专利名称：一种快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法
技术领域：
本发明涉及甲型流感病毒领域，具体涉及一种评估甲型流感病毒宿主特异性的方法。
背景技术：
甲型流感病毒为常见流感病毒，并容易发生变异。禽流感病毒为甲型流感病毒的一种亚型，禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性传染�。材芨腥救死�。禽流感病毒不仅严重�：π竽烈档纳乇鹗歉咧虏⌒缘腍5m禽流感病毒已经跨越种属屏障直接引起人类感染并造成感染者死亡。禽流感病毒抗原类型众多，变异频繁，导致高致病性禽流感防控非常困难。因此有必要发展可用于监测和评估禽流感病毒病原的变异和宿主特异性的新技术。在病毒和宿主细胞表面糖链间的相互作用存在种类特异性，如禽流感病毒主要识别和结合存在于禽肠胃道上皮细胞表面的唾液酸(SA) α 2_3Gal (半乳糖)的糖链受体，而人流感病毒主要识别和结合存在于肺及呼吸道上皮细胞表面的SA α 2_6Gal的糖链受体。最初认为，这种受体特异性的差异，造成了禽流感病毒无法在人间传播。但是，近来的研究表明，禽流感的H5W型的一些毒株能直接感染人类，H9N2亚型同样能由禽类直接传染给人，其原因是它们能同时结合这两种糖链受体。与甲型流感病毒结合的细胞受体是位于细胞膜上糖蛋白或糖脂链末端的唾液酸 (SA)。研究表明流感病毒血凝素(HA)蛋白的受体特异性决定了病毒的宿主范围。人流感病毒HA主要识别和结合末端为SA α 2-6半乳糖(Gal)的唾液酸低聚糖受体，其存在于人呼吸道上皮细胞表面，禽流感病毒HA的主要识别和结合末端为SAa 2_3Gal的唾液酸低聚糖受体，其广泛存在于禽肠胃道的上皮细胞表面。由甲型流感病毒引起的禽流感，其病理变化因感染病毒毒株致病性的强弱和禽种的不同而不同。其临床症状因感染禽的种类、日龄和并发感染情况及所感染毒株的致病性和其他环境等不同而表现出的症状很不一致。长期以来，禽流感的诊断一直依赖于病原的分离和鉴定。近年来，国内外已相继建立了禽流感病毒琼脂扩散(AGP)、血凝抑制试验(HI) 神经氨酸酶抑制试验(Ni)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学诊断技术及分子诊断技术(如RT-PCR)，满足了我国禽流感病毒流行病学监测及现地诊断与防制的迫切需要。病毒分离培养和血凝抑制试验经常作为评价新的检测禽流感病毒方法的对照，但病毒分离培养耗时长，至少需7天，不利于快速诊断，病毒分离的实验条件要求较高，同时有致病性的危险，对毒株的检测及管理上要严格考虑生物安全措施。禽流感病毒在鸡胚培养过程中还可能发生变异。血凝及血凝抑制试验特异性好，但其操作相对繁琐。血清学检查对最后确诊有回顾性诊断价值，一般只能在发病2-3周甚至更长时间才能有抗体阳性出现。由于禽流感病毒血清型众多，新的变异株不断出现，制备血清型特异性单克隆抗体相对困难，且在各种免疫接种的情况下，血凝抑制试验等血清学诊断方法也会失去作用。核酸扩增技术(NAT) 检测禽流感病毒，选择好靶基因和引物及优化反应参数，均可获得高灵敏度和特异性。对于血清型众多的禽流感病毒，不同亚型致病性不同，其宿主分布也不同，故快速、特异地分型在禽流感病毒诊断中显得尤为重要。RT-PCR方法能够获得所有禽流感病毒的已知HA亚型。 上述流感病毒的检测方法中无论是哪一种检测方法，都无法同时对众多型和亚型的流感病毒进行精确的分型。因而有必要寻找一种高效、高通量和快速的流感病毒检测和分型方法。 基因芯片技术的出现为同时对流感病毒进行检测和分型提供了可能的途径。目前国内外已有十多篇关于基因芯片技术在流感检测及亚型鉴别上应用的报道。基因芯片方法仅能够获得所有禽流感病毒的已知亚型，并不能完全检测和评估甲型流感病毒病原的变异和宿主的特异性。
发明内容
为了解决常规检测禽流感病毒手段和检测病毒核酸的方法不能完全评估甲型流感病毒病原的变异和宿主的特异性的技术问题，本发明提供一种快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法。本发明的技术方案如下一种快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，包括以下步骤步骤1 对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化；步骤2 制备糖链磁性微粒复合物；步骤3 将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合；步骤4 将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱；步骤5 对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定，根据鉴定结果，以评估甲型流感病毒宿主特异性。上述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特殊之处在于所述步骤1中对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化包括以下步骤；1)取甲型流感病毒悬液；2)在甲型流感病毒悬液中加入等体积分析纯乙醚；3)再置于4°C的环境中0. 5-2小时，并每隔IOmin充分振荡一次；4)将步骤3)处理后的甲型流感病毒悬液以2000r/min的速度进行10-20min的离心；5)对离心后的甲型流感病毒悬液进行静止分层，吸取下层甲型流感病毒悬液，并转移至另一离心管中；6)将盛有转移后的下层甲型流感病毒悬液的离心管置于通风环境中，直至该甲型流感病毒悬液中的乙醚彻底挥发；7)将步骤6)处理后的甲型流感病毒悬液置于低于_18°C的环境中保存。上述步骤2中制备糖链磁性微粒复合物包括以下步骤1)取2支离心管，分别放入等量羟基化磁性微粒若干l_15mg ；2)对羟基化磁性微粒进行磁性分离；3)对分离后的羟基化磁性微粒弃上清，再用无水乙醇清洗；4)对无水乙醇清洗后的羟基化磁性微粒再次弃上清，再加入偶联缓冲液进行清洗；
5)在装有偶联缓冲液清洗过的羟基化磁性微粒的2支离心管中，以羟基化磁性微粒的量为参照分别加入20-40 μ L/mg的偶联缓冲液；以羟基化磁性微粒的量为参照，再在其中一个离心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的SA α 2-3Gal糖链；另一个离心管以0. 3-0. 75 μ mo l/mg加入的SA α 2_6Gal糖链；6)对2支离心管内的羟基化磁性微粒、偶联缓冲液以及糖链进行混勻；并进行 2-10小时的振荡反应；得到糖链磁性微粒复合物；7)对得到的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，弃上清；8)并用结合缓冲液清洗磁性分离后的糖链磁性微粒复合物；9)清洗完成后，将糖链磁性微粒复合物置于保存缓冲液中保存。上述步骤3中将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合包括以下步骤1)取制备好的上述两种糖链磁性微粒复合物分别放入另外两个离心管中；2)以2mL离心管为例，在每个离心管中分别加入200-1000 μ L结合缓冲液， 20-500 μ L初步纯化甲型流感病毒液和1-10 μ L的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；3)对混勻后的溶液进行0. 5-2小时的振荡反应，得到结合有甲型流感病毒血凝素的糖链磁性微粒蛋白复合物。上述步骤4中将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱包括以下步骤1)对得出的糖链磁性微粒蛋白复合物进行磁性分离，弃上清，并用清洗液清洗；2)将清洗后的糖链磁性微粒蛋白复合物加入洗脱液100-1000 μ L ；3)对加入洗脱液的糖链磁性微粒蛋白复合物进行0. l-2h的振荡反应；4)对反应后的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，获得上清液，即纯化出的甲型流感病毒液血凝素；5)对纯化出的甲型流感病毒液血凝素置于低于_18°C的环境中保存。上述步骤5中对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定具体是分别将两种不同糖链磁性微粒复合物纯化得到的甲型流感病毒液血凝素进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色，从而评估甲型流感病毒宿主特异性。上述评估具体是在电泳图中如果显示洗脱液洗脱下来与SAa 2_6Gal结合的蛋白有明显的条带，分子量为75KD左右，故可判断甲型流感病毒可以感染人类；电泳图中如果显示洗脱液洗脱下来与SAa2-3Gal结合的蛋白有明显的条带，分子量为75KD左右，故可判断甲型流感病毒可以感染禽类。上述步骤5中对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定包括以下步骤1)用荧光染料标记甲型流感病毒血凝抑制实验血清；幻将标记好的甲型流感病毒血凝抑制实验血清与磷酸缓冲液以1 9的比例混合配成抗体溶液；3)将糖链磁性微粒复合物与初步纯化的甲型流感病毒血凝素结合；4)对结合甲型流感病毒血凝素的糖链磁性微粒蛋白复合物用清洗液清洗；5)在清洗后的糖链磁性微粒蛋白复合物中加入100-1500 μ L的抗体溶液，再经振摇反应后得到标记后的糖磁粒蛋白复合物；
6)对标记后的糖链磁性微粒蛋白复合物再次用清洗液清洗；7)吸取50-200 μ L清洗过的糖链磁性微粒蛋白复合物置于玻片上，并进行干燥处理；8)将干燥后的玻片放入荧光扫描仪中扫描，从而评估甲型流感病毒宿主特异性。上述评估具体是如果SAa 2_6Gal糖链磁性微粒蛋白复合物显示有荧光，表明甲型流感病毒可以感染人类；如果SAa 2_3Gal糖链磁性微粒蛋白复合物显示有荧光，表明甲型流感病毒可以感染禽类。上述步骤1中在2支离心管分别放入3mg的羟基化磁性微粒；所述步骤3与步骤 4中的清洗次数至少为3次。本发明具有以下优点1、磁性微�？梢跃鶆虻男≡谝禾逯校庑┪⒘Ｔ谕饧哟懦〉淖饔孟禄岢欢ǖ姆较蚓奂偶姆较虮３忠恢拢背烦饧哟懦『螅⒘５拇偶只岷芸斓幕指闯稍吹淖刺廊豢梢员３衷葱灾剩梢跃鶆虻男≡谝禾逯校虼死么判晕⒘５恼庵痔匦裕� 可把磁性微粒用作分离纯化生物分子的载体。本发明在纯化步骤中利用类似制备糖芯片共价偶联糖链的方法，将磁性微粒与有机试剂进行复合，在微粒表面引入一些功能基团，这些功能基团与引入物质上的基团进行结合就可以将这些物质固定于微粒的表面。能高效率、 快速、简便的对糖结合蛋白(例如甲型流感病毒血凝素)进行分离纯化。2、目前世界卫生组织是根据四个条件来判断流感大爆发是否来临第一，人类对这种病毒有没有免疫力；第二，病毒能够从禽传播到人；第三，能够造成被感染人死亡；第四，能够在人与人之间传播。本发明提供的快速检测甲型流感病毒宿主特异性的方法，适用于禽类及禽类产品的进出口检疫、卫生防疫和流行病学调查。能满足实现快速、高通量检测病毒，适应大规模检疫、预报预测急性、烈性传染病的需要。
图1为本发明以H5N2禽流感病毒Mal lard/JX/16/05为例的电泳结果图；
图1中1-8泳道依次为1 蛋白Marker ；2 :未结合SA α 2_3Gal的蛋白；3 清洗完毕后的洗液组份；4 洗脱液洗脱下来与SAa 2_3Gal结合的蛋白；5 未结合SA α 2_6Gal的蛋白；6 清洗完毕后的洗液组份；7 洗脱液洗脱下来与SAa 2_6Gal结合的蛋白；8 病毒总蛋白。
具体实施例方式实现本发明的实验材料具体如下1)、主要材料和试剂禽流感病毒由哈尔滨兽医研究所提供；自制的羟基化磁性微粒；3，-N-Acetylneuraminy1-N-acetyllactosamine sodium salt(α-NeuNAc-(2 — 3 )-β -D-Gal-(l — 4)-D_GlcNAc)或3，-Sialyllactose ( α -NeuNAc-Q — 3)-β -D-Gal-(1 — 4)-D-Glc)，6，-Sialyllactose sodium salt ( α -NeuNAc-(2 ^ 6)-β -D-Gal-(1 — 4)-D-Gl c)，苯甲基磺酞氟(PMSF)，乙醇胺，ProteinMarker, sigma ；其他常用试剂为国产分析纯。2)、主要试剂的配方
偶联缓冲液0. 2mol/L pH5. 4乙酸乙酸钠缓冲液；结合缓冲液20mmol/LTris-HCl，0. 5mol/L NaCl, 10mmol/L CaCl2,6mmol/L MnCl2, pH7. 2 ；清洗液20mmol/LTris-HCl,0. 5mol/L NaCl，0. 05% Tween20, pH7. 2 ；洗脱缓冲液0.5% SDS ;保存缓冲液10%乙醇胺。3)、主要使用的仪器磁性分离架，陕西北美基因股份有限公司产品；ZHWY 2102C型恒温培养振荡器， 上海智城分析仪器制造有限公司；AB204-S电子天平，瑞士 Mettlertoledo ；移液枪，德国 Epphendorf公司；5415D离心机，德国Eppendorf公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；SK-I高速混勻器，常州国华电器有限公司；DYY-8B型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂；WD-9406型胶片观察灯，北京市六一仪器厂。实现本发明评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，包括以下步骤步骤1 对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化；1)取甲型流感病毒悬液；2)在甲型流感病毒悬液中加入等体积乙醚；3)将加入等体积乙醚的甲型流感病毒悬液于4°C的环境中放置0. 5-2小时，并每隔IOmin振摇一次；4)将处理后的甲型流感病毒悬液以2000r/min的速度进行10-20min的离心；5)对离心后的甲型流感病毒悬液进行静止分层，以吸取下层甲型流感病毒悬液转移至另一离心管中；6)转移后的下层甲型流感病毒悬液置于通风环境中进行排醚；7)对排醚后的下层甲型流感病毒悬液放入低于_18°C的环境中保存。步骤2 制备糖链磁性微粒复合物；1)取2支离心管，分别放入羟基化磁性微粒l_15mg ；以3mg为最佳；2)对羟基化磁性微粒进行磁性分离；3)对分离后的羟基化磁性微粒弃上清，并加入无水乙醇进行清洗3次。4)对无水乙醇清洗后的羟基化磁性微粒再次弃上清，再加入偶联缓冲液进行清洗 3次；5)在装有偶联缓冲液清洗过的羟基化磁性微粒的2支离心管中每管加入90μ L偶联缓冲液，并在其中一管加入 15mmol/L α-NeuNAc-Q — 3) - β -D-Gal-(1 — 4) -D-GlcNAc 或3，-Sialyllactose(α -NeuNAc-O — 3)- β -D-Gal-(1 — 4)-D-Glc)10-100 μ L，以 10 μ L 为佳，另一管加入 15mmol/L α-NeuNAc-Q — 6)-β-D-Gal-(1 — 4)-D-Glc 10-100 μ L ；以 10 μ L为佳。6)对2支离心管内的羟基化磁性微粒、偶联缓冲液、α -NeuNAc-(2 — 3)-β-D-Gal -(1 — 4)-D-GlcNAc、α -NeuNAc-O — 6) - β -D-Gal-(1 — 4)-D_Glc，进行混勻；并进行 2-10 小时的振荡反应；得到糖链磁性微粒复合物，以8小时为佳。7)对得出的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离；8)对磁性分离后的糖链磁性微粒复合物弃上清；并用结合缓冲液清洗3次；
8
9)对结合缓冲液清洗后的糖链磁性微粒复合物置于保存缓冲液中保存。步骤3 将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合；1)取制备好的两种糖链磁性微粒复合物分别放入两个离心管中；2)在每个离心管中分别加入200-1000 μ L结合缓冲液，20-500 μ L初步纯化甲型流感病毒液的血凝素和1-10 μ L的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；3)对混合后的结合缓冲液，流感病毒液和苯甲基磺酞氟进行0. 5-2小时的振荡反应，得到结合有甲型流感病毒血凝素的糖磁粒蛋白复合物。步骤4 将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱；1)对得出的糖链磁性微粒蛋白复合物进行磁性分离，弃上清，并用清洗液清洗 3 5次；2)将清洗后的糖链磁性微粒蛋白复合物加入洗脱液100-1000 μ L，200 μ L最佳；3)对加入洗脱液的糖链磁性微粒蛋白复合物进行0. l-2h的振荡反应，池最佳；4)对反应后的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，获得上清液，即纯化出的甲型流感病毒液血凝素；5)对纯化出的甲型流感病毒液血凝素置于低于_18°C的环境中保存。步骤5 对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定，以获得甲型流感病毒宿主特异性结果，即对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定是分别将两种不同糖链磁性微粒复合物纯化得到的甲型流感病毒液血凝素进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色，从而评估甲型流感病毒宿主特异性。参见图1，结合图对该部分进一步说明。图中泳道7 洗脱液洗脱下来与SAa 2_6Gal结合的蛋白有明显的条带，位置位于 75KD，故可判断其可以感染人类。图中泳道4 洗脱液洗脱下来与SAa 2_3Gal结合的蛋白有明显的条带，位置位于 75KD，故可判断其可以感染禽类。步骤6 对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行评估包括以下步骤1)用荧光染料标记甲型流感病毒血凝抑制实验血清；幻将标记好的甲型流感病毒血凝抑制实验血清与磷酸缓冲液以1 9的比例混合配成抗体溶液；3)将糖链磁性微粒复合物与初步纯化的甲型流感病毒血凝素结合；4)对结合甲型流感病毒血凝素的糖链磁性微粒复合物用清洗液清洗；5)在清洗后的糖磁粒蛋白复合物中加入100_1500μ L的抗体溶液，再经振摇反应后得到标记后的糖磁粒蛋白复合物；6)对标记后的糖磁粒蛋白复合物再次用清洗液清洗；7)吸取50-200 μ L清洗过的糖磁粒蛋白复合物悬液置于玻片上，并进行干燥处理；9)如果SAa 2_6Gal糖链磁性微粒蛋白复合物显示有荧光，表明甲型流感病毒可以感染人类。10)如果SAa 2_3Gal糖链磁性微粒蛋白复合物显示有荧光，表明甲型流感病毒可以感染禽类。
权利要求
1.一种快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，包括以下步骤 步骤1 对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化；步骤2 制备糖链磁性微粒复合物；步骤3 将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合； 步骤4 将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱； 步骤5 对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定，根据鉴定结果，以评估甲型流感病毒宿主特异性。
2.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于 所述步骤1中对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化包括以下步骤；1)取甲型流感病毒悬液；2)在甲型流感病毒悬液中加入等体积分析纯乙醚；3)再置于4°C的环境中0.5-2小时，并每隔IOmin充分振荡一次；4)将步骤幻处理后的甲型流感病毒悬液以2000r/min的速度进行10-20min的离心；5)对离心后的甲型流感病毒悬液进行静止分层，吸取下层甲型流感病毒悬液，并转移至另一离心管中；6)将盛有转移后的下层甲型流感病毒悬液的离心管置于通风环境中，直至该甲型流感病毒悬液中的乙醚彻底挥发；7)将步骤6)处理后的甲型流感病毒悬液置于低于_18°C的环境中保存。
3.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于 所述步骤2中制备糖链磁性微粒复合物包括以下步骤1)取2支离心管，分别放入等量羟基化磁性微粒若干；2)对羟基化磁性微粒进行磁性分离；3)对分离后的羟基化磁性微粒弃上清，再用无水乙醇清洗；4)对无水乙醇清洗后的羟基化磁性微粒再次弃上清，再加入偶联缓冲液进行清洗；5)在装有偶联缓冲液清洗过的羟基化磁性微粒的2支离心管中，以羟基化磁性微粒的量为参照分别加入20-40 μ L/mg的偶联缓冲液；以羟基化磁性微粒的量为参照，再在其中一个离心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的 SA α 2-3Gal糖链；另一个离心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的SA α 2_6Gal糖链；6)对2支离心管内的羟基化磁性微粒、偶联缓冲液以及糖链进行混勻；并进行2-10小时的振荡反应；得到糖链磁性微粒复合物；7)对得到的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，弃上清；8)并用结合缓冲液清洗磁性分离后的糖链磁性微粒复合物；9)清洗完成后，将糖链磁性微粒复合物置于保存缓冲液中保存。
4.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于所述步骤3中将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合包括以下步骤1)取制备好的上述两种糖链磁性微粒复合物分别放入另外两个离心管中；2)以2mL离心管为例，在每个离心管中分别加入200-1000μ L结合缓冲液，20-500 μ L 初步纯化甲型流感病毒液和1-10 μ L的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；3)对混勻后的溶液进行0. 5-2小时的振荡反应，得到结合有甲型流感病毒血凝素的糖链磁性微粒蛋白复合物。
5.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于所述步骤4中将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱包括以下步骤1)对得出的糖链磁性微粒蛋白复合物进行磁性分离，弃上清，并用清洗液清洗；2)将清洗后的糖链磁性微粒蛋白复合物加入洗脱液100-1000μ L ；3)对加入洗脱液的糖链磁性微粒蛋白复合物进行0.l-2h的振荡反应；4)对反应后的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，获得上清液，即纯化出的甲型流感病毒液血凝素；5)对纯化出的甲型流感病毒液血凝素置于低于_18°C的环境中保存。
6.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于，所述步骤5中对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定具体是分别将两种不同糖链磁性微粒复合物纯化得到的甲型流感病毒液血凝素进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色， 从而评估甲型流感病毒宿主特异性。
7.根据权利要求6所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于，所述评估具体是在电泳图中如果显示洗脱液洗脱下来与SAa 2_6Gal结合的蛋白有明显的条带，分子量为75KD左右，故可判断甲型流感病毒可以感染人类；电泳图中如果显示洗脱液洗脱下来与SAa 2_3Gal结合的蛋白有明显的条带，分子量为75KD左右，故可判断甲型流感病毒可以感染禽类。
8.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于所述步骤5中对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定包括以下步骤1)用荧光染料标记甲型流感病毒血凝抑制实验血清；2)将标记好的甲型流感病毒血凝抑制实验血清与磷酸缓冲液以1 9的比例混合配成抗体溶液；3)将糖链磁性微粒复合物与初步纯化的甲型流感病毒血凝素结合；4)对结合甲型流感病毒血凝素的糖链磁性微粒蛋白复合物用清洗液清洗；5)在清洗后的糖链磁性微粒蛋白复合物中加入100-1500μ L的抗体溶液，再经振摇反应后得到标记后的糖磁粒蛋白复合物；6)对标记后的糖链磁性微粒蛋白复合物再次用清洗液清洗；7)吸取50-200μ L清洗过的糖链磁性微粒蛋白复合物置于玻片上，并进行干燥处理；8)将干燥后的玻片放入荧光扫描仪中扫描，从而评估甲型流感病毒宿主特异性。
9.根据权利要求8所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于，所述评估具体是如果SAa 2_6Gal糖链磁性微粒蛋白复合物显示有荧光，表明甲型流感病毒可以感染人类；如果SAa 2_3Gal糖链磁性微粒蛋白复合物显示有荧光，表明甲型流感病毒可以感染禽类。
10.根据权利要求3所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于所述步骤1中在2支离心管分别放入:3mg的羟基化磁性微粒；所述步骤3与步骤4中的清洗次数至少为3次。
全文摘要
本发明涉及快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，首先对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化和制备糖链磁性微粒复合物；再将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合；再将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱；最后对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定，以获得甲型流感病毒宿主特异性结果，判断出流感病毒是否感染人。解决常规检测流感病毒手段和检测病毒核酸的方法不能完全评估甲型流感病毒病原的变异和宿主的特异性的技术问题。具有快速、简便、效率高等优点。
文档编号G01N1/28GK102192941SQ201010118950
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者孙宇, 李铮, 杜亚蓉, 杨刚龙, 王秀荣, 祁会彩, 邓炜娜 申请人:西北大学
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