专利名称：使用胶乳粒子的免疫测定方法
技术领域：
本发明涉及使用胶乳粒子的免疫测定方法。
技术背景
常规地，荧光检测已经广泛地用作用于生物测量等的简单和高度敏感的测量方 法。荧光检测是一种涉及以下的方法使用具有特定波长的激发光，照射被认为含有待 测物质的样品，所述待测物质当被具有此特定波长的光激发时发射荧光；以及在此时检 测荧光，从而确认该待测物质的存在。此外，还广泛地进行下列步骤当待测物质不是 荧光物质时，使与待测物质特异性结合的荧光染料标记的物质与样品接触；以及然后以 与上述相同的方式检测荧光，从而确认已经发生了结合；即，存在待测物质。
此外，就所述荧光检测而言，在JP专利公开号10-307141 (1998) A(Kokai)等 中提出了使用基于等离子体共振的电场增强效应的方法来提高灵敏度。对于等离子体共 振的产生，此方法包括提供在透明载体的指定区内设置有金属层的传感器芯片，使激发 光关于载体和金属膜之间的边界以大于反射的总角度的指定角度从与其上形成金属层的 (载体)的面相反的面的一侧进入；通过用激发光照射在金属层上生成表面等离子体；并 且由此使用电场增强效应来激发荧光物质。发明内容
上述的常规免疫诊断仍然是存在问题的，因为不能获得充分的信号值(AS( = 信号值-噪声值))。本发明要达到的一个目的是解决上述常规技术的问题。具体地，本 发明要达到的一个目的是提供一种免疫测定方法，通过该方法在使用具有高生产再现性 的胶乳粒子的免疫诊断中可以实现足够高的信号AS值(=信号值-噪声值)，并且提供 一种生产所述胶乳粒子的方法。
作为为了达到上述目的而进行的深入研究的结果，本发明人已经发现可以通 过将胶乳粒子的表面上存在的COOH基团的量调节为40-300 μ eq/g而提供具有高生产再 现性的胶乳粒子；并且可以进行免疫测定，通过该免疫测定，使用所述胶乳粒子可以实 现足够高的信号AS值(=信号值-噪声值)。基于这些发现已经完成了本发明。
本发明提供了一种测定方法，其包括以下的步骤(1)使待测物质与结合物质 标记的荧光胶乳粒子接触或竞争，通过使结合物质与荧光胶乳粒子结合而获得所述结合 物质标记的荧光胶乳粒子，以及( 测量来自所述结合物质标记的荧光胶乳粒子的荧 光，其中
(a)所述荧光胶乳粒子是通过将荧光物质加入至胶乳粒子而获得，所述胶乳粒子 的特征在于所述胶乳粒子的表面上存在的COOH基团的量为40 μ eq/g至300 μ eq/g,或
(b)所述荧光胶乳粒子包含胶乳粒子和荧光物质，其特征在于所述荧光胶乳粒子 的表面上存在的COOH基团的量为40 μ eq/g至300 μ eq/g。
优选地，所述胶乳是通过无皂聚合获得。CN 102023209 A说明书2/11 页
优选地，所述胶乳是包含苯乙烯作为单体的共聚物。
优选地，所述胶乳是苯乙烯、和丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物。
优选地，所述乳胶粒子和/或荧光胶乳粒子的平均粒度(particle size)为 150nm-330nm。
优选地，所述乳胶粒子和/或荧光胶乳粒子的平均粒度为190nm-270nm。
优选地，所述结合物质是针对待测物质的抗体。
优选地，在步骤O)中，荧光是通过表面等离子体荧光测定法或落射荧光测定 法来测量。
本发明进一步提供了一种生产胶乳粒子的方法，其中所述胶乳粒子的表面上存 在的COOH基团的量为40 μ eq/g至300 μ eq/g,所述方法包括通过将聚合引发剂逐滴 地加入至包含苯乙烯和丙烯酸或甲基丙烯酸的含水悬浮液中而进行聚合，其中所述苯乙 烯的浓度为1.4M以下。
优选地，在加入所述聚合引发剂之前将所述含水悬浮液升高至75°C -95°C。
优选地，所述聚合引发剂是过硫酸钾。
优选地，在交联剂的存在下进行聚合。
根据本发明，可以通过将胶乳粒子的表面上的COOH基团的量调节为40 μ eq/g 至300 μ eq/g而提供可以在免疫测定中发挥充分的性能的胶乳粒子。在使用本发明的荧 光胶乳粒子的免疫测定中，由于非特异性吸附造成的本底非常低，使得可以对信号值进 行高灵敏度评价。此外，本发明的胶乳粒子是有优势的，因为其生产再现性很高。
图1显示了引入羧酸的量和粒度之间的关系([M] = 2.9M)。
图2显示引入羧酸的量和粒度之间的关系。
图3显示使用荧光胶乳粒子的SPF免疫测定的结果。
图4显示在引入荧光染料之前和之后测量粒度分布的结果。
图5显示在引入荧光染料之前和之后测量ζ电位(Zetapotential)的结果。
具体实施方式
本发明将进一步详细地描述如下。
(1)本发明中使用的胶乳粒子
本发明中使用的胶乳粒子的特征在于表面上的COOH基团的量为40 μ eq/g至 300 μ eq/g。胶乳粒子的表面上的COOH基团的量可以通过测量电导率来测量。具体 地，胶乳表面上COOH基团的量可以如下测定通过根据Journal of Colloid and Interface Science (胶体和界面科学杂志)49 (3)，第425-432页，1974中所述的方法使用pH计(例 如，pH计D-54(HORIBA，Ltd.))进行电导滴定。具体地，如下所述进行测定。将重 量已经准确测量的胶乳样品用去离子水稀释。将一套pH计和Thomas-Serfass电导率装 置的电极两者放置在稀释的胶乳分散液中。将胶乳搅拌，然后用稀NaOH溶液将胶乳样 品的pH调节至pH 11.5 士 0.2。该样品用0.42IN H2SO4每次增加0.50ml而进行滴定。电 导率和pH作为耗酸量的函数进行分析直至pH达到约2.4。4
另外，范围在40yeq/g至300yeq/g的COOH基团的量与范围在40ymol/g至 300 μ mol/g的COOH基团的量的含义是相同的。
胶乳物质的具体实例包括聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯 酸共聚物、苯乙烯_(甲基)丙烯酸缩水甘油酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸酯共聚物、 甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯 共聚物和聚醋酸乙烯酯-丙烯酸酯。胶乳优选是含有至少苯乙烯作为单体的共聚物，并 且特别优选是苯乙烯、和丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物。
不特别地限制生产胶乳的方法，并且胶乳可以通过任何聚合方法生产。然而， 由于当在抗体标记期间存在表面活性剂时抗体的固定化变得很困难，因此优选无皂聚合 用于胶乳的生产。
胶乳粒子的平均粒度的差异取决于粒子材料、用于测定待测物质的浓度范围、 测量仪器等。平均粒度优选为150nm_330nm，并且进一步优选190nm_270nm。
就胶乳粒子的平均粒度和表面COOH基团的量之间的关系而言，胶乳粒子尺寸 通常取决于表面COOH基团的量。表面COOH基团的量越低，平均粒度越高。这是因 为羧酸的量越�。喝榱Ｗ又涞牡绾膳懦庠叫�。此外，这特别是因为，在无皂聚合系 统中，胶乳变得难以在水中稳定地存在。因此，对于本发明中的具有优选范围内的粒度 以及具有优选范围内的表面COOH基团的量的胶乳粒子的合成，优选地借助于如下所述 的生产胶乳粒子的工艺或基于其的方法来进行聚合。
(2)生产胶乳粒子的工艺
在本发明中使用的具有40 μ eq/g至300 μ eq/g的COOH基团(存在于其表面 上)的量的胶乳粒子，根据特别优选的实施方案，包含苯乙烯和丙烯酸或甲基丙烯酸。 此外，所述胶乳粒子可以通过将聚合引发剂逐滴地加入至含水悬浮液(其中苯乙烯的浓 度为1.4M以下)中以便进行聚合而产生。不优选使用其中苯乙烯的浓度高于1.4M的含 水悬浮液，因为在聚合系统中生成的胶乳粒子彼此结合，导致生成的胶乳具有增加的平 均粒度。
此外，含水悬浮液的温度优选地在加入聚合引发剂之前升高至75°C-95°C。通 过所述温度升高，引发剂在其加入的同时被分解，并且然后马上在聚合系统中生成自由 基，使得可以引发单体的消耗。优选这样的温度调节，因为其具有使胶乳粒度均等化的 作用。
不特别地限制用于本发明中的聚合引发剂，只要使用其可以进行聚合，并且可 以使用已知的聚合引发剂。例如，可以使用过硫酸钾、2，2’ -偶氮二异丁腈、2， 2’ -偶氮二(2，4-二甲基)戊腈、2，2，-偶氮二 4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈、过氧 化苯甲酰、2，4-二氯过氧化物、过氧化碳酸异丙酯、氢过氧化枯烯、过氧化月桂酰等进 行聚合。特别优选地，可以使用过硫酸钾进行聚合。在此使用的聚合引发剂的量优选为 单体组合物的约0.1重量％ -5重量％。
此外，可以在交联剂的存在下进行聚合。在此可以使用的交联剂的实例包括， 但不限于，二乙烯基苯和1，4 丁二烯。
(3)荧光胶乳粒子
本发明中使用的胶乳粒子优选是荧光物质。当如上面O)中所述通过聚合获得的胶乳本身是发荧光的，所述胶乳的粒子可以直接用作荧光胶乳粒子。当通过聚合获得 的胶乳是不发荧光的，则可以通过将荧光物质(例如，荧光染料)加入至胶乳中而生成 荧光胶乳粒子。具体地，例如，可以通过如下步骤产生荧光胶乳粒子将荧光染料加入 至含水和水溶性有机溶剂的胶乳粒子的溶液中，然后例如搅拌该混合物。在胶乳粒子的 溶液中胶乳的浓度优选为0.1重量％-10重量％。该溶液优选地含有电解质。作为电解 质，优选NaCl，并且溶液中电解质的浓度优选为lmM-500mM。此外，作为胶乳粒子溶 液中包含的水溶性有机溶剂，优选四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰 胺(DMAc)或丙酮。水溶性有机溶剂对水的百分比优选大约为10% -80%。
如本文所使用的术语“含有胶乳粒子和荧光物质的荧光胶乳粒子”指以下两 者当如上面O)中所述通过聚合获得的胶乳本身发荧光时的荧光胶乳粒子；以及当通 过聚合获得的胶乳不发荧光时通过加入荧光物质(例如，荧光染料)至胶乳而获得的荧光 胶乳粒子。
(4)结合物质标记的胶乳粒子
本发明的胶乳粒子可以通过使结合物质与胶乳粒子结合而用在荧光测定中。在 此，本文使用的术语“结合物质”可以指经由待测物质与传感器部件结合的物质或与待 测物质竞争地结合传感器部件的竞争性物质。例如，当抗原是用于检测抗原-抗体反应 的荧光测定中的待测物质并且通过夹心法进行测定时，固定层由与抗原特异性结合的一 抗(固定化抗体)构成，并且结合物质由与所述抗原特异性结合的二抗构成。此外，当 通过竞争法进行测定时，结合物质可以由与抗原特异性结合的抗体或与抗原竞争性地结 合固定化抗体的竞争性抗原构成。
当结合物质是与抗原特异性结合的二抗时，不特别地限制与抗原特异性结合的 所述抗体的实例。例如，可以使用由用待测物质免疫的动物的血清制备的抗血清、从抗 血清纯化的免疫球蛋白级分、通过使用用待测物质免疫的动物的脾细胞进行细胞融合获 得的单克隆抗体，或其片段[例如，F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv|。所述抗体可以通过常 规方法制备。此外，可以在此使用的此类抗体可以是修饰的抗体诸如嵌合抗体、市售的 抗体和通过已知方法从动物血清或培养上清液中制备的抗体。可以使用片段化抗体，无 论其动物种属、亚型等。例如，可以在本发明中使用的抗体是来自小鼠、大鼠、山羊、 兔、绵羊等的抗体。其具体实例包括小鼠IgG、小鼠IgM、大鼠IgG、大鼠IgM、兔IgG、 兔IgM、山羊[gG、山羊IgM、绵羊IgG和绵羊IgM。所述抗体可以是多克隆的或单克隆 的。片段化抗体是由以下制备的分子完整抗体，其具有至少一个抗原结合位点。其具 体实例包括Fab和F(ab' )2。这些片段化抗体是通过用酶，或化学处理，或基因工程技 术处理而获得的分子。
下一步，描述用于将抗体与荧光胶乳结合的方法。将含有抗体的溶液加入至荧 光胶乳粒子的水溶液中，然后搅拌该混合物。随后，将WSC(产品号01-62-0011，Wako 纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical hidustries，Ltd.))水溶液加入至该溶液中，然后搅拌生成物。进一步将甘氨酸水溶液加入至该溶液中，搅拌该溶液，然后通过离心沉 淀荧光胶乳粒子。去除上清液，加入PBS溶液，然后使用超声洗涤机将荧光胶乳粒子再 分散。通过进一步离心去除上清液后，加入含BSA的PBS溶液，导致荧光胶乳粒子 再分散，使得可以获得抗体结合的荧光胶乳粒子的溶液。
(5)测定模式
本发明进一步涉及测定方法，该测定方法包括以下步骤(1)使待测物质与结 合物质标记的荧光胶乳粒子接触或竞争，所述结合物质标记的荧光胶乳粒子是通过使结 合物质与本发明的荧光胶乳粒子结合而获得；以及( 测量上述结合物质标记的荧光胶 乳粒子的荧光。
根据本发明的测定方法应该根据最可能宽的概念来理解，包括检测待测物质的 存在与否或测量(即，测定)待测物质的量。测定的实例不受限制地包括普遍已知的免 疫学测量方法。之后，下面将描述夹心法和竞争法作为本发明的测定的具体实施方案， 但本发明不限于此。
(夹心法)
使用夹心法，例如，待测物质可以通过下列的步骤来测量，但测量不限于此。 首先，预先制备具有对待测物质(抗原)的特异性的一抗和二抗。下一步，一抗固定在固 相诸如基底上，然后使二抗与荧光胶乳粒子结合，从而制备抗体标记的荧光胶乳粒子。 随后，可以包含待测物质(抗原)的测试样品(或其提取物)和抗体标记的荧光胶乳粒 子在基底上彼此接触。当测试样品中存在待测物质时，待测物质和抗体标记的荧光胶乳 粒子之间以及待测物质和基底之间发生抗原-抗体反应。所述抗原抗体反应可以类似于 通常的抗原-抗体反应的方式进行。结果，当测试样品中存在待测物质时，固定在基底 上的一抗、待测物质(抗原)和与荧光胶乳粒子结合的二抗形成免疫复合物。在夹心法 中，在固定在基底上的一抗、待测物质(抗原)和结合荧光胶乳粒子的二抗之间的反应结 束后，去除不形成上述免疫复合物的二抗，紧接着洗涤。作为荧光强度来检测形成上述 免疫复合物的程度，使得可以测量待测物质等的浓度。另外，在荧光强度和待测物质的 浓度之间存在正相关。
(竞争法)
随着竞争法的使用，例如，可以通过下列的步骤测量待测物质，但所述测量并 不特别地限于此。已知竞争法是一种用于检测不能被夹心法检测到的低分子量化合物的 抗原的技术。
首先，预先制备具有对待测物质(抗原)的特异性的一抗。然后使一抗与荧光 胶乳粒子结合。将本身与一抗具有亲和性的(待测)物质或具有类似于待测物质的位点 和类似于待测物质的一抗所针对的表位的化合物固定在固相诸如基底上。然后可以包含 待测物质(抗原)的测试样品(或其提取物)和一抗结合的荧光胶乳粒子与基底接触。 当测试样品中不存在待测物质时，在基底上发生一抗和本身与一抗具有亲和性的(待测) 物质或具有类似于待测物质的一抗所针对的表位的化合物之间的抗原抗体反应。另一方 面，当存在待测物质时，待测物质(抗原)结合一抗。因此，抑制了随后和本身与一抗 具有亲和性的(待测)物质或具有类似于待测物质的位点并且具有类似于待测物质的一抗 所针对的表位的化合物的(基底上的)抗原-抗体反应。因此，由此抗原-抗体反应导 致的结合没有发生。在与一抗具有亲和性的固定物质和结合荧光胶乳粒子的一抗之间的 反应结束后，去除没有形成如上所述的免疫复合物的荧光胶乳粒子。随后，将形成上述 免疫复合物的程度作为荧光强度检测，使得可以测量待测物质等的浓度。
备选地，根据另一个实施方案，当通过竞争法进行测定时，使“待测物质本身，或具有类似于待测物质的位点和具有类似于待测物质的一抗所针对的表位的化合 物”与荧光胶乳粒子结合。具有对待测物质(抗原)的特异性的一抗可以固定在固相诸 如基底上。此外在此情况下，可以通过以与如上所提及的相同方式进行抗原-抗体反应 来测量待测物质等的浓度。
(6)检测荧光的方法
不特别地限制本发明中的检测荧光的方法。例如，可以使用能够检测荧光强度 的仪器来检测荧光强度。具体的实例是酶标仪(microplatereader)或用于使用表面等离子 体激发的表面等离子体荧光6PF)检测的生物传感器。荧光强度的检测通常在在抗原-抗 体反应后指定的时间段内完成，诸如在几分钟至几小时内完成。通过借助于荧光强度检 测形成上述免疫复合物的程度，可以基于荧光强度和待测物质的浓度之间的关系来测定 待测物质的浓度。荧光测量的类型可以是平板读取器测量方式或流动测量方式。另外， 可以借助于具有高于使用落射光(epi-illumination)激发的荧光检测法(此后，称为“落射 荧光法”)时的灵敏度的测量方式进行使用表面等离子体激发的表面等离子体荧光6PF) 检测。
可以用作上述表面等离子体荧光6PF)生物传感器的传感器，例如，如JP专利 申请号2008-249361A(Kokai)中所公开的，包括由具有指定波长的激发光可以穿透的材 料形成的光波导、在光波导的表面上形成的金属膜、用于生成光束的光源、使光束以一 定的入射角(通过该入射角朝向光波导和金属膜之间的边界生成表面等离子体)进入光波 导的光学系统以及用于检测由于被表面等离子体增强的倏逝波的激发而生成的荧光的荧 光检测装置。
使用本发明的荧光粒子的表面等离子体荧光6PF)检测系统不同于胶乳凝集 法。在胶乳凝集法中，胶乳试剂中的抗体敏化的胶乳和样品中的抗原彼此结合，从而由 于抗体反应而发生凝集。生成的凝集物随着时间变化而增加，然后用远红光照射凝集 物。基于由此获得的每单位时间吸光度的变化来定量抗原浓度的方式是胶乳凝集法。 作为免疫比浊法的结果，由抗原-抗体反应生成的凝集物非常�。沟迷诳乖啃〉那� 况下 难以光学检测低浓度范围内的凝集程度。因此，常规地在其中用抗体敏化相对大 (ym尺寸)的胶乳粒子的胶乳凝集法中，抗原-抗体反应以明显的胶乳凝集的形式出 现。因此，即使当低浓度范围内的抗原量很小时，出现大的凝集物并且可以光学俘获 凝集物中甚至微小的变化。所述方法的实例包括其中凝集物的形成被检测为浊度的增加 的比浊法、其中凝集物的形成被检测为粒度分布或平均粒度的变化的方法以及积分球比 浊法，该方法包括使用积分球测量由于形成凝集物而导致的前向散射光的变化，然后比 较其与透射光的强度的比值。上述测量方法的实例包括速率分析法，该方法包括在不同 的时间点获得至少两个测量值，然后基于这些时间点之间出现的差异(增加)获得凝集 程度(即，增加速率)，以及终点分析法，该方法包括通常在被认为是反应终点的一个 时间点获得一个测量值，然后基于该测量值获得凝集程度。用于临床实验室检验的自动 装置(其适合用于免疫学胶乳凝集反应测量)的实例，包括市售的自动分析仪诸如日立 (Hitachi) 7070、7150、7170、LPIA-A700 和 S500。
本发明进一步通过下面的实施例来具体的说明，但本发明并不限于这些实施 例。8实施例
无皂聚合优选地用于产生粒子，因为当抗体标记过程中存在表面活性剂时难以 进行抗体固定化。然而，当粒度为200nm以下时难以进行无皂聚合。此外，采用300nm 以上的粒度，由于抗体标记后凝集而不可能进行评价。因此，采用缩小至200nm-250nm 的粒度进行实验。结果显示在下面的实施例中。
在下面的实施例中，使用ZETA SIZERMysmex)Nano系列测量粒度。将样品制 备为具有0.01%的浓度，然后使用IOmM磷酸盐pH 7.0 (SOOyL)测量。参数如下。聚 苯乙烯胶乳RI 1.590 ；吸光度0.01 ；溶剂水；温度25°C ；粘度0.8872cP ； RI 1.330。
此外，胶乳中羧酸的量是通过根据Journal of Colloid and Interface Science(胶体和界面科学杂志)49 (3)，425-432页，1974中所述的方法使用pH计D44 (HORIBA，Ltd.) 进行电导滴定来测定。
实施例1 胶乳粒子的产生
使用苯乙烯、丙烯酸和过硫酸钾(KPS)检验无皂聚合的结果描述如下。
(1)检验引发剂(过硫酸钾KPS)的量
图1显示了粒子表面上羧酸的量和粒度([Μ] = 2.9M)之间的关系。在 2.9mol · Ll的单体浓度下，粒度的测定取决于粒子表面上羧酸的量，而不依赖于引发剂 的量(引入[M]/[I]的比值)。
(2)胶乳粒子(直径51 Inm ；以及COOH基团为146 μ mol/g)的合成实施例
苯乙烯(Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) (30g) (288mmol)禾Π lg(56mol)丙烯酸(Wako 纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))悬浮并溶解在IOOmL milli-Q水中。向其加入通过在85°C下将0.2g KPS (Wako 纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))溶解在 IOmL 中制 备的水溶液，紧接着在65°C和250rpm下搅拌6小时。随后，以8000rpm离心3小时， 进行3次，然后生成物最终在milli-Q水中再分散。
(3)待引入的单体(苯乙烯)的浓度的检验
图2显示了待引入的单体(苯乙烯)的浓度的检验结果。当引入的浓度降低时， 引入的羧酸的量�。⑶矣锌赡懿哂�275nm的粒度的粒子。
(4)胶乳粒子的产生
产生具有下表1中列举的物理性质的胶乳粒子的方法描述如下。
表1 [
权利要求
1.一种测定方法，所述测定方法包括以下步骤(1)使待测物质与结合物质标记的 荧光胶乳粒子接触或竞争，所述结合物质标记的荧光胶乳粒子是通过使结合物质与荧光 胶乳粒子结合而获得，以及(2)测量来自所述结合物质标记的荧光胶乳粒子的荧光，其 中(a)所述荧光胶乳粒子是通过将荧光物质加入至胶乳粒子而获得，所述胶乳粒子的特 征在于所述胶乳粒子的表面上存在的COOH基团的量为40 μ eq/g至300 μ eq/g,或(b)所述荧光胶乳粒子包含胶乳粒子和荧光物质，其特征在于所述荧光胶乳粒子的表 面上存在的COOH基团的量为40 μ eq/g至300 μ eq/g。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述胶乳是通过无皂聚合获得。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述胶乳是包含苯乙烯作为单体的共聚物。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述胶乳是苯乙烯和丙烯酸或甲基丙烯酸的 共聚物。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述乳胶粒子和/或荧光胶乳粒子的平均粒 度为 150nm 至 330nm。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述乳胶粒子和/或荧光胶乳粒子的平均粒 度为 190nm 至 270nm。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述结合物质是针对待测物质的抗体。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其中在步骤(2)中，通过表面等离子体荧光测定 法或落射荧光测定法来测量荧光。
9.一种生产胶乳粒子的方法，其中所述胶乳粒子的表面上存在的COOH基团的量为 40 μ eq/g至300 μ eq/g，所述方法包括通过将聚合引发剂逐滴地加入至包含苯乙烯和 丙烯酸或甲基丙烯酸的含水悬浮液中而进行聚合，其中所述苯乙烯的浓度为1.4M以下。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在加入所述聚合引发剂之前将所述含水悬浮液 升高至751至951。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述聚合引发剂是过硫酸钾。
12.根据权利要求9所述的方法，其中在交联剂的存在下进行聚合。
全文摘要
本发明的一个目的是提供具有高生产再现性的胶乳粒子，通过其可以在免疫诊断中实现足够高的信号ΔS值(＝信号值-噪声值)。本发明提供了一种测定方法，其包括以下步骤(1)使待测物质与结合物质标记的荧光胶乳粒子接触或竞争，所述结合物质标记的荧光胶乳粒子通过使结合物质与荧光胶乳粒子结合而获得，以及(2)测量来自结合物质标记的荧光胶乳粒子的荧光，其中(a)所述荧光胶乳粒子是通过将荧光物质加入至胶乳粒子而获得，所述胶乳粒子的特征在于所述胶乳粒子的表面上存在的COOH基团的量为40μeq/g至300μeq/g，或(b)所述荧光胶乳粒子包含胶乳粒子和荧光物质，其特征在于所述荧光胶乳粒子的表面上存在的COOH基团的量为40μeq/g至300μeq/g。
文档编号G01N33/545GK102023209SQ201010281100
公开日2011年4月20日 申请日期2010年9月9日 优先权日2009年9月11日
发明者桑原知子, 渡边裕也, 笠置典之 申请人:富士胶片株式会社
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