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专利名称：一种sds-page快速脱色方法及其专用脱色杯的制作方法
技术领域：
本发明属于电泳凝胶脱色技术，具体涉及一种SDS-PAGE快速凝胶脱色方法及其 专用脱色杯，本发明采用蒸馏水或去离子水作为脱色剂，结合专门的脱色仪，在特定温度下 利用加热脱色剂方式进行凝胶脱色。
背景技术：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸 钠)，SDS与蛋白质疏水部分相结合，断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级 结构的折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。蛋白质在一定浓度的含 有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物， 这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仪保持原有分子 大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于 SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决 于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性 关系，符合下式=IogMW = K-bX，式中丽为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知 分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相 同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量(Harnes，B. D and Rickwood，D，1981，GelElectrophoresis of Proteins :A Practical Approach. Oxford and Washington. D. C. :IDL Press. ；Creighton, R. F. et al.，1989，Protein Structure Apractical approach. Oxford :IRL Press.)0SDS-PAGE已成为现代生物学研究中重要技术手段，是对蛋白质进行分离、量化、比 较及特性鉴定的一种经济、快速、可重复的方法。SDS-PAGE易于操作和用途广泛，它已成为 许多研究领域中一种重要的分析技术(郭尧君，1999，蛋白质电泳实验技术，P123 156， 科学出版社；汪家政，范明，2000，蛋白质技术书册，P77 108，科学出版社)。SDS-PAGE包 括四个主要步骤，即凝胶制备、电泳、染色、脱色。其中凝胶制备和电泳已有成熟的技术和 专用设备，目前SDS-PAGE的凝胶染色主要方法有考马斯亮蓝染色、银染、CaCl, KCl等方法 (郭尧君，1999，蛋白质电泳实验技术，P123 156，科学出版社；汪家政，范明，2000，蛋白质 技术书册，P77 108，科学出版社)，其中考马斯亮蓝染色由于其清晰度最好，灵敏度较高 而被广泛采用。然而考马斯亮蓝染色后需进行脱色，将PAGE胶上非特异结合的考马斯亮篮 脱掉后，才能显示出清晰的电泳条带。凝胶脱色需要用醋酸_甲醇或醋酸-乙醇脱色液在 脱色摇床上脱色2 3小时，中间需要更换几次脱色液，脱色一次至少需要60ml脱色液，不 仅浪费材料，而且用过的脱色液会造成环境污染，同时脱色液中甲醇和醋酸对人健康危害 严重，还不能及时看到试验结果。很多研究者对传统的方法进行了不同程度的改进，肖亚中 等(肖亚中，王军，蒲春雷，2002，一种简易的聚丙烯酰氨凝胶脱色方法，生物学杂志19(4)， P34 35)发现使用20%乙醇和10%冰醋酸作为脱色剂，脱色液中放置纸巾吸附色素，此方 法可以缩短脱色时间，减少脱色液用量；最近张晓楠等(张晓楠，王爽，候颖，2008，聚丙烯酰氨凝胶的快速脱色及干胶的简易制作，医学分子生物学杂志5(1) ；P40 41)在此基础上 建立了一种更为简便的方法，用自来水作为脱色液，加入滤纸后，用微波炉加热到70°C后， 然后在脱色摇床震摇脱色。然而我们在试验中发现，自来水中加热很容易将凝胶变成白色， 不能恢复，更不能进行结果验证，此方法可行性不高。

发明内容
本发明的目的在于改进SDS-PAGE胶传统脱色技术，彻底摆脱使用传统脱色液脱 色带来的种种不便，而提供一种更加高效、快捷、安全的SDS-PAGE快速脱色方法，该技术结 合专门配备的仪器可以在1. 5 2小时内完成染色脱色过程，并且电泳条带清晰可辨、背景干净。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明的SDS-PAGE快速脱色方法， 包括以下步骤1)凝胶清洗电泳凝胶染色结束后，用蒸馏水、去离子水或超纯水将胶清洗2-3 遍；2)预脱色将凝胶放入盛有蒸馏水、去离子水或超纯水的脱色杯中，水量以刚刚 没过凝胶为宜，加热脱色杯，使脱色杯中水达到80°C时，停止加热，将脱色杯中水全部放出， 重新加入冷水，加热使温度再次升高到80°C停止加热，将水再次放出，预脱色结束；(此步 的目的是为了防止PAGE胶中高浓度的SDS在高温下析出，造成泡沫溢出，甚至将胶冲烂。)3)脱色向脱色杯中加入足量蒸馏水、去离子水或超纯水，水量是预脱色时的2-3 倍，加热至80°C时，一边放出热水，一边加入冷水，温度始终保持在80°C，直到胶上背景干 净、条带清晰，脱色完成。4)结果保存将胶进行扫描以及制备干胶。所述电泳凝胶染色是考马斯亮蓝染色。适用于SDS-PAGE快速脱色方法的专用脱色杯，包括适于加热的杯体，在杯体上、 下部分别设置有由热敏开关控制的进水口和出水口，热敏开关由设置在杯体上的温度传感 器控制。其脱色过程具体如下1.电泳凝胶的染色后处理(60-70分钟)电泳凝胶经过考马斯亮蓝R-250染色后，将染色液回收，凝胶用去离子水、蒸馏水 或超纯水清洗3次，然后将凝胶轻轻放入装有300ml去离子水或蒸馏水的电泳脱色装置中。2.凝胶预脱色(10-15分钟)将脱色杯置于电炉或电磁炉上加热，待脱色杯中水达到80°C时，停止加热，将杯中 水放出，重复2次。3.凝胶脱色(20-25分钟)预脱色后，向装有凝胶的脱色杯中加入足量(根据凝胶数量)去离子水、蒸馏水或 超纯水，置于电炉上(金属脱色仪可置于电磁炉上)加热，待温度升高到80°C时，温度传感 器将温度传导到脱色仪上的热敏感开关，热敏感开关跳起放出热水，流入冷水，温度降低， 开关闭合，温度上升，如此反复循环，脱色杯中温度一直维持在80°C左右，直到凝胶上电泳 条带清晰、背景干净为止。
4.然后将胶进行扫描以及制备干胶。本发明与现有技术相比具有以下优点1.以去离子水、蒸馏水或超纯水取代传统的甲醇-冰醋酸溶液作为脱色液，成本 低廉，无环境污染。2.配合专用脱色装置利用加热方法在30-40分钟内完成整个脱色过程，比常规脱 色方法(3-4小时)更加快捷，加快试验进度。3.操作简单，本方法无需配制特殊脱色液，只要利用一般生化实验室现有加热设 备，采用本方法中脱色杯(或实验室中烧杯，但需要实验者在旁边用冷水控制温度，防止沸 腾)，可以非常方便的进行脱色试验。



图1为本发明的工艺流程图。图2为本发明专用脱色杯结构示意图。图2中标号1为热敏开关，2为温度传感器，3为脱色杯。图3为烟草花粉蛋白SDS-PAGE电泳图。图4为百合与马铃薯花粉蛋白SDS-PAGE电泳图。图5为原核表达植物蛋白及纯化过程SDS-PAGE电泳图。
具体实施例方式本发明以下结合附图将脱色过程进一步描述如图1所示本发明的脱色方法按以下步骤完成1)凝胶清洗电泳结束后，用蒸馏水、去离子水或超纯水(不能用自来水)将胶清 洗2-3遍；2)预脱色将凝胶放进脱色杯(脱色杯结构如图2所示)，加入少量蒸馏水、去离 子水或超纯水，水面刚刚没过凝胶即可，加热使脱色杯(3)中水达到80°C时，停止加热，将 杯中水放出，重复2次。3)脱色向脱色杯(3)中加入足量蒸馏水、去离子水或超纯水，水量为预脱色时 2-3倍，加热80°C时，热敏开关(1)开启，热水流出，冷水流入，温度降低，热敏开关关闭，温 度再次升高，如此反复循环，脱色杯(3)中水温一直维持在80°C左右，直到蛋白胶背景干 净、条带清晰，脱色完成。热敏开关(1)由设置在杯体上的温度传感器(2)控制开启或关闭。4)结果保存将脱色完成的胶利用较大分辨率进行扫描，制备干胶保存。
权利要求
一种SDS-PAGE快速脱色方法，其特征在于它包括以下步骤1)凝胶清洗电泳凝胶染色结束后，用蒸馏水、去离子水或超纯水将胶清洗2-3遍；2)预脱色将凝胶放入盛有蒸馏水、去离子水或超纯水的脱色杯中，水量以刚刚没过凝胶为宜，加热脱色杯，使脱色杯中水达到80℃时，停止加热，将脱色杯中水全部放出，重新加入冷水，加热使温度再次升高到80℃停止加热，将水再次放出，预脱色结束；3)脱色向脱色杯中加入足量蒸馏水、去离子水或超纯水，水量是预脱色时的2-3倍，加热至80℃时，一边放出热水，一边加入冷水，温度始终保持在80℃，直到胶上背景干净、条带清晰，脱色完成；4)结果保存将胶进行扫描以及制备干胶。
2.根据权利要求1所述的SDS-PAGE快速脱色方法，其特征在于所述电泳凝胶染色是考马斯亮蓝染色。
3.一种适用于权利要求1所述的SDS-PAGE快速脱色方法的专用脱色杯，其特征在于 包括适于加热的杯体，在杯体上、下部分别设置有由热敏开关控制的进水口和出水口，热敏 开关由设置在杯体上的温度传感器控制。
全文摘要
一种SDS-PAGE快速脱色方法及其脱色杯，其方法包括以下步骤1)凝胶清洗电泳凝胶染色结束后，用去离子水等将胶清洗2-3遍；2)预脱色将凝胶放入盛有上述水的脱色杯中，加热达到80℃左右时，将脱色杯中水放出，该过程重复2次；3)脱色向脱色杯中加入足量上述水，加热至80℃时后换水，再加热，如此反复循环，直到背景干净、条带清晰，脱色完成。本发明优点是1、以去离子水等取代传统的甲醇-冰醋酸溶液作为脱色液，成本低廉，无环境污染。2、配合专用脱色装置利用加热方法在30-40分钟内完成整个脱色过程，方便快捷，加快试验进度。3、操作简单，本方法无需配制特殊脱色液，只需利用实验室现有加热设备，采用本专业脱色装置，就可以非常方便的进行脱色试验。
文档编号G01N1/28GK101871858SQ20101020452
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者奚家勤, 宋纪真, 尹启生, 李锋, 杨军, 王信民, 王广山, 罗朝鹏, 金立锋 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院