST洗涤膜，去除未连接的抗 原，再加入偶联抗体的荧光磁性纳米硅球，再次用PBST洗涤膜，置于紫外灯下观察，如果待 测样品中含有被硝酸纤维素膜上的相应抗体捕获的抗原，则会在紫外照射下可以形成肉眼 可分辨的彩色检测区。
全文摘要
一种检测技术领域的检测诱导多能干细胞的方法，包括如下步骤制备磁性纳米粒子和水溶性量子点；取正硅酸四乙酯水解生成二氧化硅微球，采用反相微乳液法制备荧光磁性纳米硅球；表面改性荧光磁性纳米硅球，之后偶联抗体，得偶联抗体的荧光磁性纳米硅球；以内参蛋白为阳性对照，牛血清白蛋白为阴性对照，利用抗诱导多能干细胞表面表达的特异性标记物的抗体制备微阵列芯片；利用微阵列芯片检测样品，之后用偶联抗体的荧光磁性纳米硅球对微阵列芯片进行荧光标记，得检测结果。本发明的方法可实现同时对单个样本进行多种特异性分子的检测；样品用量�。涣槊舳群吞匾煨愿撸患觳獬杀镜停徊僮骷虻ィ远潭雀撸患觳馑俣瓤臁�
文档编号G01N33/533GK101799416SQ20101012088
公开日2010年8月11日 申请日期2010年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者吉佳佳, 崔大祥, 贺蓉, 阮静 申请人:上海交通大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
