专利名称：时空分辨检测芯片电泳装置及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种时空分辨检测芯片电泳装置及其在生物分子相互作用分析方面的应用。
背景技术：
检测是分析仪器的核心之一。许多分析仪器的进步和革新依赖于检测原理和检测技术的创新。对于高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)等分析仪器，最常用的检测器是紫外吸收检测器、质谱(MS)和激光诱导荧光(LIF)等，并且这些检测器通常被放置于分离柱之后或柱上的某一点，即“单点检测”。对于单点检测，被分析物只有到达检测器时才能得到相应的信号。尽管单点检测能满足通常的分析任务，但却存在以下缺点一、很多情况下，被分析物在分离柱内很快得到分离，但仍必须要等到它们到达检测期才能得到检测，因而增加了不必要的等待时间；二、更为重要的是，单点检测无法提供被分析物在分离柱内的 信息，而这种信息对分离机理或迁移机理的研究等方面十分重要。在“单点检测”的基础上，又发展出几种较为新颖的检测方法(I)全柱检测(WCD)(参见Anal. Chem. 1989，61，2624-2630)。该方法在玻璃质的色谱柱上等距离平行放置一系列光二极管并置以一长度匹配的黑光灯作为光源来实时监测柱内的情况，提供多种信息。但是，高效液相色谱通常使用不透光的不锈钢柱，全柱检测基本没有适用价值。(2)全柱扫描检测(WCSD)(参见Anal. Chem. 1992,64，1745-1747)。该方法主要用于毛细管等电聚焦(CIEF)模式，移动已经完成毛细管等电聚焦分离的毛细管使其通过单点检测器或者移动检测器扫描整根毛细管，该方法可以避免单点检测的毛细管等电聚焦中因为移动已聚焦的区带而产生的分辨率下降，但是无法避免毛细管管壁的不均匀性导致的高噪音。(3)部分柱成像检测(PCID)(参见Electrophoresis 2002,23,2048-2056)。该方法是毛细管电泳中的一种特殊检测方式，在检测端开一具有一定宽度的检测窗口并采用相应的光学部件和检测器，如电荷耦合装置(CCD)等，对该部分柱内的情况进行实时监测。但是，该检测方法无法对整个分离柱的动态情况进行实时监测。(4)全柱成像检测(WCID)(参见Am. Biotechnol.Lab. 1999，17，24_26)。该方法主要用于毛细管等电聚焦等毛细管电泳模式，其分离通道为整个光透明的毛细管或芯片通道(通常5cm长)，采用一 CXD对整个通道进行实时检测。全柱成像检测可以对分离通道内的不同位置的情况进行实时监测，能够全面对分离情况进行评价，给出比较丰富的信息。刘震等观察到全柱成像检测具有一定的时间分辨和空间分辨特性，并提出了时空分辨检测的概念(参见Anal. Chem. 2007，79，1097-1100)。时空分辨的特性使得检测器具有更强大的功能，能够在任意时间检测分离通道内的任意位置上发生的“分子事件”，能够提供时间维度和空间维度的信息，特别适合于生物分子相互作用等的动力学过程的研究。然而，全柱成像检测不是根据时空分辨检测的需要而设计的，其时间分辨率和空间分辨率都不高。因此，非常有必要针对时空分辨的需求设计出同时具有时间分辨和空间分辨的检测系统和相应的分析仪器。
发明内容
本发明针对目前用于毛细管电泳、高效液相色谱和芯片电泳等仪器和装置中的检测器的没有同时具有时间分辨和空间分辨、或者有但时间分辨率和空间分辨率低的现状，发明出时空分辨检测器以及相应的时空分辨分析仪器装置，并展现了其独特的性能。本发明的核心为以具有较短长度(2-5厘米)、光透明的毛细管或芯片通道为分离通道，利用一线性光源照射整个分离通道，并利用一传感器物理尺寸大于或等于分离通道长度的、具有低像素尺寸和高数据读取频率的线阵或面阵主动像素传感器，如CCD、互补金属氧化物半导体(CMOS)或光二极管阵列(PDA)，检测光经过整个分离通道后的光吸收等信号。由于在分离通道任意位置上均有一与其对应的传感单元，该检测器能检测分离通道内的任意位置上发生的“分子事件”，具有空间分辨。由于该检测器具有快速数据读取频率，能连续检测不同时间上发生的“分子事件”，因而具有时间分辨。具有高时间分辨率的CCD作为检测部件，可以对快速过程进行实时检测；所采用的CCD�？楹偷缬拘酒叽缦嗟保吹ノ幻婊男酒杂Φ腃CD�？榈南袼卮蟠筇岣撸� 以在空间平面上进行较高的分辨，从而可以采用时空分辨的模式对于芯片电泳进行实时监测。本发明的技术方案如下一种时空分辨检测芯片电泳装置，如图I所示，它主要由两部分组成，即检测部分和分离部分，分离部分由聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片、高压电源和钼电极组成，PDMS芯片根据文献方法制作(参见Liu，Z. Lab on a Chip. 2008，8，1738-1741)，检测部分由紫外光源(如LED、紫外灯等)、线性光源转换器和线性检测器(如电荷耦合检测器CCD或CMOS传感器等)组成，即光源经过线性转换之后覆盖整个芯片通道，采用与芯片通道尺寸相近的线性检测器对整个芯片通道进行检测，将线性光源转换器、PDMS芯片、线性检测器整合于可调的光路中，每次检测前进行光学校准，在信号最强处进行检测，其他各部件如电极等，再接入系统中，每次测定完毕，根据时空分辨检测的需要进行相关的数据处理，处理采用通用的软件 matlab。本发明的时空分辨检测芯片电泳装置具有高时空分辨的特点，特别适用于生物分子间的相互作用的表征，同时还可以用于蛋白质的等点聚焦分析等。
图I装置结构示意图。图2单一蛋白质的等电聚焦的时空分辨电泳图(a)不同时刻的时空分辨电泳图；(b)三维形式的时空分辨电泳图；(C) 二维形式的时空分辨电泳图；(d)在稳态时的等电聚焦电泳图。聚焦电压600V。图3核黄素的时空分辨电泳4蛋白质和DNA相互作用的时空分辨电泳图(a)时空分辨电泳图；(b)900_1400像素空间位置上的吸收随时间变化情况；(c)峰面积的自然对数随时间的变化。聚焦电压300V。图5药物和血清蛋白相互作用的时空分辨电泳图
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明的具体应用。实施例I :装置的搭建根据芯片系统微型化的要求，本检测系统的构建上尽量避免使用复杂的光学元件(主要是透镜等)。整个系统主要由两部分组成，即检测部分和分离部分。分离部分由PDMS芯片、高压电源和钼电极组成。PDMS芯片根据文献方法制作。(参考Liu, Z. Lab on aChip. 2008，8，1738-1741)芯片的整体尺寸为25mm ( ) X 50mm (长)，其中心位置的分离通道尺寸为80μπιΧ80μπιΧ28· 7mm(宽X高X长)，通道两端各有一个直径为3mm的储液池，芯片底部贴有金属狭缝(狭缝宽度65 μ m)用于避免杂散光的干扰，钼电极分别置于两端的储液池作为分离时的阳极和阴极。检测部分有LED紫外光源(中心波长270nm，FffHM12nm)、线性光源转换器和具有高紫外相应的线性CCD检测器组成。CCD传感器有效传感面 积为28. 672mmX0. 196mm，共2，048 X 14像素(长X宽)。线性光源转换器的点光纤端和LED紫外光源相连，线性端、电泳芯片和CXD传感器置于同一光学平面上，并且三者的距离尽可能相互靠近以提高检测灵敏度并避免杂散光的干扰。CCD的控制和数据采集利用与其配套的数据采集控制�？橥ü齍SB插口和电脑相连，数据的采集和实时显示通过CCD自带的软件来实现。实施例2 :纯蛋白质(血红蛋白)的等点聚焦及时空分辨电泳图的建立用于检测的PDMS的微流控芯片的制备以及平衡冲洗的方法参照文献(参见Labchip, 2008(8) :1738-1741),所用样品为:lmg/mL血红蛋白，2%PVP，2%两性电解质。电解液(以下均相同)阳极电解液为100mmol/L磷酸，2%PVP ;阴极电解液为100mmol/L氢氧化钠，2%PVP，聚焦电压600V，结果见附图2。原始数据经过直接采集后进行如下的处理首先将光强度值根据朗伯比尔定律转换成吸光度值，再将数据沿着垂直方向(即CCD的宽度方向)进行平均化处理，最后在数据的水平方向(即CCD的长度方向)进行小波降噪，所得的数据即为纵坐标为吸光度、横坐标为空间位置的电泳图(附图2 a ),将不同时间的电泳图按照时间排列制作成为三维的电泳图(附图2b)，按照等高线图俯视的方式进行显示，即得到了纵坐标为时间轴、横坐标为空间位置的时空分辨的电泳图(附图2c)。其中，横坐标为空间位置的分辨，单位像素；纵坐标为时间分辨，单位，秒，图标上面的颜色按照右侧标注表示电泳图上根据紫外吸收测量得出的峰值的大小，下同。该方法可以用于测量蛋白质等两性分子的等电点，如附图2c所示，两性分子的等电聚焦在时空分辨电泳图上为“Y”型，交点处所对应的PH梯度上的pH值即为该两性分子的等电点。同时，在时空分辨电泳图上可以对两性分子的整个等电聚焦过程进行监控。实施例3 :核黄素在不同pH值环境中的响应样品为0. lmg/mL核黄素，2%PVP，2%两性电解质。结果见附图3.核黄素在强酸溶液中稳定，光照及紫外照射引起不可逆的分解。因此在左侧的酸性区域聚焦成为一个稳定的峰，在紫外检测下的右侧的碱性区域产生分解现象。该方法可以用于对于不同PH环境有不同响应的体系的研究。实施例4 =DNA和蛋白质的相互作用样品为lmg/mLDNA，2%PVP，2%两性电解质。结果见附图4a。在复合物的分解区域，将电泳峰值随着时间变化的区间进行提取(附图4b)，并根据一级动力学方程进行拟合结果(附图4c)，可以测得复合物的分解速率常数为k-l=0. 02s，并且在时空分辨电泳图上可以观测整个复合物分解的过程。该方法可以用于分子间相互作用的体系的研究。实施例5 :药物心得安和人体血清血蛋白(HSA)相互作用样品为O. 2mg/mL心得安，2mg/mL HSA，2%PVP，2%两性电解质。结果见附图5.按照一级动力学拟合(方法如实施例4)可以测定心得安和HSA作用生成的复合物的分解速率常数为 k_1=0. 03s。·
权利要求
1.一种时空分辨检测芯片电泳装置，其特征是它主要由两部分组成，即检测部分和分离部分，分离部分由聚二甲基硅氧烷芯片、高压电源和钼电极组成，检测部分由紫外光源、线性光源转换器和线性检测器组成，即光源经过线性转换之后覆盖整个芯片通道，采用与芯片通道尺寸相近的线性检测器对整个芯片通道进行检测，将线性光源转换器、聚二甲基硅氧烷芯片、线性检测器整合于可调的光路中，每次检测前进行光学校准，在信号最强处进行检测，其他各部件如电极等，再接入系统中，每次测定完毕，根据时空分辨检测的需要进行相关的数据处理。
2.根据权利要求I所述的时空分辨检测芯片电泳装置，其特征是所述的紫外光源是LED或紫外灯。
3.根据权利要求I所述的时空分辨检测芯片电泳装置，其特征是所述的线性检测器是CCD或CMOS传感器。
4.根据权利要求I所述的时空分辨检测芯片电泳装置，其特征是所述的数据处理是采用通用的软件mat lab。
5.根据权利要求1-4任一所述的时空分辨检测芯片电泳装置，在生物分子相互作用表征方面的应用。
6.根据权利要求1-4任一所述的时空分辨检测芯片电泳装置，在蛋白质等两性分子的等电聚焦分析方面的应用。
全文摘要
一种时空分辨检测芯片电泳装置，它主要由两部分组成，分离部分由聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片、高压电源和铂电极组成，检测部分由紫外光源、线性光源转换器和线性检测器组成，即光源经过线性转换之后覆盖整个芯片通道，采用与芯片通道尺寸相近的线性检测器对整个芯片通道进行检测，将线性光源转换器、PDMS芯片、线性检测器整合于可调的光路中，每次检测前进行光学校准，在信号最强处进行检测，其他各部件如电极等，再接入系统中，每次测定完毕，根据时空分辨检测的需要进行相关的数据处理。本发明的时空分辨检测芯片电泳装置具有高时空分辨的特点，特别适用于生物分子间的相互作用的表征，同时还可以用于蛋白质的等点聚焦分析等。
文档编号G01N27/447GK102890111SQ20121038021
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年6月15日
发明者刘震, 毕晓东 申请人:南京大学
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