专利名称：变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测装 置，特别是一种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒T叫Man荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应 用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS) 是20世纪80年代中后期出现的一种新传染性疾�。芍矸敝秤牒粑酆险�(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)弓|起，主要表现为母猪流产、早 产、产死胎、木乃伊胎等严重的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪出现呼吸道症状，该病于1987 首先在美国产生，随后在加拿大，欧州各国和亚州各地迅速流行。我国自1995年年底暴发 此病，现已成为�：ξ夜硪档闹饕卟≈�。2006年下半年以来，以江西开始暴发的 一种被称为无名"高热病"的猪病在全国各地广泛传播。由于该病来势凶猛，不同品种，不 同日龄猪群均可感染发病死亡，给养猪业造成了巨大损失，据报道该疫情主要是由变异型 PRRSV引起的，农业部把该病命名为高致病性猪蓝耳病。目前，繁殖与呼吸综合征病毒的检 测方法有多种，如病毒分离、原位杂交和RT-PCR技术等，病毒分离和原位杂交虽然有很高 的灵敏度，但操作烦琐，成本较高，周期较长，并且对病料的要求较高，不适应于临床PRRSV 的快速诊断；常规RT-PCR检测方示虽然具有方便、快速和敏感等特点，但RT-PCR需要电泳， 容易EB或分子污染，并且不能进行定时，定量监测等，而荧光定量RT-PCR方法能克服以上 缺点，荧光定量PCR方法是1996年由美国A卯liedBiosystems公司推出的新方法，它通过 在PCR反应中加入荧光集团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析的方法，它不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它更具有定时、定量、特异性强、有效解决PCR污染问题等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于建立一种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒 TaqMan荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。 本发明的另一目的还在于提供一种上述变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒T叫Man 荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用。 本发明的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒T叫Man荧光定量RT-PCR检测试剂 盒，其特征在于，该试剂盒包括如下组分构成DEPC水，5XAMV buffer, 2. 5mmol/LdNTP， 2. 5翻1/L Mgcl2， 10xPCR Buffer, Nuclease Inhibitor, AMV反转录酶，LATaqDNA聚合酶， Oligo (dT) 18， 100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/LTaqMan探针，阳性质粒标准品，阴性 对照品， (1)上下游引物混合物为按照GenBank数据库提供的PRRSV_VR2332、
4PRRSV-FJ04a、 PRRSV-JXwn06 (EF641008. 1)变异株的NSP2序列，用PrimerExpress5. 0 软件和01igo6. 0软件设计构建质粒的 一 对引物和探针，UP Primer : 5， -AGCTGATGACACCTTTGAGT-3' LOW Primer :5， -AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3，，目的片段大小 为125bp， (2) TaqMan探针 荧光探针序列5' FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3' (3)阳性质粒标准品所述的阳性质粒标准品按如下方法获得； (3. 1)GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06(EF641008. 1)变异株
序列基因序列的NSP2段，用01igo6. O软件设计一对构建标准品质粒的引物Ul，Up Primer :
5，-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3，，Low Primer :5 ，-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3 ，，目的片段
大小为868bp， (3. 2) RNA提取及RT-PCR 病毒RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent说明书进行，其RT-PCR反应体
系及条件如下RT反应体系为lOii L :DEPC水1. 25ii L，5XAMV buffer 2iiL，2.5翻l/L
Mgcl2 1. 0 ii L， 2. 5,1/LdNTPl. 0 ii L， Oligo (dT) 18 1 ii L， NucleaselnhibitorO. 25 ii L，
AMV反转录酶0. 5ii L， RNA模板3. 0 ii L，反应程序为30°C 10min，42。C lh，99。C 5min。合
成的CDNA置-20"冰箱保存备用。PCR反应体系为20iiL:无菌水13. 2 y L， 10XPCR
Buffer2. 0 ii L， dNTP 1. 6 ii L， LA-Taq酶0. 4 ii L， UP、L0W引物各0. 4 ii L，模板2. 0 ii L。反应
程序为95t:预变性5min，94t:变性lmin，58. 5"C复性lmin，72t:延伸lmin， 35个循环，最后
72t:延伸10min， fC保存，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 (3. 3)按常规方法对扩增产物进行回收、目的片段连接到PMD-18T Vector及转化
到感受态细菌DH5a 。 (3.4)阳性克隆鉴定 挑取白色菌落进行小量培养，取1. 5ml过夜培养物提取质粒，用HindIII与BamHI
进行酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性菌株进一步扩培，菌液测序， (3.5)质粒定量 取5iU提取质粒稀释到lml，用核酸蛋白紫外分析仪准确测定OD，，然后算出质 粒的质量及摩尔浓度，再乘以阿拂加德罗常数，换算成copies/ml，并进行IO倍系列稀释，
作为标准品-7(rc保存， (4)阴性对照品为生理盐水 本发明的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒T叫Man荧光定量RT-PCR检测试剂盒的 应用 (1)将试剂盒中的DEPC水，5XAMV buffer, 10xPCR Buffer, 2. 5mmol/LdNTP，
2. 5umol/LMgcl2， ， Oligo (dT) 18， 100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/LTaqMan探针，放置
室温溶解，T叫Man探针应遮光； (2)将上下游引物混合物、探针合成， (3)荧光定量RT-PCR反应体系建立， 荧光定量RT-PCR反应体系25ul， lOxPCR Buffer 13. 5ul，2. 5mmol/L dNTP2. 5ul， 100nmol/L上下游引物混合物1. 6ul， 10nmol/L探针0. 8ul， LA TaqDNA聚合酶2U，模板1. Oul，剩余的为灭菌蒸馏水补足到25iU，反应条件为94t:预变性5min，然后94°C 10s， 55°C 20s，70。C 20s，共45个循环，
(4)Mg2+、引物、探针浓度优化 以质粒标准品为检测样品，将Mg2+浓度配制成1. O咖ol/L， 1. 5咖ol/L， 2. 5咖ol/L， 3. 5umol/L ;上下游引物混合物浓度配制8nmol/L，20. 0nmol/L，32. 0nmol/L，40. Onmol/L ; 探针浓度配制成0. 8nmolol/L， 1. 6nmol/L，2. 4nmol/L，3. 2nmol/L，4. 8nmol/L分别加入反 应体系，采用距阵法优选出最佳Mg2+、引物、探针浓度，
(5)荧光定量RT-PCR特异性测定 在相同条件下，分别提取猪瘟(CSFV)、普通猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、胃肠炎
(TEG)病毒的RNA和圆环病毒(PCV)、伪狂犬病毒(PRV)等病毒的DNA，进行荧光定量PCR检
测，以验证该方法的特异性， (6)荧光定量RT-PCR敏感性测定 分别以10倍系列稀释(6. 24 X 109 6. 24 X 102拷贝/UL)的质粒标准品和按 TCID5。进行倍比稀释变异型PRRSV-FJ06A株(5623TCID5。到0. 0523TCID5。)并提取其RNA为 模板，进行荧光定量PCR检测，以验证该方法的敏感性，
(7)重复性测定 对3份不同病毒含量的样品以及3份分别保存1个月、2个月和3个月的标准品， 做5个重复的批内和批间重复试验，
(8)标准曲线和回归方程式建立 将重组标准品质粒10倍系列稀释品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)， 各取1 ill作为模板进行荧光定量PCR扩增。 为了更进一步的说明本发明，下面以实验为例，说明了变异型猪繁殖与呼吸综合 征病毒T叫Man荧光定量RT-PCR检测试剂盒的制备及应用。
1材料与方法
1. 1病毒与细胞 PRRSV-06A株、PRRSV-FJ04a株、CSFV、 PRV、 PCV2、 TEGV及Marc-145细胞由本实验 室保存。 1. 2试剂和仪器 LATaqDNA聚合酶、HindIII、 BamHI内切酶、dNTP、 pMD18-TVector， DNA凝胶回收试 剂盒，质粒小量提取试剂盒均购自TaKaRa(大连)公司，定量PCR八联管购自BIO-RAD公司。 大肠埃希氏工程菌DH5a均由本实验室保存。普通PCR仪为ABI公司2720，核酸测定仪为 E卯endorf BIO phorometer，荧光定量PCR扩增仪为Eppendorf AG 22331、引物和探针均由 TaKaRa(大连)公司合成。 1. 3荧光定量RT-PCR标准质粒品的构建
1.3. 1引物设计与合成 按照GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06 (EF641008. 1)变异株 序列基因序列的nsp2段，用01igo6. 0软件设计一对构建标准品质粒的引物Ul，UpPrimer : 5，-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3，，Low Primer :5，-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG_3，，目的片段 大小为868bp。
1. 3. 2RNA提取及RT-PCR 病毒RNA的提取按照Invitrogen TRIzol Reagent说明书进行。反转录反应 体系为lOii L :无RNase水1. 25ii L，5XAMV buffer 2 ii L， MgC12 (25mmol L—0 1. 0 ii L， dNTPl. 0 ii L， Oligo (dT) 18 1 ii L， Nuclease InhibitorO. 25 ii L， AMV反转录酶0. 5 ii L，模板 RNA3. 0 ii L。反应程序为30°C lOmin， 42°C lh， 99°C 5min，合成的cDNA，置-4(TC冰箱保存备 用。PCR反应体系为20ii L :无菌水13. 2ii L， 10XPCR Buf f er2. 0 ii L， dNTP 1. 6 ii L， LA-Taq 酶0. 4 ii L，上、下游引物各0. 4 ii L，模板2. 0 ii L。反应程序为95。C预变性5min， 94。C变性 lmin，58. 5。C复性lmin，72。C延伸lmin， 35个循环，最后72"C延伸10min，4。C保存，对PCR产 物进行1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.3. 3扩增产物回收 产物回收按照胶回收试剂盒说明书进行。具体过程如下根据目的基因的大�。� 切下目的条带；装入灭过菌的1.5mlEP管，称重，计算胶的总体积；加入等体积的Binding Buffer,于55 65t:的水中温育，直至胶完全熔化；全部溶液转入结合柱，10000rpm，室温 离心lmin ;弃流出液，加入300ii 1 BindingBuffer， 10000rpm，室温离心lmin ;弃流出液，加 700iUSPW Buffer,室温下静置2 3min， 10000rpm，室温离心lmin ;弃流出液，空柱子再 10000rpm，室温离心lmin ;将柱子装入灭过菌的1. 5mlEP管中，加30 50 yl无菌去离子 水，10000rpm，室温离心lmin ;纯化的目的片断，用琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.4目的片段连接转化 使用PMD-18T Vector连接试剂盒进行连接，体系为PCR胶回收产物4. 5 iU， Solutionl 5iU，pMD-18T 0. 5 yl， 16。C过夜。连接产物转化感受态细菌DH5 a ，取10 yl菌 液，涂布于含氨苄青霉素(Amp)抗性的LB琼脂平皿上，37t:倒置培养18h。
1. 3. 5阳性克隆鉴定 挑取白色菌落进行小量培养，取1. 5ml过夜培养物提取质粒，用HindIII与BamHI 进行酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性菌株进一步扩培，菌液送TaKaRa(大连)公司测序。
1.3. 6质粒定量 取5 iU提取质粒稀释到lml，用核酸蛋白紫外分析仪准确测定0D26。(连续测定3 次，每次重复4管，取平均值)，然后算出质粒的质量及摩尔浓度，再乘以阿拂加德罗常数， 换算成copies/ml，并进行10倍系列稀释，作为标准品-7(TC保存。
1. 4荧光定量PCR检测方法建立
1.4. l引物、探针合成 按照GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332、 PRRSV-FJ04a、 PRRSV-JXwn06(EF641008. 1)变异株NSP2序列，用Primer Express5. 0软件禾口 01igo6. 0 软件设计构建质粒的 一 对引物和探针，UP Pr imer : 5' -AGCTGATGACACCTTTGAGT-3' LOW Primer :5'-AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3'，目的片段大小为125bp，荧光探针序列5'FAM-CCGC GTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA3'
1. 4. 2荧光定量PCR反应体系建立 荧光定量RT-PCR反应体系25ul， 10xPCR Buffer 13. 5ul， 2. 5mM/L dNTP2. 5ul， 100nmol/L上游和下游引物混合物1. 6ul， 10nmol/L探针0. 8ul， LATaqDNA聚合酶2U，模板 1. Oul，剩余的为灭菌蒸馏水补足到25iU，反应条件为94t:预变性5min，然后94°C 10s，55°C 20s，70。C 20s，共45个循环。
1.4. 3Mg"、引物、探针浓度优化 以质粒标准品为检测样品，将Mg2+浓度配制成1. O咖ol/L， 1. 5咖ol/L， 2. 5咖ol/L， 3. 5umol/L ;上下游引物混合物浓度配制8nmol/L，20. 0nmol/L，32. 0nmol/L，40. Onmol/L ; 探针浓度配制成0. 8nmolol/L， 1. 6nmol/L，2. 4nmol/L，3. 2nmol/L，4. 8nmol/L分别加入反 应体系，采用距阵法优选出最佳Mg2+、引物、探针浓度。
1. 4. 3荧光定量RT-PCR特异性测定 在相同条件下，分别提取猪瘟(CSFV)、普通猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、胃肠炎
(TEG)病毒的RNA和圆环病毒(PCV)、伪狂犬病毒(PRV)等病毒的DNA，进行荧光定量PCR检
测，以验证该方法的特异性。 1. 4. 4荧光定量RT-PCR敏感性测定 分别以10倍系列稀释(6. 24 X 109 6. 24 X 102拷贝/UL)的质粒标准品和按 TCID5。进行倍比稀释变异型PRRSV-FJ06A株(5623TCID5。到0. 0523TCID5。)并提取其RNA为 模板，进行荧光定量PCR检测，以验证该方法的敏感性。
1. 4. 5重复性测定 对3份不同病毒含量的样品以及3份分别保存1个月、2个月和3个月的标准品，
做5个重复的批内和批间重复试验。 1.4. 6标准曲线和回归方程式建立 将重组标准品质粒10倍系列稀释品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)， 各取1 ill作为模板进行荧光定量PCR扩增。
1. 4. 7临床样品检验 对福建省于2008-2009年度送检疑是"高热病"病料进行PRRSV检测，被测的22份 样品分别进行荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和病毒分离，并比较三者的检查结果。
2结果 2. 1标准质粒品的构建 用RT-PCR扩增PRRSV的NSP2片段，经1. 5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出的
目的片段大小与预期值S68bp相符合。经胶回收的PCR电泳产物与pMD18-T载体连接后，转
化DH5 a ，获得重组质粒，HindIII和BamHI双酶切初步鉴定，并经测序证实为变异型PRRSV。
取5iU质粒稀释到lml，连续测定3次，得到重组标准品质粒浓度，取平均值换算成拷贝数
浓度为2. 64*1012copies/ml。 2. 2荧光定量RT-PCR方法建立 2. 2. 1Mg"、引物、探针浓度优化 结果发现Mg"的最佳反应浓度为2.5umol/L(图1);引物的最佳反应浓度为 32. 0翻1/L，(图2);探针最佳反应浓度为3. 2翻1/L(图3)。
2. 2. 2特异性测定 分别对猪瘟(CSFV)、普通PRRSV、胃肠炎(TEG)病毒的RNA和圆环病毒(PCV)、伪狂 犬病毒(PRV)的DNA，进行荧光定量RT-PCR检测，结果只有变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)检测呈阳性(图4)。
2. 2. 3敏感性测定
2. 2. 3. 1将重组标准品质粒10倍系列稀释品(2. 6扭l(Tcopies/ uL-2. 6扭10^opies/uL)，进行实时荧光定量PCR扩增反应，从图5可见该方法可以检测到 264个拷贝数的DNA标准品。 2. 2. 3. 2将培养的PRRSV按总TCID5。进行倍比稀释后提取RNA，稀释浓度分别从 5623TCID5。到0. 0523TCID5。，进行荧光定量PCR检测，结果该方法可以检测到0. 5623 TCID5。 病毒量，比常规RT-PCR敏感10倍(图6)。
2. 3定量标准曲线的构建 将重组标准品质粒10倍系列稀释品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)， 进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应结束后系统根据荧光值的变化规律，自动生成起始 模板数扩增反应的动力学曲线(图8)。
2. 4标准曲线的建立和回归方程设定 用标准样品进行扩增，得出了一条标准曲线，斜率为_3.319，截距为48.8，从 而可以得出拷贝数(Copy皿mber)与循环阈值(Ct)之间的线性关系曲线表达式Ct =-3. 319Copynumber+48. 8，而待测样品的Ct值可以从仪器中读�。话汛庋返腃t值代 入表达式就可以算出它的初始拷贝数。由标准曲线(图8)看出，起始模板浓度与Ct值之 间呈良好的线性关系，相关系数r2 = 0. 988。表明该试验误差较�。帽曜佳肺舛� 的标准品是合格的。
2. 5重复性试验 对3份不同病毒含量的样品以及3份分别保存1个月、2个月和3个月的标准品， 做5个重复的批内和批间重复试验，统计学分析结果表明差异不显著，该方法重复性好。
2. 6临床送检样品检测 对福建省于2008-2009年度送检22份疑似为高致病性猪蓝耳病的样品分别进行 荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR进行检测及病毒分离比较检测，结果表明荧光定量RT-PCR 检测出了 8份阳性，阳性率为36. 4%;常规RT-PCR检测出7份阳性，阳性率为31. 8%;分离 到了6株病毒，分离率为27.3%。 综上所述，本发明相比现有技术具有如下优点 PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的病毒，具有广泛的抗原变异和毒力变化 的能力。其核酸序列中最保守的区域是在ORFlb和0RF7序列，而在基因组ORFla的Nsp2、 0RF3、0RF4、0RF5是比较容易发生变异的区域，目前流行的变异性PRRSV其基因变异最明显 的地方就是在ORFla的Nsp2区域内发生了 2段基因缺失， 一共缺失了 90个碱基即30AA，其 中仅在一段基因序列中就连续缺失了 87个碱基即29AA，另外在一段连续缺失了 3个碱基 即1AA。本研究是通过对多株变异性PRRSV、PRRSV-VR233及PRRSV-FJ04a的基因分析和序 列对比，在发生基因缺失的ORFla的Nsp2区域两端设计了 1对引物，并在基因缺失处设计 探针，该探针长度为26个bp，其中前16个碱基对于普通PRRSV来说位于缺失位置前，而后 ll个碱基位于缺失位置后，因此该探针不能与普通PRRSV结合，致使普通PRRSV不能被检测 到，保证其检测变异型PRRSV的特异性。研究表明，通过对反应体系的优化，特异性和敏感 性检验，标准质粒品的构建，我们建立了特异性强、敏感性高的T叫Man荧光定量RT-PCR方 法。本方法与韦天超、徐辉等针对PRRSV的0RF7基因、范忠军针对PRRSV的0RF6基因、鲁 韦韦针对未变异PRRSV的0RF1和0RF6设计两对引物和探针检测PRRSV的方法不同，他们建立的方法是区分不出PRRSV是否出现变异，而本方法可以检测出变异型PPRSV，检测不出 普通的PRRSV，从而区分出了 PRRSV是否出现变异。由于该方法具有快速、准确及敏感性高 的特点，同时能够检测出猪体内微量的病毒，因此也适合于猪群早期感染变异型PRRSV的 检测，对猪群潜伏期是否感染变异型PRRSV的诊断及防治具有重大意义。
根据实时荧光PCR定量方法大致可分两类绝对定量和相对定量，绝对定量要求 构建标准品，一般用拷贝数报告结果，常用于病毒载量的检测；标准品也可用于相对定量， 常用于基因表达差异的比较。实时定量PCR技术检测的准确性首先取决于合格标准品的构 建。质粒DNA、体外逆转录的RNA及纯化的dsDNA都可以作为标准品用于构建标准曲线，但 是无论是体外转录的RNA还是dsDNA用作标准品构建标准曲线时其稳定性与重复性都不及 质粒DNA[15]。如果用cDNA、 PCR产物作为标准品，虽然制备简单易于保存，但是将会因为 标准品无法准确指示样品反转录效率，而给最终定量起始拷贝数带来影响。因此，构建好的 质粒DNA定量标准品对于实时定量PCR技术的准确性至关重要。本研究通过RT-PCR扩增 出目的基因片段，T-A克隆获得预期的重组质粒标准品，建立的标准曲线有较大的线性范围 (6. 24*109copies/uL-6. 24*103copies/uL)。经应用研究表明，该方法制备的重组质粒标准 品可以长期稳定保存，有效克服了直接提取PRRSV的RNA作为标准品容易降解的问题，保证 了较为可靠的定量结果，适用于对变异性PRRSV的定时、定量检测。 对临床样品比较检验结果可知荧光定量RT-PCR方法检出的阳性率最高为 36. 4% ，其次为常规RT-PCR方法检出阳性率为31.8%，而病毒分离检测率最低为27. 3% ， 但RT-PCR与病毒分离方法检测出来的阳性样品与荧光定量RT-PCR方法检测出来的符合率 为100%。出现T叫Man荧光定量RT-PCR方法检测出来阳性率最高这种现象，申请人认为 是因为T叫Man荧光定量RT-PCR方法具有比其他检测方法敏感性高的缘故，虽然病毒分离 敏感性也高，但可能由于某些样品保存或冻融过程中，病毒丧失了感染细胞的能力，使病毒 分离结果呈阴性。综合上述病料来源发病猪的临床症状、病理变化及防治效果判断，荧光定 量RT-PCR方法最为准确可靠，能够检测出亚临床或潜伏感染猪群，适合于猪群感染变异型 PRRSV的早、中、晚期的诊断，对及时有效地防治高致病性PRRSV发生有重要意义。
图1是Mg2+的最佳反应浓度选择示意图 图2是引物反应浓度优化示意图， 图3是探针浓度优化示意图
图4是荧光定量RT-PCR方法的特异性测定示意图 RT-PCR方法的敏感性测定示意图 RT-PCR方法的敏感性示意图 RT-PCR方法的动力学曲线示意图 RT-PCR检测PRRSV的标准曲线示意图
图5是荧光定3 图6是荧光定3 图7是荧光定3 图8是荧光定具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例1
本发明的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒T叫Man荧光定量RT-PCR检测试剂 盒。包括如下组分构成DEPC水，5XAMV buffer, 2. 5mM/L dNTP， 2. 5umol/LMgcl2， 10xPCR Buffer, Nuclease Inhibitor, AMV反转录酶，LA TaqDNA聚合酶，Oligo(dT) 18， lOOnmol/L 引物混合物，10nmol/LT叫Man探针，阳性质粒标准品，阴性对照品(生理盐水)，
(1)上下游引物混合物为按照GenBank数据库提供的PRRSV_VR2332、 PRRSV-FJ04a、 PRRSV-JXwn06 (EF641008. 1)变异株的nsp2序歹lj，用PrimerExpress5. 0 软件和01igo6. 0软件设计构建质粒的 一 对引物和探针，UP Primer : 5， -AGCTGATGACACCTTTGAGT-3' LOW Primer :5， -AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3，，目的片段大小 为125bp， (2)TaqMan探针 荧光探针序列5' FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3' (3)阳性质粒标准品所述的阳性质粒标准品按如下方法获得； (3. 1)GenBankBank数据库提供的PRRSV-VR2332及PRRSV_JXwn06 (EF641008. 1)
变异株序列基因序列的的NSP2段，用01igo6. 0软件设计 一 对构建标准品
质粒的引物Ul， UpPrimer :5' -GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3'， Low Primer:
5， -ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3，，目的片段大小为868bp， 1. 3. 2RNA提取及RT-PCR (3. 2) RNA提取及RT-PCR 病毒RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent说明书进行，其RT-PCR反应体 系及条件如下RT反应体系为lOii L :DEPC水1. 25ii L，5XAMV buffer 2iiL，2.5翻l/L Mgcl2 1. 0 ii L， 2. 5,1/LdNTPl. 0 ii L， Oligo (dT) 18 1 ii L， NucleaselnhibitorO. 25 ii L， AMV反转录酶0. 5 ii L， RNA模板3. 0 ii L，反应程序为30 °C lOmin， 42 °C lh， 99 °C 5min。 合成的CDNA置-20 °C冰箱保存备用。PCR反应体系为20 ii L :无菌水13. 2 y L， 10XPCRBuffer2. 0 ii L， dNTP 1. 6 ii L， LA-Taq酶0. 4 ii L， UP、 LOW引物各0. 4 ii L，模板 2. Oil L。反应程序为95t:预变性5min，94t:变性lmin，58. 5。C复性lmin，72。C延伸lmin，35 个循环，最后72t:延伸10min， fC保存，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
(3. 3)按常规方法对扩增产物进行回收、目的片段连接到PMD-18T Vector及转化 到感受态细菌DH5a 。
(3.4)阳性克隆鉴定 挑取白色菌落进行小量培养，取1. 5ml过夜培养物提取质粒，用HindIII与BamHI
进行酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性菌株进一步扩培，菌液测序， (3.5)质粒定量 取5iU提取质粒稀释到lml，用核酸蛋白紫外分析仪准确测定OD，，然后算出质 粒的质量及摩尔浓度，再乘以阿拂加德罗常数，换算成copies/ml，并进行IO倍系列稀释，
作为标准品-7(rc保存， (4)阴性对照品为生理盐水。 本实施例未述部分与现有技术相同 实施例2 本发明的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒T叫Man荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用(l).将试剂盒中的DEPC水，5XAMV buffer, 10xPCR Buffer, 2. 5mmol/L dNTP，
2. 5翻1/L Mgcl2， ，Oligo(dT) 18， 100nmol/L引物混合物，10nmol/LTaqMan探针，放置室温 溶解； (2)将引物混合物、探针合成，
(3)荧光定量PCR反应体系建立， 荧光定量RT-PCR反应体系25ul， lOxPCR Buffer 13. 5ul， 2. 5mM/L dNTP2. 5ul， 100nmol/L上游和下游引物各0. 8ul， 10nmol/L探针0. 8ul， LA TaqDNA聚合酶2U，模板 1. Oul，剩余的为灭菌蒸馏水补足到25iU，反应条件为94t:预变性5min，然后94°C 10s， 55°C 20s，70。C 20s，共45个循环，
(4)Mg"、引物、探针浓度优化 以质粒标准品为检测样品，将Mg"浓度配制成1. O咖ol/L， 1. 5咖ol/L，2. 5咖ol/L，
3. 5umol/L ;上下流引物混合引物浓度配制8nmol/L，20. 0nmol/L，32. 0nmol/L，40. 0nmo1/ L ;探针浓度配制成0. 8nmolol/L， 1. 6nmol/L，2. 4nmol/L，3. 2nmol/L，4. 8nmol/L分别加入 反应体系，采用距阵法优选出最佳Mg2+、引物、探针浓度， (5)荧光定量RT-PCR特异性测定 在相同条件下，分别提取猪瘟(CSFV)、普通猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、胃肠炎
(TEG)病毒的RNA和圆环病毒(PCV)、伪狂犬病毒(PRV)等病毒的DNA，进行荧光定量PCR检
测，以验证该方法的特异性， (6)荧光定量RT-PCR敏感性测定 分别以10倍系列稀释(6. 24 X 109 6. 24 X 102拷贝/UL)的质粒标准品和按 TCID5。进行倍比稀释变异型PRRSV-FJ06A株(5623TCID5。到0. 0523TCID5。)并提取其RNA为 模板，进行荧光定量PCR检测，以验证该方法的敏感性，
(7)重复性测定 对3份不同病毒含量的样品以及3份分别保存1个月、2个月和3个月的标准品， 做5个重复的批内和批间重复试验，
(8)标准曲线和回归方程式建立 将重组标准品质粒10倍系列稀释品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)， 各取1 ill作为模板进行荧光定量PCR扩增，
本实施例未述部分与现有技术相同。
1权利要求
变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下组分构成DEPC水，5×AMV buffer，2.5mM/L dNTP，2.5umol/L Mgcl2，10x PCR Buffer，Nuclease Inhibitor，AMV反转录酶，LA TaqDNA聚合酶，Oligo(dT)18，100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/LTaqMan探针，阳性质粒标准品，阴性对照品，(1)上下游引物混合物为按照GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332、PRRSV-FJ04a、PRRSV-JXwn06(EF641008.1)变异株的NSP2序列，用PrimerExpress5.0软件和Oligo6.0软件设计构建质粒的一对引物和探针，UPPrimer5’-AGCTGATGACACCTTTGAGT-3’LOW Primer5’-AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3’，目的片段大小为125bp，(2)TaqMan探针荧光探针序列5’FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3’(3)阳性质粒标准品所述的阳性质粒标准品按如下方法获得；(3.1)GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06(EF641008.1)变异株序列基因序列的NSP2段，用Oligo6.0软件设计一对构建标准品质粒的引物U1，UpPrimer5’-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3’，Low Primer5’-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3’，目的片段大小为868bp，(3.2)RNA提取及RT-PCR病毒RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent说明书进行，其RT-PCR反应体系及条件如下RT反应体系为10μLDEPC水1.25μL，5×AMV buffer 2μL，2.5umol/L Mgcl2 1.0μL，2.5mmol/LdNTP1.0μL，Oligo(dT)18 1μL，NucleaseInhibitor0.25μL，AMV反转录酶0.5μL，RNA模板3.0μL，反应程序为30℃10min，42℃1h，99℃5min。合成的CDNA置-20℃冰箱保存备用。PCR反应体系为20μL无菌水13.2μL，10×PCR Buffer2.0μL，dNTP 1.6μL，LA-Taq酶0.4μL，UP、LOW引物各0.4μL，模板2.0μL。反应程序为95℃预变性5min，94℃变性1min，58.5℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。(3.3)按常规方法对扩增产物进行回收、目的片段连接到PMD-18T Vector及转化到感受态细菌DH5α。(3.4)阳性克隆鉴定挑取白色菌落进行小量培养，取1.5ml过夜培养物提取质粒，用HindIII与BamHI进行酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性菌株进一步扩培，菌液测序，(3.5)质粒定量取5μl提取质粒稀释到1ml，用核酸蛋白紫外分析仪准确测定OD260，然后算出质粒的质量及摩尔浓度，再乘以阿拂加德罗常数，换算成copies/ml，并进行10倍系列稀释，作为标准品-70℃保存。
2. —种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒T叫Man荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应 用，其特征在于Q).将试剂盒中的DEPC水，5XAMV buffer, 10x PCRBuffer， 2. 5mmol/L dNTP，2. 5umol/L Mgcl2， Nuclease Inhibitor, Oligo (dT) 18， 100nmol/L上下游引物混合物， 10nmol/LTaqMan探针，放置室温溶解，TaqMan探针应遮光；(2) 将上、下游引物混合物、探针合成，(3) 荧光定量PCR反应体系建立，荧光定量RT-PCR反应体系25ul， 10x PCR Buffer 13. 5ul， 2. 5mM/L dNTP2. 5ul， 10Onmol/L上下游引物混合物1. 6ul， 1Onmol/L探针0. 8ul， LA TaqDNA聚合酶2U，模板 1. Oul，剩余的为灭菌蒸馏水补足到25iU，反应条件为94t:预变性5min，然后94°C 10s， 55°C 20s，70。C 20s，共45个循环，(4) Mg2+、引物、探针浓度优化以质粒标准品为检测样品，将Mg2+浓度配制成1 0咖o 1 /L ， 1 5咖o 1 /L ， 2 5咖o 1 /L ， 3. 5umol/L ;上下游引物混合物浓度配制8nmol/L，20. 0nmol/L，32. 0nmol/L，40. Onmol/L ; 探针浓度配制成0. 8nmolol/L， 1. 6nmol/L，2. 4nmol/L，3. 2nmol/L，4. 8nmol/L分别加入反 应体系，采用距阵法优选出最佳Mg2+、引物、探针浓度，(5) 荧光定量RT-PCR特异性测定在相同条件下，分别提取猪瘟CSFV、普通猪繁殖与呼吸综合征PRRSV、胃肠炎TEG病毒 的RNA和圆环病毒PCV、伪狂犬病毒PRV病毒的DNA，进行荧光定量PCR检测，以验证该方法 的特异性，(6) 荧光定量RT-PCR敏感性测定分别以10倍系列稀释(6. 24X 109 6. 24X 102拷贝/UL)的质粒标准品和按TCID5。进 行倍比稀释变异型PRRSV-FJ06A株(5623TCID5。到0. 0523TCID5。)并提取其RNA为模板，进 行荧光定量PCR检测，以验证该方法的敏感性，(7) 重复性测定对3份不同病毒含量的样品以及3份分别保存1个月、2个月和3个月的标准品，做5 个重复的批内和批间重复试验，(8) 标准曲线和回归方程式建立将重组标准品质粒10倍系列稀释品(2. 64*109copies/uL-2. 64*103copies/uL)，各取 1 ii 1作为模板进行荧光定量PCR扩增。
全文摘要
本发明公开了一种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用，本发明参照GenBank的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV与普通PRRSV的NSP2段基因序列，设计并合成了引物和TaqMan探针。通过对反应条件优化，标准质粒品构建，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR诊断变异型PRRSV方法。结果表明，该方法具有特异性强，敏感性高等特点，能够检测出264个拷贝数的标准质粒品，0.5623TICD50的病毒量，比RT-PCR敏感10倍。对22份病料样品进行检测，结果有8份为阳性，阳性率为36.4％。由于该方法具有定量、快速、准确、敏感等优点，适用于对猪群感染变异型PRRSV早、中、晚期的诊断，对有效诊断及防治高致病性猪繁殖与呼吸综合征的发生起到重要作用。
文档编号G01N21/64GK101736094SQ20101012080
公开日2010年6月16日 申请日期2010年3月2日 优先权日2010年3月2日
发明者周伦江, 庄向生, 王隆柏, 车勇良, 陈如敬, 魏宏 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所;周伦江;王隆柏;庄向生;魏宏;陈如敬;车勇良
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