专利名称：用于多表面成像的补偿器的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及对分析样品进行成像和评估的领域。更具体地说，本发明涉及 使用补偿器对支撑结构的多个表面上的分析样品进行成像和评估的技术。
背景技术：
用于对支撑结构上的分析样品进行成像的应用越来越多。这些支撑结构可以包 括多个基片，其上放置生物样品。例如，这些基片可以包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖 核酸(RNA)探针，这些探针对于人类和其它生物体的基因中存在的核苷酸序列具有特异 性。各种DNA或RNA探针可以被附连到这种支撑结构上的小的几何栅格或阵列中的特 定位置上。根据所采用的技术，样品可以附加在支撑结构上的随机、半随机或预定的位 置上。测试样品，例如，来自已知的人体或生物体，可以暴露于该阵列或栅格，使得互 补的基因或片段与基片表面上各个位点处的探针杂交。在某些应用(比如测序)中，基 因材料的模板或片段可以放置在各个位点上，并使得核苷或其它分子与模板进行杂交， 从而确定模板的特性或序列。因此，这些位点可通过下列过程来检查使特定频率的光 在这些位点上进行扫描，从而用基因或片段发生杂交的那些位点处的荧光来识别该样品 中的哪些基因或片段曾是存在的。这些基片时常被称之为微阵列、基因或基因组芯片、DNA芯片、基因阵列，等 等，并且还可以用于表达分布、监控表达等级、基因分型、测序等等。例如，诊断应用 可以包括评估特定病人的基因构成，用于确定是否有疾病状态或是否存在特定病症的 征兆。这类基片的读取和评估都是本发明的重要部分。尽管微阵列允许呈现分开的生物 组份以便批量处理和单独检测，但是在单次实验中可以检测的组份的数量受到系统分辨 率的限制。此外，在某些方法中所使用的散装试剂十分昂贵，所以希望能减少使用量。 本发明提供了能提高基于阵列的检测的效率以抵消这些限制的方法和组合物。还提供了 其它优点并从下列描述中变得更加明晰。
发明内容
本发明提供一种新的方法，用于分析样品的成像和评估，以将成像和评估子系 统的应用扩展到支撑样品的多个表面。支撑结构可以是，例如，流动单元，允许试剂流 动通过该流动单元并与生物样品进行反应。由至少一个辐射源产生的激发辐射可以用于 在多个表面上激发生物样品。采用这种方法，荧光辐射可以从生物样品上发射，并随后 采用检测光学器件并在至少一个检测器上被捕获和检测到。返回的辐射可随后用于产生 图像数据。这种多个表面的成像可按顺序或同时完成。另外，本发明的技术可以用于多 种成像系统中的任何一种系统。例如，本发明技术有利于显微荧光和全内发射(TIR)方 法。另外，在支撑结构的表面上可以按随机的位置或图案来呈现被成像的生物样品。因此，本发明提供了一种对生物样品进行成像的方法，该方法包括使用检测器 来检测放置在流动单元的第一表面上的生物样品的第一发射组分所发射出的辐射。流动单位被安置在成像站点上。该方法还包括在检测器和流动单元之间插入校正光学器件。 该方法还包括使用检测器和校正光学器件来检测放置在流动单元的第二表面上的生物样 品的第二发射组分所发射出的辐射。第一和第二表面都按一种方式排列，由此这些表面 之一被放置在检测器和其它表面之间。另外，校正光学器件减小了这种排列方式在这些 表面之一处引起的检测象差。该方法的步骤都是重复的，同时使流动单元保持在成像站点上本发明还提供成像系统，用于检测在多表面流动单元上的辐射。成像系统包括 多表面流动单元，它具有放置在流动单元的第一和第二表面上的生物样品的第一和第二 发射组分。成像系统也包括光具组，该光具组包括物镜、配置成通过物镜在第一发射组 分上聚焦光具组的成像光学器件以及配置成在第二发射组分上聚焦光具组且配置成减小 在第一或第二发射组分上的检测象差的校正光学器件。成像系统还包括辐射源，配置成 引导激发辐射至第一和第二发射组分。另外，成像系统包括检测光学器件，配置成俘获 通过光具组从第一和第二发射组分返回的发射辐射。此外，成像系统包括检测器，用于 检测所俘获的辐射。
图1是根据本发明用于生物样品成像系统的视图；图2是根据本发明从支撑结构表面直接照射半共焦辐射生物位点和到半共焦返 回辐射到检测器的实例性辐射线的透视图；图3是根据本发明具有在支撑结构两个表面上引导出的激发辐射的实例性支撑 结构的剖面视图；图4是根据本发明具有空间排列图形的生物组分位点的阵列的实例性支持结构 的透视图；图5是根据本发明具有随机空间分布的生物组分位点的实例性支持结构的透视 图；图6是根据本发明具有支持结构多表面上引导出的激发辐射的实例性结构的剖 面图；图7是图示说明根据本发明在物镜和支撑结构之间的实例性尺寸；图8是根据本发明图7的支撑结构的球面象差对上基片厚度的示例性图；图9A图示说明了支撑结构的第一和第二表面所期待的实例性图像，该图像是通 过没有校正光学器件的300微米(加流体的100微米)的上表面厚度所获得的，其中，成 像系统对第二表面进行了优化；图9B图示说明了支撑结构的第一和第二表面所期待的实例性图像，该图像是通 过没有校正光学器件的340微米(加流体的100微米)的上表面厚度所获得的；图10A图示说明了根据本发明在没有补偿器辅助的情况下对第二表面进行实例 性物镜成像；图10B图示说明了根据本发明在有补偿器辅助的情况下对第一表面进行实例性 物镜成像；图11是根据本发明的实例性补偿器设计，其包括了第一物镜和可以替代光具组中的第一物镜的第二物镜；图12是根据本发明的另一实例性补偿器设计，其包括了可以插入在物镜和支撑 结构之间的校正器件；图13是根据本发明的另一实例性补偿器设计，其包括了校正环；图14是根据本发明的另一实例性补偿器设计，其包括了无限空间补偿器；图15是根据本发明使用图案化的粘合剂形成沟道特性的实例性流动单元组件的 透视图；图16是根据本发明使用图案化的粘合剂形成沟道特性的另一实例性流动单元组 件的透视图；图17是根据本发明使用图案化的粘合剂形成沟道特性来组装流动单元的实例性 方法的工艺流程图；图18是根据本发明采用一个辐射源和两个检测器且配置成按测序地扫描支撑结 构的多个表面的生物样品成像系统的视图；图19是根据本发明采用两个辐射源和两个检测器且配置成按测序地扫描支撑结 构的多个表面的生物样品成像系统的视图；图20是根据本发明采用两个辐射源和两个检测器以及沿着激发路径使用聚焦透 镜且配置成同步扫描支撑结构的多个表面的生物样品成像系统的视图；图21是根据本发明采用两个辐射源和两个检测器以及沿着激发和发射路径使用 聚焦透镜且配置成同步扫描支撑结构的多个表面的生物样品成像系统的视图；图22是根据本发明采用多个辐射源和多个检测器以及沿着激发路径使用聚焦透 镜且配置成同步扫描支撑结构的多个表面的生物样品成像系统的视图；图23是根据本发明用于TIR生物样品成像系统的视图；图24是根据本发明流动路径底部表面的TIR成像所使用的实例性支撑结构、棱 镜和透镜物镜的剖面图；图25是根据本发明流动路径顶部表面的TIR成像所使用的实例性支撑结构、棱 镜和透镜物镜的剖面图；图26是根据本发明流动路径顶部表面的TIR成像所使用的另一实例性支撑结 构、棱镜和透镜物镜的剖面图；以及图27是根据本发明在顶部和底部表面加热的实例性支撑结构的剖面图。
具体实施例方式现在参照附图，且首先参照图1，图示说明了生物样品成像系统10。该生物样 品成像系统10能对支撑结构16内的多个生物组分12、14进行成像。例如，在图示说明 的实施例中，第一生物组分12可以呈现在支撑结构16的第一表面上，而第二生物组分14 可以呈现在支撑结构的第二表面上。支撑结构16可以是，例如，在其内部表面18、20 上具有生物组分12、14阵列的流动单元，内部表面一般是相互面对面的且试剂、冲洗剂 和其它液体可以被引入流过这些表面，用于将核苷或其它分子键合在生物组分12、14的 位点上。可以结合本发明的技术来制成支撑结构16，或者支撑结构16从各个单独的厂商 购买或者获得。在键合组分的分子上的荧光标记可以包括，例如，在适当激发辐射激发时发出荧光的染料。包括荧光标记使用且可在装置中使用的化验方法或本文所阐述的方 法包括本文所阐述的其它方法，例如，基因分型化验、基因表达分析、甲基分析或核酸 测序分析。业内熟练的技术人士都会意识到流动单元或其它支撑结构都可采用业内所熟 悉的各种阵列中的任一阵列，以便于获得相似的结果。此外，形成阵列的已知方法也都 可以使用，并且如果合适的话，根据本文所阐述的技术进行改进，以便创建流动单元或 在本文所阐述的检测方法中具有多个有效表面的支撑结构。这种阵列可以采用任何已知 技术在支撑的表面上随机地或按预定的图案来沉积样品生物组分的方法来形成。在预 定的实施例中，可以采用美国专利No.7,115,400、美国专利申请公报No.2005/0100900、 PCT公报No.WOOO/189657或PCT公报No.W098/44151所讨论的方法来准备核酸拓展 的集簇阵列，上述文档通过参考合并与此。这类方法都是已知的，如同桥式放大或者固 体_相位放大一样，并且对于测序应用特别有用。在本发明中使用的其它实例性随机及其构成方法包括，但不局限于，将液珠与 固体支撑相结合，例如，美国专利No.6,355,431，6,327,410和US6,770,441，美国专利申 请公报No.2004/0185483和US2002/0102578 ；以及PCT公报No.WOOO/63437所讨论的， 这些内容通过应用合并与此。液珠可以放置在各个不连续的位点上，例如，在固相支撑 的侧壁，并且各个位置都提供单个液珠。本发明也可使用业内所熟知的其它任意种类的阵列及其构成这类阵列的方法。 可以使用的商用微阵列包括Affymetrix GeneChip 微阵列或者根据有时称之为 VLSIPS (Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis)技术所合成的其它微阵列，正 如在美国专利 No.5,324,633 ； 5,744,305 ； 5,451,683 ； 5,482,867 ； 5,491,074 ； 5,624,711 ； 5,795,716 ； 5,831,070 ； 5,856,101 ； 5,858,659 ； 5,874,219 ； 5,968,740 ； 5,974,164 ； 5,981,185 ； 5,981,956 ； 6,025,601 ； 6,033,860 ； 6,090,555 ； 6,136,269 ； 6,022,963 ； 6,083,697 ； 6,291,183 ； 6,309,831 ； 6,416,949 ； 6,428,752 和 6,482,591 中所讨论的，这些 文件通过引用合并与此。本发明方法也可使用斑点微阵列，实例性斑点微阵列是来自 AmershamBiosciences的CodeLink 阵列。在本发明中有效的另一微阵列是使用喷墨印 刷方法制成的微阵列，例如，采用安捷伦技术(Agilent Technologies)公司的sureprint 技 术。阵列的位点或特征一般都是离散的，在空间上相互分开。位点的大小和/或位 点之间的间隔都可变化，使得阵列能够具有较高的密度、中等的密度或较低的密度。高 密度阵列具有位点间隔小于大约15 pm的特性。中等密度阵列具有位点间隔大约15至 30 ym的特性，而低密度阵列具有位点间隔大于30 ym的特性。在本发明中有效的阵列 可以具有间隔小于100 iim，50 um, 10 u m, 5 u m, 1 y m或0.5 y m的位点。本发明的 装置或方法能够按照足以区分在上述密度或密度范围内的位点的分辨率来对一阵列进行 成像。正如本文所解释的那样，在本发明的装置或方法中所使用的表面一般都是制造 的表面。也有可能使用自然表面或者自然支撑结构的表面，然而，本发明也可在表面不 是自然材料或不是自然支撑结构的表面的实施例中实现。因此，生物样品的组分能够消 除自然环境的影响并黏附在制造表面上。
多种生物组分中的任意组分都能呈现在一表面上，以便用于本发明。实例性组 分包括，但并不限制于，诸如DNA或RNA的核酸、诸如酶或受体的蛋白质、这些自然组 分的多肽、核苷酸转移酶、氨基酸、糖精、辅助因子、代谢因子或派生因子。尽管本发 明的装置和方法在本文中是参照生物样品的组分，但是应该理解是的其它样品或组分也 能很好的使用。例如，也能使用合成的样品，例如，组合库或具有所希望结构或功能的 已知或怀疑的物质的组分的库。于是，对于所希望的结构或功能，装置或方法能够用于 合成多种组分和/或屏蔽组分。返回图1所示的实例性系统，生物样品成像系统10至少包括第一辐射源22， 但也可包括第二辐射源24(或者其它源)。辐射源22、24可以是具有不同波长的激光 器。激光器的波长选择一般取决于对组分位点进行成像所使用的染料的荧光特性，使用 多种不同波长的激光器可以允许区别支撑结构16中的各种位点上的染料，并且可以通过 一些图像的连续采集来继续成像操作，从而能够采用业内一般所熟知的图像处理和读取 逻辑来识别在这些组分位点处的分子。业内所熟知的其它辐射源也能够使用，包括，例 如，弧灯或石英卤素灯。特别有效的辐射源是那些能够在紫外(UV)范围(大约200至 390nm)、可见光(VIS)范围(大约390至770nm)、红外(IR)范围(大约0.77至25 y m) 或其它电磁频谱的电磁辐射的源。为了便于描述，可以使用诸如基于荧光的检测方法。然而，应该理解的是结合 本文所阐述的装置和方法也可使用其它检测方法。例如，可以检测各种不同的发射类 型，例如，荧光、发光或化学发光。因此，被检测的组分可以使用荧光、发光或化学发 光的化合物或一部分来标记。也可以使用类似于本文实施例的装置和方法，使用不是光 学信号的信号进行检测，以便改进检测，使之适应被检测信号的特殊物理特性。辐射源22、24的输出可以通过调节光学器件26、28引导，用于光束的滤光和成 形。例如，在本发明所预期的实施例中，调节光学器件26、28可以产生大致线性的辐射 光束并且将多个激光器的光束组合起来，正如美国专利No.7,329,860所讨论的。激光器模 块还另外包括用于记录各个激光器功率的测量部件。功率的测量可以被用作反馈机制， 以便控制记录图像的时间长度，从而获得均勻的曝光以及更加合适的信号。在通过调节光学器件26、28之后，光束可以被引导至引导光学器件30，用于将 来自辐射源22、24的光束重新引导至聚焦光学器件32。引导光学器件30可以包括分色 镜，配置成将光束重新引导至聚焦光学器件32，同时也允许一定波长的向后光束通过其 中。聚焦光学器件32可以将辐射共焦地引向支撑结构16的一个或多个表面18、20，各 个生物组分12、14位于这些表面上。例如，聚焦光学器件32可以包括显微物镜，沿着 到支撑结构16的表面18、20的直线共焦地引导并会聚辐射源22、24。在支撑结构16上的生物组分位点可以响应激发光束以一定的波长发出荧光并因 此返回用于成像的辐射。例如，荧光组分可以通过荧光标记核酸的方法来产生，该方 法可以杂交组分中的其余分子或杂交荧光标记核苷酸转移酶，从而使用聚合酶组合成低 (聚)核苷酸。正如以上所提及的，这些组分的荧光特性可以通过将试剂引入支撑结构 16而改变(例如，通过从分子分裂染料，阻止其它分子的黏附，添加猝熄试剂，添加能 量传递的受体，等等)。正如业内熟练的技术人士所意识到那样，激发样品染料的波长和 荧光激发的波长将取决于特定染料的吸收和发射频谱。这种返回的辐射可以通过引导光学器件30而传播回来。这种向后波束一般可被引导至引导光学器件34，它用于对波束进 行滤光以便将向后波束内不同的波长分离出来并将向后波束引导到至少一个检测器36。检测器36可以基于任何适用的技术，并可以是，例如，电荷耦合器件(CCD) 传感器，用于根据器件中的光子跃迁位置产生基于象素的图像数据。然而，应该理解的 是，也可以使用任何一种的其它检测器，包括且并不限制于，配置成用于时间延迟积分 (TDI)操作的检测器阵列，互补型金属氧化物半导体(CMOS)检测器、雪崩光电二极管 (APD)检测器、盖革模式的光子计数器或者任何其它适用的检测器。TDI模式的检测器 可以采用线扫描进行耦合，正如美国专利No.7,329,860所讨论的。检测器36可以产生图像数据，例如，具有0.1和50 ym之间的分辨率，并随后 传输给控制/处理系统38。通常，控制/处理系统38可以执行各种操作，例如，多个帧 中的数据的模数转换、缩放比例、滤波和关联，从而适当且精确地对样品上特定位置处 的多个位点进行成像。控制/处理系统38可以存储图像数据并可以最终将图像数据发送 给后处理系统(未显示)，在后处理系统处进行数据分析。根据样品的类型、所使用的试 剂和所执行的处理，可以对图像数据进行一系列不同的使用。例如，可以从图像数据中 得出核苷酸序列，或者该数据可以用于确定特殊基因的存在，表征在这些组分位点处的 一个或多个分子等等。图1所图示说明的各种部件的操作也可以与控制/处理系统38相 协调。在具体的应用中，控制/处理系统38可以包括硬件、固件和软件，用于设计控制 辐射源22、24的操作、聚焦光学器件32的移动和聚焦、平移系统40和检测光学器件34 的操作以及来自检测器36的信号采集和处理。控制/处理系统38可由此存储处理后的 数据并进一步处理该数据，以便产生在支撑结构16中发出荧光的被照射的位点的重构成 像。图像数据可以由系统自身进行分析，也可以存储，用于其它系统和成像后的不同时 间的分析。支撑结构16可以支撑在平移系统40上，从而允许在成像之后和之中的支撑结构 16的聚焦和移动。工作台可以配置成移动支撑结构16，从而相对于键合生物组分表面改 变辐射源22、24和检测器36的相对位置，以便于连续扫描。平移系统40的移动可以是 一个或多个维度的，包括，例如，垂直于激发辐射线传输方向的一个或两个维度，标记 为X和Y维度。在具体实施例中，平移系统40可以配置成以垂直于检测器阵列的扫描 轴的方向移动。在本发明中有效的平移系统40还可以配置成沿着激发辐射线传播的维度 中移动，一般将该方向标记为Z维度。以Z维度移动也有利于聚焦。图2是说明支撑结构16成像的实例性半共焦线扫描方法的视图，在所说明的实 施例中，支撑结构16包括上基片42和下基片44，且在上下基片42、44之间的内部容积 46。上下基片42、44可以采用任何一种材料来制成，但最好是采用在激发辐射和荧光 向后波束的波长下基本透明的基板材料制成，从而允许激发辐射和返回的荧光发射可以 通过且信号质量没有明显的损失。例如，在所示的落射荧光成像排列中，辐射所穿过的 一个表面在相关的波长下是基本透明的，而其它表面(辐射没有穿过的表面)则透明性 较差、半透明的或甚至是不透明或反射的。上下基片42、44可以在它们各自向内的表面 18、20上包含生物组分12、14。正如以上所讨论的那样，内部容积46可以包括，例如， 流动单元的一个或多个内部通道，试剂流体可以通过这些通道流动。支撑结构16可以被沿着辐射线50的激励辐射48照亮。辐射线50可以由辐射源22、24发出、被引导光学器件30引导着穿过聚焦光学器件32的激发辐射所形成。辐射 源22、24可以产生光束，经处理和成形后，提供包括多个辐射波长的线性横截面或辐射 线，用于根据具体使用的染料产生不同于生物组分12、14的对应波长的荧光。聚焦光学 器件32可随后半共焦地将激发辐射48引导到支撑结构16的第一表面18上，用于照亮沿 着辐射线50的生物组分12的位点。此外，支撑结构16、引导光学器件30、聚焦光学器 件32或其某种组合可缓慢地平移，使得所产生的辐射线50连续地照亮上述组分，如箭头 52所指示。这种平移产生了连续的扫描区域54，从而允许支撑结构16的整个第一表面 18被逐步照亮。正如以下将进一步详细说明的那样，同样的处理方法也可用于逐步照亮 支撑结构16的第二表面20。事实上，该处理方法可以用于支撑结构16中的多个表面。线性扫描的实例性方法和装置如美国专利No.7,329,860中所述，通过引用合并与 此，该专利讨论了具有检测器阵列的线性扫描装置，用于通过限制检测器阵列的扫描轴 维度来达到扫描轴的共焦特点。更具体的说，扫描器件可以配置成使得检测器阵列具有 矩形维度，使得检测器较短的维度是在扫描轴维度方向并且成像光学器件可以设置成将 样品区域的矩形图像引导到检测器阵列，使得该图像的较短维度也在扫描轴维度的方向 上。这样，就能够实现半共焦特点，因为共焦特性出现在单个轴(即，扫描轴)上。于 是，检测可具有专用于基板表面的特征，从而抑制由于该特征周围溶剂所引起的信号。 正如本文所讨论的那样，美国专利No.7,329,860所讨论的装置和方法可以作进一步的改 进，从而可以扫描支撑的两个或多个表面。也可以使用不是线扫描的检测装置和方法。例如，可以使用点扫描，例如，美 国专利No.5,646,411所讨论的，通过引用合并与此。宽角度区域扫描可以使用且可采用 或不采用扫描监视。正如本文将进一步阐述的那样，也可以使用TIR方法。一般来说，如图2所图示说明，根据本发明，用于对生物组分12、14的位点进 行成像的辐射线50可以是连续的或间断的线。这样，本发明某些实施例可以包括间断 线，使得辐射的大多数共焦或半共焦的引导光束仍然可以照亮沿着辐射线50的大多数的 点。这些间断光束可以由一个或多个源来产生，这些源以定点或扫描的方式来提供激发 辐射48。这些光束，如上所述，可以被共焦或半共焦地引导到支撑结构16的第一或第二 表面18、20，以照射生物组分12、14的位点。采用上述连续的半共焦线扫描方法，支撑 结构16、引导光学器件30、聚焦光学器件32及其某种组合可以按箭头52所示缓慢地前 进，沿着支撑结构16的第一或第二表面18、20陆续照射扫描区域54，从而连续照射生物 组分12、14的位点区域。应该注意的是，系统一般同时形成和引导激发辐射和返回的辐射，用于成像。 在某些实施例中，可以使用共焦点扫描，使得通过扫描穿过物镜的激发光束，使得光学 系统引导激发点或斑横跨生物组分。检测系统对检测器上激发点形成的发射进行成像， 而不再扫描向后光束。这是由于向后光束被物镜收集并在通过扫描装置返回之前与激发 光束光路相分离所产生的。因此，向后光束将以不同的点出现在检测器36上，这取决于 在物镜中的原始激发点的视场角。当激发点以横跨样品进行扫描时，激发点的成像就以 线的形状出现在检测器36上。若扫描装置由于某些原因不能采集样品的向后光束时， 这一技术就十分有用。实例是全息和声光学扫描装置，它能够以非常高的速度来扫描光 束，且还能利用衍射来产生扫描。因此，扫描性能是波长的函数。发射的辐射的向后光束是处于与激发光束不同的波长处。另一种选择或附加一种选择，发射信号可以在不同 波长的按测序的激发之后按测序地被收集到。在具体实施例中，本发明的装置或方法可以至少大约0.01mm2/SeC的速率检测 一表面上的特征。根据本发明的具体应用，也可以使用较快的速率，包括，例如，就扫 描区域或检测区域而言，速率至少大约0.02mm2/sec，0.05mm2/sec, 0.1mm2/sec, 1mm2/ sec, 1.5mm2/sec, 5mm2/sec, 10mm2/sec，50mm2/sec，100mm2/sec 或者更快。 如果 需要，例如，为了减小噪声，检测速率的上限为大约0.05mm2/sec，0.1mm2/sec, 1mm2/ sec，1.5mm2/sec, 5mm2/sec, 10mm2/sec, 50mm2/sec 或 100mm2/sec。在一些具体实例中，支撑结构16可以采用希望将生物组分只放置一个表面上的 方式来使用。然而，在许多具体实例中，生物材料是放置在支撑结构16多个表面上的。 例如，图3图示说明了一种典型的支撑结构16，在该结构中，生物材料黏附在第一表面 18以及第二表面20上。在图示说明的实施例中，黏附层56形成在支撑结构16的第一表 面18和第二表面20两个表面上。第一激发辐射58源可以用于照射在支撑结构16的第 一表面18上的生物组分12的许多位点中的一个并且返回来自照射生物组分12的第一荧 光发射60。同时或按测序地，可以使用激发辐射62的第二源来照射在支撑结构16的第 二表面20上的生物组分14的许多位点中的一个位点并且返回来自照射生物组分14的第 二荧光发射64。尽管图3所解释的实施例显示了来自源58和源62的激发可以来自支撑结构16 的相同一面，但应该理解的是，光学系统可以配置成入射到支撑结构16的相对的两侧的 表面。以图3为例，上表面18可以如图所示由激发源58照射，而下表面20可以从下面 照射。同样，发射可以从支撑结构的一侧或多侧检测到。在具体实施例中，支撑结构16 的不同侧可以由同一辐射源通过首先照射一侧进行激发，然后使支撑结构翻转使得另一 侧进入恰当的位置以便辐射源激发。生物组分12、14的分布可以遵循许多不同的图案。例如，图4图示说明了支撑 结构16，其中，在在第一和第二表面18、20上的位点或特征处的生物组分12、14都是均 勻地分布在生物组分位点68的空间排列图案66中的。例如，可以使用一定类型的微阵 列，其中，各个生物组分位点68的位置是采用规则的空间图案。该图案可以包括在预定 位置上的位点。相反，在其它类型的生物成像阵列中，生物组分黏附在位点的表面上， 这些位点出现在随机或者统计分布变化的位置，使得微阵列的成像可以用于确定各个不 同生物组分特征的位置。于是，尽管上述特征图案是合成或者制造工艺的产物，但也不 需要预先确定。例如，图5图示说明了支撑结构16，其中，在第一和第二表面18、20上的位点 都处于生物组分位点72的随机空间分布70中。然而，采用生物样品位点的固定阵列66 和随机分布70，支撑结构16的多个表面18、20的成像都有可能。另外，应该注意的是， 在这两个实例中，在各个位点上的生物组分可以由一群完全一样的分子构成，也可以由 不同分子的随机混合构成。此外，生物样品的密度可以变化并且可以是至少每平方毫米 1000个位点。本发明的技术提供支撑结构16中的多个表面的变化物理排列以及在这些表面上 的组分内的位点的变化部署。正如以上参照图2和图3所讨论的那样，在实施例中，支撑结构16具有第一表面18和第二表面20，第一激发辐射源58可以照射在第一表面18上 的生物组分12的位点并返回第一荧光辐射60，同时第二激发辐射源62可以照射在第二表 面20上的生物组分14的位点并返回第二荧光发射64的源，正如图3所示。于是，在两 个表面之间的样品容积的组分不需要被检测并能够被抑制。支撑结构表面的选择性检测 提供相对于邻近表面的支撑结构容积和相对于支撑结构的一个或多个表面的表面的较佳 检测。在更为复杂的配置中，照射多于两个表面十分有用。例如，图6图示说明了支 撑结构16，它具有N个基片，包括第一基片42、第二基片44、…、N-2基片74、N_1基 片76以及N基片78。这些基片确定了 M个表面，包括第一表面18、第二表面20、…、 M-3表面80、M-2表面82、M_1表面84以及M表面86。在所图示说明的实施例中， 不仅支撑结构16的第一表面18和第二表面20可以被照射到，而且所有M数量的表面都 可以照射到。例如，激发辐射源88可以用于照射在支撑结构16的第M表面86上的生 物组分位点并返回来自被照射生物组分的荧光发射90。对于具有多个表面的支撑结构而 言，希望从上面激发上层和从下面激发下层，以便减小光致退色。于是，邻近支撑结构 第一外侧层上的组分可以从第一侧照射，而来自另一外侧的照射可以用于激发在邻近另 一外侧层上存在的组分。图7图示说明了物镜92，可以通过它来检测分别来自支撑结构16的第一和第二 表面18、20上的发射生物组分12、14的辐射。物镜92可以是上述聚焦光学器件32的 组件中的一个组件。尽管在图中没有标注尺寸，但图7图示说明了在物镜92和支撑结构 16之间的实例性尺寸。例如，物镜92 —般与支撑结构16的上基片42的间隔为大约等 于或大于600微米。生物样品成像系统10可以构成检测通过300微米的上基片42来自 第一表面18上的生物组分12的发射辐射，其中上基片可以是诸如玻璃材料制成且具有折 射率Nd为1.472。另外，生物样品成像系统10也可以配置成检测通过300微米的上基片 42附加在支撑结构16内部容积46中的100微米的流体来自第二表面20上的生物组分14 的发射辐射。在某些实施例中，物镜92可以设计成衍射限制聚焦且仅仅只在支撑结构16的第 一或第二表面18、20之一上成像。例如，在图7至图14的全文描述中，物镜92可以设 计成用于300微米的上基片42加上支撑结构16的内部容积46中的100微米的流体读出 缓冲器的预补偿。在这种假设下，衍射限制性能只有可能在第二表面20上。此外，当 由第一表面18成像时，100毫米读出缓冲器引入的球面象差会严重地影响成像的质量。 然而，减小支撑结构16内部容积46的通道厚度可能增加些表面与表面之间的串扰。因 此，大多数解决方法也许是校正象差。正是如此，需要使用能够在支撑结构16的第一和 第二表面18、20上实现衍射限制成像性能的补偿器。应该注意的是，当使用具有高数值孔径(NA)数值的物镜92时，就需要补偿器 可以具有更多的显著作用。本发明特别有效的实例性高NA范围包括至少大约0.6的NA 数值。例如，NA可以至少是大约0.65，0.7，0.75，0.8，0.85，0.9，0.95或更高些。业 内熟练的技术人士都会意识到，NA取决于透镜起作用时的介质折射率，它可以更高些， 包括，例如，对于空气为1.0，纯净水为1.33，此外诸如油之类的其它介质就更高些。补 偿器也可找到在具有不同于上述实例的较低NA物镜中的应用。一般来说，物镜92的NA数值是物镜可以接受光的角度大小的测量。对于固定的放大倍率而言，NA数值越高，则 物镜可以收集到的光就越多。这是因为收集效率和分辨率提高了。因此，当使用具有较 高NA数值的物镜92时，因为有可能具有更高的特征密度，所以就更能区别多个物体。 因此，一般来说，物镜92具有较高NA数值有益于成像。然而，随着NA数值增加，则 它对于聚焦和成像通过介质的厚度变化的敏感性也会增加。换句话说，较低NA的物镜 92具有较长的景深，并一般不会对成像通过介质的厚度变化敏感。图8是根据本发明的球面象差(以波数为单位)与图7所示支撑结构16的上基 片42厚度关系的实例性图表94。特别是，图表的上部线96表示由支撑结构16的第一表 面18上的生物组分12所获取图像的球面象差的大�。急淼南虏肯�98表示由支撑结 构16的第二表面20上的生物组分14所获取图像的球面象差的大小。在图示说明的实施 例中，例如，100微米读取缓冲器所产生的球面象差大约4个波，这比衍射限制特征需要 小于0.25个波要高得多。正如所图示说明的那样，在300微米(即，上基片42的厚度) 时，用于第一表面18的球面象差大约负13.2个波(即，点100)，而用于第二表面20的 球面象差大约负17.2个波(即，点102)。图9A图示说明了根据本发明希望支撑结构16 的第一和第二表面18、20与上基片42的厚度相一致(即，300微米)的实例性成像，其 中成像系统对第二表面20进行优化(对负17.2个波进行预补偿)。如图所述，成像系统 能在第二表面20上提供高的成像质量，因为根据这一背景，可以这样设计做。然而，第 一表面18所获取的成像包含象差。为了平衡球面象差，在物镜92和支撑结构16之间引入附加厚度(即，通过引入 附加盖片)是有益的。例如，在返回到图8，如果在物镜92和支撑结构16的第一和第二 表面18、20之间引入大约40微米的附加厚度，则可以分离出在设计厚度(即，300微米 上基片加上100微米流体)球面象差之间的差异，使得第一和第二表面18、20两者所产 生的成像可以具有相似的质量。例如，如图所说明那样，在340微米(即，上基片42加 上附加的40微米厚度)时，第一表面18的球面象差大约是负15.2个波(即，点104)， 而第二表面20的球面象差大约是负19.2个波(即，点106)，分离差别大约负17.2个波 (即，点108)，这可以是物镜92设计点的特征。图9B图示说明了根据本发明希望支撑 结构16的第一和第二表面18、20与上基片42加附加厚度(即，300微米加40微米)相 一致的实例性成像，说明了附加厚度这样允许在支撑结构16的第一和第二表面18、20所 获取成像之间的平衡。然而，对于本文所阐述的成像系统的所有使用而言，仅仅只在物镜92和支撑结 构16之间引入附加厚度并不是所希望的。例如，如图9A和9B所图示说明的那样，通 过在物镜92和支撑结构16之间简单地引入附加40微米的厚度，第一和第二表面18、20 所形成的成像仍会经历由物镜92的设计点108所产生的剩余象差。因此，更加精确的解 决方案是仅仅在检测到来自支撑结构16的第一表面18上的生物组分12的辐射时引入附 加厚度。在这样的背景下，与物镜92的设计点108相一致的球面象差一般可由第一和第 二表面18、20来实现。应该注意的时，参照图9A和9B讨论的具体尺寸和测量(即，厚 度、球面象差数值及其它等等)仅仅是试图作为本发明功能的实例性方法。正是如此， 这些尺寸和测量并不试图限制。确实，具体几何和所产生的测量数值可以在实施例之间 变化。
例如，图10A图示说明了根据本发明用于在没有补偿器110的辅助下对支撑结构 16的第二表面20的成像的实例性物镜92。没有补偿器110，物镜92可根据它的设计聚 焦和引导支撑结构16第二表面20的成像并经历设计球面象差。然而，图10B图示说明 了根据本发明在有补偿器110的辅助下对支撑结构16的第一表面20进行成像的实例性物 镜92。通过使用补偿器110(即，类似于参照图8和图9所讨论的附加40微米厚度)， 物镜92可以在类似于支撑结构16第二表面20设计点的条件下聚焦和引导支撑结构16第 一表面18的成像。因此，通过检测没有补偿器110的第二表面20的成像和检测有补偿 器110的第一表面18的成像，就能使物镜92以类似于物镜92设计的衍射限制性能来检 测两个表面的成像。 颜色变化曲线可以限制于530nm至780nm之间的波长范围内。不同彩色波长带 宽的颜色变化可以通过聚焦光学器件32在各个带宽内的聚焦来补偿。补偿器110应该最 好是聚焦光学器件32 “看不到”的。换句话说，补偿器110应该校正读取缓冲器的球 面象差差异，但应该保持颜色变化趋向在530至780nm的波长范围内。更具体地说，在 560nm、610nm、687nm和720nm峰值波长之间的颜色变化关系应该保持。另外，其它 指标，包括NA、场景曲率、场景失真、检测放大及其它等等，也应该保持。此外，补偿 器110封装应该相对较小(即，总的厚度不大于10mm)。还有，补偿器110的定位误差 最好是不敏感的。各种不同的设计可用于实施将补偿器110的校正光学器件引入生物样品成像系 统10的成像光学器件的光具组中。例如，图11是实例性补偿器110的设计，根据本发 明，将第一物镜92和第二物镜112结合，用于替代在光具组中的第一物镜92。在图示 说明的实施例中，各个物镜92、112可以包含对各个表面成像所需的光学器件，例如， 支撑结构16的第一和第二表面18、20。例如，第一物镜92可以包含用于对支撑结构16 的第二表面20上的发射生物组分14的聚焦和成像所需的成像光学器件，而第二物镜112 可以包含用于对支撑结构16的第一表面18上的发射生物组分12聚焦和成像所需要的成 像光学器件加上校正光学器件。在操作中，第一物镜92可以检测支撑结构16的第二表 面20的成像。第一物镜92可以采用光具组中第二物镜112来替代，第二物镜可以在这 点上检测支撑结构16的第一表面18的成像。图11所图示说明实施例的改进可以是可以 分解和单独操作。然而，在某些情况下的缺点是具有两个完全分离的物镜92、112可能 不是省钱的方式，因为针对各个物镜92、112可能会复制一些部件。此外，在获取物体 的多个图像的实施例中，两个物镜的使用可以增加图像之间对准所需要的计算资源。在 具体的实施例中，两个表面的成像可以通过同一物镜来产生，从而提供以下所阐述的具 体优点。换句话说，针对不同表面的成像，第一物镜92不需要被去除或者采用第二物镜 112来替代。图12是另一实例性补偿器110的设计，根据本发明，它包括了插入在物镜92 和支撑结构16之间的校正器件114。校正器件114可以是，例如，盖片或其它薄片的玻 璃。正如所图示说明的那样，校正器件114可以根据所成像的具体表面16被插入在物镜 92和支撑结构16之间的光路中或被从其中去除。例如，校正器件114可以在物镜92用 于聚焦和成像支撑结构16第二表面20上的发射生物组分时从光路中被去除。相反，校 正器件114可以在物镜92用于聚焦和成像支撑结构16第一表面18上的发射生物组分时被插入光路中。图12所示说明实施例的改进是相当明显的。所需附加补偿器厚度可以 简单地被插入在光路中。典型的是，校正器件114可以设置成它不与支撑结构16或物镜 92物理接触。图13是另一实例性补偿器110的设计，根据本发明，它包括了校正环116。在 所图示说明的实施例中，校正环116可以在两种状态之间补偿。例如，第一状态118可以 对应物镜92聚焦和检测支撑结构16第二表面20上的成像，而第二状态120可以对应于物 镜聚焦和检测支撑结构16第一表面18上的成像。正是如此，当校正环116处于第一状 态118时，在物镜92中的成像光学器件可以不包括在光路中的校正光学器件。相反，当 校正环116处于第二状态时，在物镜92中的成像光学器件可以包括在光路中的校正光学 器件。尽管所图示说明的实施例只包含两个状态118、120，但事实上，校正环116可以 包括多种状态，例如，当使用支撑结构16的两个以上表面成像时，校正环116可以构成 在多种状态之间补偿，使得成像和校正光学器件可以随支撑结构16的各个表面而变化。 图13所图示说明实施例的改进是操作相当容易。例如，校正环116可以在所成像支撑结 构16不同表面所对应的状态之间进行简单调整。图14是另一实例性补偿器110的设计，根据本发明，包括了无限空间的补偿器 122。该实施例有些类似于图12所说明的校正器件114的实施例，其中，无限空间补偿 器122可以插入在光路中或从其去除。然而，在各个实施例之间的主要差异是，在图14 所示的实施例中，可以有较多的有效空间(例如，最多可有10mm，而不是图12所图示 说明的600微米)用于将无限空间补偿器122插入光路中。因此，与图12所示的校正器 件114实施例相比，图14所示的实施例允许具有更大的灵活性。除了图11至14所呈现的实施例之外，可以证明其它补偿器110设计都是有益 的。例如，可以在物镜92和支撑结构16之间插入流体型校正器。在流体型校正器的设 计中，流体型校正器可以采用流体填充，使之具有与补偿器110相同的有效作用。光学 构成流体与支撑结构16的上表面相匹配，并在没有流体空气时与支撑结构16的下表面相 匹配。这种设计可以有益证明能使自动化更加容易，因为流体可以根据所成像表面简单 的插入流体型校正器或从其取出。无论所选择的具体实施例，本文所披露的所有实施例的特征在于实施例的重复 性和自动使用的能力。实施例中的重要考虑是采用自动方式检测支撑结构16多个表面 18、20上的生物组分的成像。这根据所需的具体成像的要求，不仅允许增加成像的数 量，而且还允许提供在多个表面之间切换的更大灵活性。正如以上所详细讨论的那样，在本文阐述的装置或方法中有效使用的支撑结构 16可以具有两个或多个粘结生物组分的表面。在具体实施例中，表面是制成的表面。 业内所熟知的任一种表面都可以，包括但并不限制于，用于构成上述阵列。实例包括， 玻璃、硅、聚合物结构、塑料，及其类似材料。特别有效的表面和流动单元如PCT公报 No.WO 20071123744所讨论的，且通过应用合并与此。支撑结构的表面可具有相同或不 同的性质。例如，在图3所图示说明的实施例中，基片42对于检测方法中所使用的激发 和发射波长可以是透明的，而基片44对于激发或发射波长可以是透明也可以是不透明。 因此，表面可以采用相同材料制成，而两个或多个表面可以采用不同材料制成。具有两个或者多个表面的支撑结构可以通过表面的相互粘结或粘结其它支撑结构来制成。例如，诸如环氧树脂之类的粘结材料以糊状涂抹在平面基板上，以图案方式 形成流动单元的一个或多个通道特性。图15显示了实例性流动单元124。采用可编程自 动粘结剂涂抹机，例如，Asymtek有限公司(Carlsbad CA.)生产的Millennium0M-2010， 设计所需的粘结图案并放置在基板128下的平面表面。流动单元的厚度(和流动通道中 的交叉部分的高度)可以由放置在下基板128和上基板132之间的精确机械间隔器130来 设置。图16显示了另一实例性流动单元134。为了形成多层单元，可以包括中间透明基 板层136，它的长度短于下和上基板层128、132。较短的长度允许流体可通过只穿过一 个基板的孔138来接触两层或所有层。这一中间层136将流动单元腔体水平地分叉，并 只形成两个用于黏附生物所感兴趣分子的有效表面区域。一种用于制造这类流动单元的实例性方法140如图17所示。提供了作为上述单 元的结构基础的平面基板(方框142)。设计了上述单元所需的通道特征，例如，使用计 算机辅助设计程序来进行这种设计(方框144)。能够将采用这种方法设计的图案导出成 一个与用于驱动自动粘结涂抹系统相兼容的文件(方框146)。执行一程序，将粘结剂以 所需图案涂抹在基板上(方框148)。在粘结剂涂抹的前后，把精确机械间隔器放置在基 础基板上(方框150)。随后，将第二透明基板放置在粘结图案上，向下压紧直至下基板 完全与机械间隔器接触(方框152)。将重量或其它力施加于上基板，使之与粘结剂完全 接触。间隔器一般具有等效或稍为小于粘结层高度的高度，使得键合可以在不引起通道 特征形状的任何不利象差的情况下形成。用于黏附基板的步骤可以根据所需层的数量来 重复。可选择的是，该组件可以根据粘结剂的固化要求进行加热处理，例如，采用炉子 或UV光曝光。另一用于制造流动单元的实例性方法是使用中间层来切割所需图案替代粘结 层。用于中间层来说，特别有用的材料是硅。硅层可以加热来键合下基板128和上基板 132。使用Bisco硅HT 6135作为中间层的实例性方法如Grover等人所讨论的那样(详见 Sensors and Actuators B 89 315-323 (2003)。另外，图18图示说明了采用一个辐射源和两个检测器的实施例。来自辐射源22 的辐射可由引导光学器件30引导到聚焦光学器件32。聚焦光学器件32将激发辐射58 照射支撑结构16的第一表面18上的生物组分12。生物组分12发射荧光发射60，通过 聚焦光学器件32返回至引导光学器件30。这种向后波束允许通过引导光学器件30到检 测光学器件34，在该所示实施例中，这可以包括用于分离向后波束的波长滤光片156或 一些其它器件，以及第一和第二滤色片158、160，以便实现多个彩色通道。波长滤光片 156可以将向后波束分离成两个波束，其中一个波束通过第一滤色片158被引导到第一检 测器36，而另一个波束通过第二滤色片160被引导到第二检测器162。采用这种方法， 生物样品成像系统10可以按测序地扫描第一和第二表面18、20，首先使用来自辐射源22 的第一激发辐射58和返回的第一荧光发射60来扫描支撑结构16的第一表面18(见图18 左半部分所示)，接着使用来自同一辐射源22的第二激发辐射62和返回的第二荧光发射 64来扫描支撑结构16的第二表面20(见图18右半部分所示)。另外，图19图示说明了使用两个辐射源和两个检测器的实施例。支撑结构16 的两个表面18、20可以按测序地被扫描。然而，在该实施例中，支撑结构16的第一表 面首先使用产生第一激发发射58和第一荧光发射60的第一辐射源22来扫描((见图19左半部分所示)，而支撑结构16的第二表面20使用产生第二激发发射62和第二荧光发射 64的第二辐射源24来扫描((见图19右半部分所示)。该实施例也可以被扩展到使用任 何数量的检测器以便减小这些滤光片的移动。在上述实施例中，扫描支撑结构16的第一和第二表面18、20可以按测序地执 行，扫描支撑结构16的第一和第二表面18、20的各个步骤可以采用多种方法来执行，例 如，有可能扫描第一表面18的一个单线，随后再扫描第二表面20的一个单线，接着通过 平移支撑结构16、引导光学器件30、聚焦光学器件32或及其组合相对于激发辐射58、62 逐渐移动第一和第二表面18、20，以便重复扫描各个线的这些步骤。另外，在扫描第二 表面20的区域之前，可以先扫描第一表面18的整个区域。可以根据包括在表面18、20 上的生物组分位点12、14的具体配置的几个变量以及包括环境和操作条件的其它变量来 采取各个处理步骤。具体实施例可以允许支撑结构16的多个表面同时被激发。例如，图20图示说 明了使用两个辐射源和两个检测器的实施例。然而，在这一实施例中，支撑结构16的第 一表面18和第二表面20可以同时被扫描。这可以使用沿着激发路径的聚焦透镜164、 166、168、170和分色镜172来切换多个表面和滤光片158、160从而实现多个彩色通道来 完成。接着，该图示说明的实施例也可以被扩展到任何数量的检测器以提高吞吐量、扫 描效率并减小滤光片和其它系统组件的移动。图21图示说明了另一使用两个辐射源和两个检测器的实施例，该实施例允许同 时扫描支撑结构16的第一和第二表面18、20。然而，在该图示说明的实施例中，不仅是 在激发路径上使用聚焦透镜164、166、168、170和分色镜172，而且聚焦透镜174、176 可以在第一和第二检测器36、162的上游使用，与沿着发射路径上的滤光片158、160相 组合来切换多个表面和实现多个彩色通道。接着，该图示说明的实施例也可以被扩展到 使用任何数量的检测器以提高吞吐量和扫描效率。例如，图22图示说明了使用多个辐射源和多个检测器从而能够同时输出多个通 道且几乎没有移动的部件的实施例。在图示说明的实施例中，辐射源22和24可以由辐 射源组178和180来替代，这能够输出多个辐射源和变化波长。另外，在图示说明的实 施例中，检测器36和38可以由检测器组182和184来替代。这些检测器组182、184同 样能够检测多个彩色通道。因此，该实施例说明本发明的技术相当多的适用性可以延伸 到上述支撑结构的多个表面上的成像组件的配置范围。在上述实施例中，可以同时执行支撑结构16的第一和第二表面18、20的扫描， 激发辐射58源的聚焦可以采用多种方法来实现。例如，有可能将激发辐射58优先聚焦 在比其它表面要好的一个表面上。事实上，由于第一表面18相对于第二表面20的配置 特性，需要这样来做。然而，也可根据支撑结构16的特殊配置采用其它聚焦技术。此 外，这些不同的配置有利于首先对上表面(即，靠近辐射源的表面)进行成像，以便减小 补偿器对表面的光致退色，这是因首先对下表面(即，远离辐射源的表面)进行成像而造 成的。当这些表面是连续成像时以及当这些表面是同时成像时，都可以应用这种成像表 面的选择过程。另外，上述实施例已经说明了落射荧光成像方案，在该方案中，激发发射从上 方引导到支撑结构16的表面且接受来自相同一侧的返回荧光辐射。然而，本发明技术也可以被扩展到其它结构。例如，这些技术也可用于结合TIR成像，从而以一定角 度范围的倾斜角度引导辐射从侧面照射支撑结构的表面，从而传递在支撑结构内的激 发辐射或从它周围的棱镜将辐射传递到支撑结构内。TIR技术的应用如美国专利公报 No.2005/0057798所讨论的那样，通过引用合并与此。这种技术促成来自部件的荧光发 射，以向外传递用于成像，同时反射的激发辐射通过另一侧输出，这与其进入时通过那 一侧相反，这里，可以再次对多个表面上的生物组分按测序地或同时成像。例如，在图23中，TIR生物样品成像系统186如图所示。可以使用支撑结构 188，它包括多个包含生物组分的流动通道190。例如，支撑结构188可以是流动单元， 通过流动单元的试剂、清洗液和其它流体可以使用流动通道190引入，从而与黏附流动 单元表面的发射部件相接触。支撑结构188可以由棱镜192支撑。在TIR生物样品成像 系统186中，辐射源194可以通过棱镜192从支撑结构188的侧面输出辐射波束196。辐 射波束196可以，例如，被引导到支撑结构188的流动通道190之一的底表面，从而激发 邻近表面的发射组分。正如以下将进一步详细讨论的那样，只要辐射波束196的倾斜角度在一定的角 度范围之内(正如美国专利公报2005/0057798所讨论的)，辐射波束196中的部分将被 底表面反射，而来自表面键合发射部件的分离荧光发射波束将引导到聚焦光学器件198。 一般来说，良好校正的辐射波束用于防止波束内的角度散开，从而防止全内反射的不必 要的障碍。荧光发射波束可以通过聚焦光学器件198、引导光学器件200和检测光学器件 202来传递，从而将波束引导到检测器204。聚焦光学器件198、引导光学器件200、检 测光学器件202和检测器204可以非常相同于上述落射荧光技术的方法来操作。在TIR 生物样品成像系统186中，聚焦光源206可以用作为来自辐射源194的分离光源，将其光 学聚焦在将成像的特定表面上。例如，聚焦光源206可以被引导到引导光学器件200， 引导光学器件再将其引导到聚焦光学器件198，聚焦光学器件用于将系统聚焦在支撑结构 188的具体表面上。TIR生物样品成像系统186也可以包括平移系统208，用于以一个或多个维度来 移动支撑结构188和棱镜192。平移系统208可以用于将辐射源194聚焦、重定向在支 撑结构188的不同区域上，以及用于将支撑结构188和棱镜192移动到加热/冷却站点 210。加热/冷却站点210可以用于在成像前后加热和冷却支撑结构188。另外，控制/ 处理系统212可以用于控制辐射源194、聚焦光源206以及加热/冷却站点210的操作， 控制聚焦光学器件198、平移系统208和检测光学器件202的移动和聚焦，以及控制检测 器204的信号采集和处理。如上所述，成像的TIR方法可以用于引导来自支撑结构188侧面的辐射波束 196，如图24所图示说明。支撑结构188的各个流动通道190可以包括底表面214和上 表面216，以及发射部件可以选择性地黏附一个或两个表面。在所图示说明的实施例中， 辐射波束196引导到支撑结构188的流动通道之一的底表面214。部分辐射波束196可 以从流动通道190的底表面214反射，正如反射光源218所指示的。然而，只要辐射波 束196的倾斜角度在一定角度范围之内，分离的荧光发射波束220可以是从发射部件发射 到聚焦光学器件198的，这在所说明的实施例中是透镜物镜222。确实，将辐射波束196 引导到支撑结构188的流动通道190的底表面214是TIR成像方法的典型实施方法。然而，这样做，从支撑结构188的流动通道190的上表面216所收集到的图像数据可以被忽略。因此，辐射源194和/或支撑结构188和棱镜192的取向可以进行调整，从而允 许辐射波束196不再引导到支撑结构188的流动通道190的底表面214上，正如图25所 图示说明。在所图示说明的实施例中，对辐射波束196进行取向，使得辐射波束196通 过棱镜192和支撑结构188直至结束支撑结构188的空气/玻璃界面224，在这点上，辐 射波束196重引导到支撑结构188的流动通道190的上表面216上。在这点上，部分辐 射波束196可以反射到支撑结构188的另一空气/玻璃界面224。然而，分离的荧光发射 波束220可以从上表面216上的发射部件发射到透镜物镜222。使用这种技术，支撑结 构188的流动通道190的上表面216可以使用TIR成像方法来成像。这在效果上可以允 许两倍的图像数据输出，用于基于簇的测序应用，同时还保持诸如表面覆盖、簇创建和 测序的其它变量相同。为了完成该支撑结构188流动通道190的上表面216的TIR成像，辐射波束196 以非扰动方式达到支撑结构188的空气/玻璃界面224。这样做，辐射波束196就不会 首先与邻近流动通道190的发射部件相接触。这样做，任一辐射源196都可以引导到邻 近流动通道190附近或邻近流动通道190可以与支撑结构188材料进行系数匹配。在实 施例中，流动通道190可以在支撑结构188中相互隔开，在流动通道190之间保留足够的 空间，用于辐射波束196通过。然而，采用这种方法隔开的流动通道190可以显著地减 小用于成像的发射部件的数量。因此，在其它实施例中，有可能通过采用系数匹配的流 体来填充另一些流动通道190得到相同的效果。这样做可以允许更加容易地将辐射波束 196引导到支撑结构188流动通道190的上表面216。用这种方法也有可能引导辐射波束196，它会从支撑结构188流动通道190的多 个上表面216反射，如图26所图示说明。为了实现这，流动通道190的间隔可以与辐 射波束196的角度相匹配，使得辐射波束196能够通过流动通道190，使之达到以非扰动 方式达到支撑结构188的空气/玻璃界面224，同时也能够在流动通道190的上表面216 和支撑结构188的空气/玻璃界面224之间来回反射。在一些实施例中，镜子226或其 它适用反射的材料都可以在一些流动通道190之内使用，使得该多次反射的技术更加容 易。在任何事件中，假定N个流动通道190，以这种方式仅仅只有可能成像N-2个流动 通道190的上表面216，由于使用这些技术不能涉及支撑结构188另一侧的外部流动通道 190的事实。然而，棱镜192和/或支撑结构188的修正可以允许成像这些最外面流动通 道190的上表面216。例如，支撑结构188可以设计成放置在棱镜192中，以便允许辐射 波束196能通过支持结构188的侧面。在一些实施例中，正如以上参照图23所简要描述的那样，支撑结构188可以移 动到加热/冷却站点210，例如，通过平移系统208的操作来实现。加热/冷却站点210 可以构成在成像前后加热和冷却支持结构188。事实上，加热/冷却站点210可以构成加 热和冷却支撑结构188的上表面228和底表面230，如图27所图示说明。确实，支撑结 构188的所有表面都可以在加热/冷却站点进行加热或冷却。采用这种方式，还有可能通 过将流动通道的一个或多个表面直接与加热或冷却设备相接触来加热和冷却支撑结构188 的流动通道190的上表面216和底表面214。当然，这可以更方便于在支撑结构18流动通道中的生物组分的发展，也因此更加方便于成像。尽管本文已经呈现了有关TIR成像 方法的加热/冷却站点210的使用，但是也可以使用加热/冷却站点210来加热和冷却结 合本文所讨论的落射荧光成像方法所使用的支撑结构的多个侧面。在具体实施例中，本发明使用测序加合成(SBS)的方法。在SBS中，四个荧 光标记的改性核苷酸转移酶用于确定在诸如流动单元之类支撑结构表面上呈现核酸的核 苷酸转移酶的序列。本文所阐述的装置和方法所能采用的实例性的SBS系统和方法如美 国专利 No.7057026 ；美国专利公报 Nos.2005/0100900，2006/0188901, 2006/0240439, 2006/0281109 和 2007/0166705 ；以及 PCT 公报 Nos.W005/065814, W006/064199 和 W007/010251所讨论；通过应用合并与此。在本文所阐述的装置和方法的具体使用中，通过整个测序处理过程中大的几个 重复周期，来处理包含阵列排列核酸的流动单元。准备核酸，使得它包括接近未知目标 序列的低(聚)核苷酸基板。为了初始化SBS测序周期，将一个或多个不同标记的核苷 和DNA聚合酶流入到流动单元内。单个核苷可以一次添加，或在测序处理流程中使用的 核苷可以专门设计成拥有可逆终止性质，于是允许测序反应的各个周期能在所有四个标 记核苷(A，C，T，G)存在时同时发生。随后核苷添加，表面上的特征可以成像，以确 定结合核苷的标识(基于对核苷的标记)。随后，添加试剂至流动单元，以去除阻塞3’ 终点(如果需要)并从各个结合基板上去除标记。随后在重复这个周期，并在多个化学 反应周期中读取各簇的序列。也可以使用其它测序方法，这些方法使用周期反应法且各个周期包括将一种或 多种试剂滴如在表面上的核酸中并成像键合核酸的表面，例如，采用捆绑的亚测序和测 序。有用的亚测序反应如美国专利No.7,244,559和美国专利申请公报No.2005/0191698 所讨论，通过应用合并与此。捆绑反应的测序如Shendure等人所讨论的(详见Science 309 1728-1732(2005))和美国专利Nos.5,599,675和5,750,341所讨论的，通过引用合并 与此。本文所讨论的方法和装置用于检测业内所熟知的基因分型化验、表达分析 和其它化验所使用的表面上发生的特征也是十分有效的，正如美国专利申请公报 Nos.2003/0108900, US 2003/0215821 和 US 2005/0181394 所讨论的那样，通过引用合并与此。在本文图示说明和讨论了本发明部分特征的同时，对业内熟练的技术人士来 说，可以有很多改进和变化。因此，应该理解的是，所附权利要求书旨在覆盖在本发明 实质性精神内的所有这类改进和变化。
权利要求
1.一种用于对生物样品进行成像的方法，包括(a)使用检测器来检测设置在流动单元的第一表面上的生物样品的第一发射组分所发 出的辐射，其中，所述流动单元被安装在成像站上；(b)在检测器和流动单元之间插入校正光学器件；(c)使用检测器和校正光学器件来检测设置在流动单元的第二表面上的生物样品的第 二发射组分所发出的辐射，其中，第一和第二表面处于一种排列方式中由此使得这两个 表面之一被设置在检测器和这两个表面中的另一个表面之间，其中，所述校正光学器件 减小在这两个表面之一处因所述排列方式而产生的检测象差；以及(d)在使流动单元保持在成像站上的同时重复步骤(a)至(C)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一表面被设置在检测器和第二表面 之间。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在这两个表面之间有流体，并且所述校正 光学器件减小因该流体而所产生的象差。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述检测器初始被配置用于第二表面上的 衍射限制检测，并且所述校正光学器件被配置用于第一表面上的衍射限制检测。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述象差包括球面象差。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一表面被设置在辐射源和第二表面 之间。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)包括将一校正器件插入在物 镜和流动单元之间，其中所述物镜被设置在检测器和流动单元之间。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)包括将一校正透镜插入在检 测器和物镜之间，其中所述物镜被设置在检测器和流动单元之间。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)和(c)包括获取这些表面的 图像。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)和(c)包括将辐射线聚焦 在包含第一或第二发射组分的第一或第二表面上的区域。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所发出的辐射是使用落射荧光激发来检 测的。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，激发辐射是通过全内反射激发而被引导至第一和第二表面。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述激发辐射和流动单元被配置成产生 用于激发第一表面和第二表面的全内反射。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二发射组分包括核酸样品 的荧光标记核酸。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二发射组分包括分别在第 一和第二表面上的特征阵列中的分开的特征。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述分开的特征各自包括一群完全一样 的分子。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所检测到的辐射的色移曲线与步骤(b)中所检测到的辐射的色移曲线相同。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的检测的场曲率与步骤(b) 中的检测的场曲率相同。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的检测的场失真与步骤(b) 中的检测的场失真相同。
20.一种用于检测多表面流动单元上的辐射的成像系统，包括多表面流动单元，具有设置在流动单元的第一和第二表面上的生物样品的第一和第 二发射组分；光具组，包括物镜、成像光学器件和校正光学器件，成像光学器件被配置成通过物 镜将光具组聚焦在第一发射组分上，校正光学器件被配置成将光具组聚焦在第二发射组 分上并且配置成减小在第一或第二发射组分处的检测的象差；辐射源，配置成将激发辐射引导至第一和第二发射组分；检测光学器件，配置成通过光具组来捕获从第一和第二发射组分返回的发出的辐 射；以及检测器，用于检测所捕获到的辐射。
21.如权利要求20所述的成像系统，其特征在于，配置成将光具组聚焦在第二发射组 分上的校正光学器件的部件是与配置成减小在第一或第二发射组分处的检测的象差的校 正光学器件的部件相互分离的。
22.如权利要求20所述的成像系统，其特征在于，所述校正光学器件包括配置成插入 在物镜和流动单元之间的校正器件。
23.如权利要求20所述的成像系统，其特征在于，所述校正光学器件包括配置成插入 在物镜和检测器之间的校正透镜。
24.如权利要求20所述的成像系统，其特征在于，所述辐射源被配置成以几个不同的 波长将激发辐射引导至第一和第二发射组分，并且检测光学器件和检测器被配置成响应 于每个波长来捕获并检测返回的发射的辐射。
25.如权利要求20所述的成像系统，其特征在于，所述流动单元包括在内部容积中且 与生物样品相接触的流体。
26.如权利要求20所述的成像系统，其特征在于，所述第一和第二发射组分包括来自 核酸样品的荧光标记核酸。
27.如权利要求20所述的成像系统，其特征在于，所述第一表面被设置在辐射源和第 二表面之间。
全文摘要
揭示了一种用于对支撑结构多个表面上的生物样品进行成像的系统和方法。支撑结构可以是例如流动单元，允许试剂流体通过流动单元流动并与生物样品相互作用。来自至少一个辐射源的激发辐射可以用于激发在多个表面上的生物样品。采用这一方式，荧光发射辐射可由生物样品来产生并由检测光学器件和至少一个检测器来陆续采集和检测。所采集和检测到的荧光发射辐射可随后用于产生图像数据。多个表面的成像可以陆续或同时来完成。另外，本发明的技术可以采用任何类型的成像系统。例如，落射荧光和全内反射(TIR)方法可从本发明技术中获益。另外，为了进行成像，生物样品以随机特殊图案呈现在支撑结构的表面上并不一定要处于已知的位置上。
文档编号G01N21/05GK102016546SQ200980116690
公开日2011年4月13日 申请日期2009年5月5日 优先权日2008年5月5日
发明者D·比尔曼, J·布莱恩特, 冯文毅 申请人:伊鲁米那股份有限公司
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