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专利名称：乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种快速定量检测乳腺癌的Y-synuclein诊断试剂盒， 是一种通过荧光定量RT-PCR对待测样品中的Y -synuclein进行定量检测，以期为乳腺癌 早期筛查、预后和制定相应的治疗方案提供依据。
背景技术：
乳腺癌是�：Ω九�健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有一百多万妇女患有乳腺癌， 发病率有逐年上升的趋势。以往的早期乳腺癌病人多因能触及肿块，当肿块较小时，常被 认为处于临床早期，实际上这并非真正意义上的早期诊断。早期诊断应是针对在临床上触
及不到肿块的乳腺癌病人而言，即亚临床状态。传统的乳腺癌检测方法主要包括X线诊 断、超声显象检查、细胞学及组织学诊断等，这些方法在乳腺癌的常规检测中起了重要 作用，但普遍不适用于真正意义的乳腺癌准确的早期诊断(胡铁辉，海�。�黄俊辉.乳腺
癌诊断新近展[J].中国医师杂志，2003， 12: 1722-1724)。目前乳腺癌的生物诊断技术 己成为最活跃的研究领域之一。通过传统病理形态来早期诊断乳腺癌的概念已逐步发生了 改变。随着分子生物学、细胞生物学和免疫学研究的进展，乳腺癌的研究由细胞病理学进 入分子病理学领域，生物诊断技术成为一种很有前途的治疗手段，特别是近年来人类基因 组研究取得的丰硕成果进一步推动了生物诊断技术的发展，分子病理诊断已逐歩成为乳腺 癌诊断的一个重要内容。
Y-synuclein是一种乳腺癌诊断的新标志基因，又称乳腺癌特异性基因1 (BCSG1, breast cancer-specific gene 1)，其表达蛋白广泛分布在神经系统的神经元突触前末稍。 除神经系统外，正常乳腺组织或良性病变中BCSG1几乎不表达，而多数浸润性乳腺癌、卵 巢癌等肿瘤组织中表达异常增高。BCSG1的异常表达与肿瘤细胞的生长、浸润及转移相关 (Ji H ， Liu YE， Jia T， et al. Identification of a breast cancer- specific gene , BCSG1 ， by direct differential cDNA sequencing[J]. Cancer Res， 1997， 57: 759-764)。 BCSG1在乳腺癌中有很高的特异性表达，而在正常乳腺组织或良性病变中几乎不表达，因 此检测患者的外周血、肿瘤组织、乳腺分泌液等标本中有无Y-synuclein的表达，可以 对乳腺癌的诊断(尤其是对肿瘤的良性和恶性的鉴别)和预后治疗的提供有力证据，还可 以为肿瘤转移和复发情况的监测提供帮助。
目前己被众多的实验研究和临床观察所证实当乳腺癌发展到大于lcm，在临床上可 触及肿块时，往往已是全身性疾�。�可存在远处微小转移灶，只是用目前的检査方法诊断 多数乳腺癌是一种全身性疾病时，尚不能发现而已。因此，如何尽早快速、准确测定乳腺
癌的肿瘤转移是乳腺癌治疗中面临的主要难题之一。据报道，乳腺癌必须确诊方可治疗， 现有的检查方法虽然很多，但至今只有活检所得的病理结果能作为唯一肯定诊断的依据。 国外己有报道，通过针吸活检组织或细胞学穿刺进行乳腺可疑病变中微量DNA或RNA的提 �。�并从分子水平检测基因异常，可早期发现乳腺癌。目前常用的基因检测方法有免疫 组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)和酶联免疫吸附测定(ELISA)(沈坤伟，沈镇宙.乳 腺癌研究进展，美国第23届圣安东尼奥国际乳腺癌大会论文综述[J].中国肿瘤，2001， 10:352-353)。 FISH能直接和准确地判断靶基因是否存在扩增，但较为昂贵和繁琐；免疫 组织化学因其简便、快速、经济，已成为最常规的检测方法，但仍有很多缺点首先免疫 组化的判断标准不一，使靶基因蛋白表达的检测结果不一致，其次石蜡包埋和甲醛固定可 能会对免疫组织化学检测结果产生一定的影响，造成假阴性。第三，采用不同公司的抗体， 检测结果也不完全相同。此外，目前已有的乳腺癌试剂盒普遍存在操作繁琐，特异性和敏 感性差的问题，迫切需要一种灵敏度高、速度快、特异性强的体外检测试剂盒。近年来 RT-PCR技术被用于肿瘤检测，敏感性比IHC提高10 100倍，在基因表达水平分析和定量 检测等方面得到广泛应用。实时荧光定量RT-PCR是在实时RT-PCR基础上发展起来的一项 新技术(High-Throughput Reai-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of H印atitis C Virus RNA [J]. J. Clin. Microbiol, 1999， 37:327-332)其探针特异地 同目的模板结合，与其他RT-PCR技术相比，实时RT-PCR对mRNA的检测和定量能提供更 多的信息，耗时更少，其准确性、灵敏性都大大提高。

发明内容
本发明的目的在于提供一种快速定量检测乳腺癌的Y-synuclein诊断试剂盒，该试 剂盒不仅可使用目前市场上存在的所有类型荧光定量仪器，更重要的是能快速对乳腺癌诊 断的新标志基因Y-synuclein进行定量检测，从而提供乳腺癌的早期诊断和预后治疗的 重要辅助指标。
本发明的另外的目的在于提供这种试剂盒的使用方法。
概括的说，这种乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，包括总RNA提取液、逆转录反 应液、逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、荧光PCR定量反应液、标准品和对照 品，其特征在于，逆转录反应液包括DEPC处理的灭菌双蒸水、六聚体随机引物p(dN)6、 5XRT缓冲液和dNTPs。 一种优选的方案是，总RNA提取液为TRizoL总RNA提取液。前述 逆转录反应液中六聚体随机引物P(dN)6为100 mmol/L六聚体随机引物p(dN)6， dNTPs 为12. 5 mmol/L dNTPs。前述荧光PCR定量反应液包括10X PCR缓冲液、引物、2mmol/L dNTPs 和SYBR Green I，所述10X PCR缓冲液包括500 mmol/L KC1、 100mmol/L Tris-HC1、7, 5mmol/L MgC12，所述引物包括具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列反向引物。 一种优选的方案是，所述Tris-HC1的PIt9.0。
这种乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，所述标准品为SEQ ID N0:3所示的核苷酸序 列。所述对照品的阴性对照为无Y-synuclein mRNA的RNA样品，阳性对照为含有 Y-synuclein m脂A的RNA样品。
这种乳腺癌symjclein快速诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下述步骤
(1) 设计引物——设计人Y-synuclein的具有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的正向 引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的反向引物，以人的GAPDH为内参对照，其正向 引物和反向引物分别具有SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，
(2) 样品总RNA的提取——用TRizoL总脂A提取液从待测样品中提取总RNA，将所 提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，-7(TC保存待用，
(3) 逆转录反应——l"g的总RNA用于cDNA第一链的合成，引物为100腿oI/L六 聚体随机引物P(dN)6，
(4) SYBR Green I荧光定量PCR——10XPCR缓冲液2. 5 y 1， 2 mmol/L dNTPs 2. 5 y 1， 20XSYBR Green I lii 1， 12. 5 y mol/L的引物各0. 5 y 1， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 u 1 ， 逆转录产物5 u 1 ，反应总体积25 n 1 ，
反应条件94。C预变性l分钟，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共40个循环， 每个循环后自动读板l次，72°C 30秒处采集荧光信号，
每次检验均设阴性对照和阳性对照，标准品用灭菌双蒸水稀释为1x102-1x109拷贝 /ml,根据绘制的标准曲线得到y-synuclein及GAPDH基因表达的相对浓度，以 y-synuclein与GAPDH相对浓度的比值来反映y-synuclein表达量。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果
1、 具有极高的特异性(该检测基因在乳腺癌中有很高的特异性表达)；
2、 可以对肿瘤的良性和恶性进行初步鉴别(该检测基因在恶性乳腺肿瘤中有很高的 表达量，而在乳腺良性病变中几乎不表达)；
3、 该检测方法定量准确，具有很高的灵敏性；
4、 该检测方法歩骤简单，耗时短(4小时左右完成测试)；
5、 需要检测的样本量极少(毫克级)；
6、 可以检测的样本种类多(外周血、肿瘤组织、乳腺分泌液等标本均可)
7、 可同时进行高通量的样品检测。
具体实施例方式
一、制备本发明的乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒 1、所用到的主要试剂和仪器
TRizoL总RNA提取液(Omega公司)；200UM SuperScriptTM逆转录酶(Invitrogen 公司)；dNTPs 、 10U/rt TaqDNA聚合酶、40 U/W RNA酶抑制剂(Sigm公司)；20XSYBR
Green I染料(上海复兴公司)；实时荧光定量PCR系统(印pendorf公司)。
2、 引物设计及合成 人Y -synuclein
PI:5' -CAAGAAGGGCTTCTCCATCGCCAAGG-3' (SEQ ID NO:1) P2: 5'-CCTCTTTCTCTTTGGATGCCACACCC-3' (SEQ ID NO:2) 内参对照为GAPDH
PI: 5'- CCATCACTGCCACCCAGAAGAC -3' (SEQ ID NO:4) P2: 5'- GGCAGGTTTTTCTAGACGGCAG -3' (SEQ ID NO:5)
3、 标准品cDNA的制备
用TRizoL总腿提取液乳腺癌患者新鲜乳腺组织中的总廳，lmg的总腿用于逆 转录(RT)反应，引物为六聚体随机引物(Hexamer random primer) p(dN)6; PCR扩增目的 片段，反应条件为94。C预变性1分钟，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共30个循 环，PCR产物以pGEM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5a，经筛选和测序鉴定，阳性 质粒体外转录合成cRNA，分光光度计测A260定量后作为标准，将浓度单位换算成拷贝/ml， -2(TC保存。
二、乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒的使用方法
检测样本可以是患者的外周血、肿瘤组织、乳腺分泌液等标本，每次检验均设阴性对 照和阳性对照，标准品用灭菌双蒸水稀释为1x102-1x109拷贝/ml。
1、 样品中RNA的提取
依照使用说明书，用TRizoL总RNA提取液从待测样品中提取总RNA。 A280/A260比值 均在1. 8-2. 0之间，所提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见明显的28S， 18S两条 区带，且28S约为18S的2倍，证明其完整性.-7(TC保存待用；
2、 逆转录(RT)反应
1 P g的总RNA用于cDNA第一链的合成，引物为六聚体随机引物(Hexamer random primer) p(dN)6;
3、 SYBR Green I荧光定量RT-PCR
优化的实时定量RT-PCR体系为10XPCR缓冲液2.5 u 1， 2画1/L dNTP 2.5 "1， 20XSYBR Green I 1 u 1， 12.5 u mol/L的引物各0. 5 w 1， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 y 1， 逆转录产物5ul，反应总体积25 ul。反应条件94。C预变性1分钟，94°C 30秒，68 °C 30秒，72°C 30秒，共40个循环(每个循环后自动读板1次)，72°C 30秒处采集荧光信 号。PCR反应之后做68°C — _94°C的融解曲线分析，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 分析特异性。
4、 Y -synuclein表达的相对定量分析
每次扩增时拿出1份标准品cDNA用水做10倍系列稀释，分别对Y-synuclein和 ]3-actin进行实时定量扩增，制作各自的标准曲线。标准曲线相关系数r〉0.99的定量结
果认为可靠。根据绘制的标准曲线得到Y-synuclein及GAPDH基因表达的相对浓度，以 Y-synuclein与GAPDH相对浓度的比值来反映Y-synuclein表达量，每个样品做3个平 行管。
Y-synuclein在乳腺癌中有很高的特异性表达，而在正常乳腺组织或良性病变中几 乎不表达，因此检测患者的外周血、肿瘤组织、乳腺分泌液等标本中有无Y-synuclein 的表达，可以对乳腺癌的诊断(尤其是对肿瘤的良性和恶性的鉴别)和预后治疗的提供重 要的辅助指标。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120>乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒 <130>乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒
<160> 5
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工合成
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caagaagggc ttctccateg cca鄉
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223>人工合成
<400> 2
cctctttctc tttggatgcc acaccc
<210〉 3
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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ctca3gcccg c昭ctcgcag ggag3tccag ctccgtcctg cctgc昭cag cccaaccctg 60
cacacccacc atggatgtct tcaagaaggg cttctecatc gccaaggagg gcgtggtggg 120
tgcggtggaa aagaccaagc agggggtgac ggaagcagct gagaagacca鄉agggggt 180
catgtatgtg ggagccaaga ccaaggagaa tgttgtacag agcgtgacct cagtggccga 240
gaagaccaag gagcaggcca acgccgtgag cgaggctgtg gtgagcagcg tcaacactgt 300
ggccaccaag accgtggagg aggcggagaa catcgcggtc acctccgggg tggtgcgcaa 360
ggaggacttg aggccatctg ccccccaaca ggagggtgag gcatccaaag agaaagagga 420
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ggcaggtttt tctagacggc ag
权利要求
1、乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，包括总RNA提取液、逆转录反应液、逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、荧光PCR定量反应液、标准品和对照品，其特征在于，逆转录反应液包括DEPC处理的灭菌双蒸水、六聚体随机引物p(dN)6、5×RT缓冲液和dNTPs。
2、 权利要求1所述乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，其特征在于，所述总RNA提 取液为TRizoL总RNA提取液。
3、 权利要求1-2任一所述乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，其特征在于，所述逆 转录反应液中六聚体随机引物P(dN)6为100 mmol/L六聚体随机引物p (dN) 6， dNTPs为 12.5 mmol/L dNTPs。
4、 权利要求1所述乳腺癌sy皿clein快速诊断试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR 定量反应液包括10XPCR缓冲液、引物、2腦ol/L dNTPs和SYBR Green I，所述10 X PCR 缓冲液包括500 mmol/L KC1、 100mmol/L Tris-HC1、 7. 5咖ol/L MgCl2，所述引物包括具 有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的反向引 物，以人的GAPDH为内参对照，其正向引物和反向引物分别具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5 所示的核苷酸序列。
5、 权利要求4所述乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl 的PH=9. 0。
6、 权利要求1所述乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，其特征在于，所述标准品为 SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
7、 权利要求1所述乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，所述对照品的阴性对照为无 Y -synuclein mRNA的脂A样品，阳性对照为含有Y -synuclein mRNA的RNA样品。
8、 权利要求1所述乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，包 括下述歩骤(1) 样品总RNA的提取——用TRizoL总RNA提取液从待测样品中提取总RNA，将所 提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，-7(rC保存待用，(2) 逆转录反应——lwg的总RNA用于cDNA第一链的合成，引物为100咖ol/L六 聚体随机引物p(dN)6，(3) SYBR Green I荧光定量PCR——10XPCR缓冲液2. 1， 2咖ol/L dNTPs 2. 5 y 1， 20XSYBR Green I 1 U 1， 12. 5 " mol/L的引物各0. 5 y 1 ， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 u 1 ， 逆转录产物5 u 1 ，反应总体积25 li 1 ，反应条件94。C预变性l分钟，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共40个循环， 每个循环后自动读板l次，72°C 30秒处采集荧光信号，每次检验均设阴性对照和阳性对照，标准品用灭菌双蒸水稀释为lxl(f-lxl(T拷贝/ml， 根据绘制的标准曲线得到Y -synuclein及GAPDH基因表达的相对浓度，以Y -synuclei.n 与GAPDH相对浓度的比值来反映Y -synuclein表达量。
9、权利要求1-2， 4-7任一所述乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒在诊断乳腺癌中的 应用。
全文摘要
本发明公开了乳腺癌synuclein快速诊断试剂盒，包括总RNA提取液、逆转录反应液、逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、荧光PCR定量反应液、标准品和对照品，其特征在于，逆转录反应液包括DEPC处理的灭菌双蒸水、六聚体随机引物p(dN)6、5×RT缓冲液和dNTPs。该试剂盒克服了传统方法中存在的不足，可有效方便地对标本中synuclein进行精确定量。该试剂盒可用于临床和科研中检测患者的外周血、肿瘤组织、乳腺分泌液等标本中synuclein的表达，以期为今后乳腺癌早期筛查、预后和制定相应的治疗方案提供依据。
文档编号G01N21/00GK101187626SQ20071011525
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者瑶 刘, 屈庆春 申请人:山东大学