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专利名称：邻苯二甲酸二丁酯elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测邻苯二甲酸二丁酯的试剂盒，特别是检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫(ELISA)检测试剂盒。
背景技术：
邻苯二甲酸二丁酯(DBP)属于邻苯二甲酸酯类，是目前国内外工业生产中使用最多的塑化剂(又称增塑剂)，广泛存在于食品包装、化妆品、医疗器材以及环境水体中。这类塑化剂并非食品或食品添加物，但会通过环境迁移、食品包装迁移及非法添加等进入食品，对人体健康产生毒害作用，如造成内分泌失调，影响正常生育能力，在体内长期蓄积会导致畸形、癌变和突变，对心血管、消化和泌尿系统也有很大伤害。因此，我国卫生部卫办监督函〔2011〕551号文件中规定:严禁在食品、食品添加剂中人为添加邻苯二甲酸酯类物质，食品、食品添加剂中的邻苯二甲酸二( a -乙基已酯)(DEHP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)和邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)最大残留量分别为1.5mg/kg、9.0mg/kg和0.3mg/kg。目前文献报道有关邻苯二甲酸酯类物质的检测方法有气相色谱法、超高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法、气相色谱-离子阱质谱法等。但研究大多集中于环境样品和塑料包装材料，对于食品中的污染情况检测研究较少。我国食品中邻苯二甲酸酯检测使用“GB/T 21911-2008《食品中邻苯二甲酸酯的测定》”，包装中邻苯二甲酸酯检测使用“GB/T 21928-2008《食品塑料包装材料中邻苯二甲酸酯的测定》”，两种检测方法均运用气相色谱-质谱联用(GC-MS)的方法进行测定。该方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用。与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的邻苯二甲酸二丁酯残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中邻苯二甲酸二丁酯残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是:一种邻苯二甲酸二丁酯ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的聚苯乙烯酶标板、一张盖板膜、13瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其特征在于:酶标板是采用96孔的聚苯乙烯试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原制成的检测板，13瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液，下凹瓶位共15个。[0006]酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装的酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将13瓶试剂用不同大小、不同颜色的试剂瓶盛装并固定在下凹瓶位中，与酶标板、盖板膜、自封袋一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。13瓶试剂分别为6瓶Iml梯度浓度的标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml抗体工作液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml样本稀释液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的残留物(邻苯二甲酸二丁酯)将和酶标板微孔条上预包被的邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原竞争抗邻苯二甲酸二丁酯的抗体，加入酶标二抗后，用底物液显色，样本吸光度值与所含残留物(邻苯二甲酸二丁酯)的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中邻苯二甲酸二丁酯的残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度:白酒样本的最低检测限为0.lmg/L,回收率为90%±20% ;同邻苯二甲酸二丁酯的交叉反应率为100%、同邻苯二甲酸二异丁酯的交叉反应率为35%、同邻苯二甲酸二辛酯的交叉反应率< 1%、同邻苯二甲酸二异壬酯的交叉反应率< 1%、同邻苯二甲酸二异辛酯的交叉反应率< 1%、同邻苯二甲酸二甲酯的交叉反应率< 1%。相对于其他邻苯二甲酸二丁酯检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、振荡器和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是:能快速、简便、灵敏、准确地用于邻苯二甲酸二丁酯残留量的检测。

图1为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图(长为8.55cm)；图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图(长为12.8cm)；图3为本实用新型酶标板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图:酶标反应微孔条(2)预包被邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂瓶(5)用于封装50ml样本稀释液；白色帽的白色PE塑料试剂瓶(6)用于封装7ml底物液A液，红色帽的黑色PE塑料试剂瓶(6)用于封装7ml底物液B液，黄色帽的白色PE塑料试剂瓶(6)用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶(7 )用于封装7ml抗体工作液，黑色帽的棕色玻璃瓶(8 )用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个下凹瓶位,放置位置依次为:40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml样本稀释液瓶位(11)，7ml底物液A液瓶位(14)，Iml底物液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml抗体工作液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位(15)，6个Iml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(17)，盒体(9)是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理1、配液配液1:洗涤工作液用去离子水将20 X浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2、白酒样本处理步骤移取IOOii I白酒样品于2ml聚苯乙烯离心管中，再加入400 ii I样本稀释液,充分振荡混匀；取5(^1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(2(T25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回自封袋，封口，保存于21 °C。3、浓缩洗涤液和样本稀释液在使用前也需回温。
4、编号:将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本和抗体工作液:加标准品/样本50 U I到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50 ii I/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min。6、洗板:小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 Ul/孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、加酶标二抗:加入酶标二抗IOOiU/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。8、显色:加入底物液A液50 iil/孔，再加底物液B液50 iil/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。9、测定:加入终止液50 U I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含邻苯二甲酸二丁酯的含量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(mg/L)。假设样本I的吸光度值为0.820，样本2的吸光度值为1.320，标准液吸光度值分别是:0mg/L为1.984 ；
0.02mg/L 为 1.632 ；0.06mg/L 为 1.232 ；0.18mg/L 为 0.752 ；0.54mg/L 为 0.361 ；1.62mg/L为0.156。贝U样本I的浓度范围是0.06、.18mg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中邻苯二甲酸二丁酯残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.02、.06mg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中邻苯二甲酸二丁酯残留的浓度范围。2、定量分析(I)百分吸光率的计算:标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即:
权利要求1.一种邻苯二甲酸二丁酯ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、13瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其特征在于:酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原制成的检测板，13瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，样本稀释液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，Iml/瓶；酶标二抗I瓶，12ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ;样本稀释液I瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测邻苯二甲酸二丁酯ELISA检测试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、抗体工作液、6个浓度的标准品溶液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、样本稀释液。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的邻苯二甲酸二丁酯将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗邻苯二甲酸二丁酯抗体，加入酶标二抗后，用底物液显色，利用样本吸光度值计算出样品中邻苯二甲酸二丁酯的残留量。与仪器分析技术相比具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点，可在邻苯二甲酸二丁酯的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK202956383SQ20122069410
公开日2013年5月29日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者何方洋, 万宇平, 冯才伟, 冯静, 陶光灿, 聂雯莹, 吴小胜, 彭鸽 申请人:北京勤邦生物技术有限公司