专利名称：用于检测霍乱弧菌o1群的引物和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测霍乱弧菌01群的引物和试剂盒。
背景技术：
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)属于弧菌属，是霍乱的病原菌，霍乱是一种烈性肠道传染�。橇鞔奔涑�、影响范围广的一种食源性疾�。涞湫土俅脖硐治剐�、呕吐和由此引起的体液丢失、脱水、周身循环衰竭、电解质紊乱、低钾综合症、腹部痉挛甚至死亡，被世界卫生组织确定为必须国际检疫的传染病之一，《中华人民共和国传染病防治法》将其列为应实施“强制管理”的甲类传染病。霍乱肠毒素(Cholera enterotoxin，CT)是引起霍乱疾病的主要原因，产肠毒素基因的调控基因位于霍乱毒力岛(vibrio pathogenicity islancUVPI)。从霍乱爆发流行分离的菌株，大部分具有耐热的菌体(0)抗原和不耐热的鞭毛(H)抗原。根据0抗原不同，目前已将霍乱弧菌分出近200个0血清型。1992年以前，仅01群霍乱弧菌的两个生物型(古典生物型和埃尔托生物型)引发了七次霍乱世界大流行。1992年10月，在印度和孟加拉国首次发生了由非01群霍乱弧菌引起的霍乱大暴发。1989年2月21日中国公布的《中华人民共和国传染病防治法》，规定管理的传染病分为甲、乙、丙三类，霍乱为两种甲类管理的传染病之一。中国国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定霍乱弧菌为必检项目。霍乱弧菌的快速而准确的检测，有利于对其自然流行的监测和预防，并且对生物恐怖活动的防范具有一定的应用价值。目前对该菌的检测，通常是在碱性琼脂平板上经选择性增菌，后通过一系列的生化方法鉴定，费时费力，一般至少要耗时4-6天。且霍乱弧菌在某些不适合生长的条件下， 可形成一种存活但不可培养状态(viable butnot culturabIe state，VBNCS)，采用传统的免疫学方法和生物方法都不能全面的检测和鉴定霍乱弧菌。但利用核酸检测的方法，即使在不进行选择性富集培养和纯化的情况下，也可以进行检测鉴定。因此，基于核酸的检测方法比传统的富集培养的方法更具优势。Taqman荧光PCR方法是核酸检测方法的一种，是在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。它还具有以下优点(1)特异性强引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性。⑵灵敏度高分析PCR产物的对数期，自动化仪器收集荧光信号，避免了许多人为因素干扰。(3)避免污染全封闭反应，无需PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。 (4)实现定量运用标准品获得标准曲线，结合Ct值进行准确定量。(5)高效低耗可实现一管多检。(6)操作简便在线式实时监测扩增结果，不必接触有害物质，操作安全。(7)快速反应时间< 1.5小时。正因为荧光PCR具有这些优势，目前已被广泛应用于微生物检测、疾病监测和临床检验等领域，大大提高了检测效率，缩短了检测周期，降低了检测成本， 提高了经济和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测霍乱弧菌01群的引物，以快速、方便地检测霍乱弧菌01群，该引物由SEQ ID NO :1-2所示的核苷酸序列组成。本发明所述的引物可以用于制备用于检测霍乱弧菌01群的基因芯片和/或试剂盒。其中所述的基因芯片优选为微列阵芯片。本发明还提供一种用于检测霍乱弧菌01群的基因芯片，其包含上述引物。其中所述的基因芯片优选为微列阵芯片。本发明还提供一种用于检测霍乱弧菌01群的试剂盒，其包含上述引物。本发明所述的试剂盒，还包含探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。本发明所述的试剂盒，还可以包含标准品、阳性对照、阴性对照、缓冲液(包括 buffer和dNTP)和DNA聚合酶。应用本发明所述的试剂盒检测霍乱弧菌01群的方法如下(1)提取待检样品中的细菌DNA作为模板；(2)在荧光PCR薄壁管中分别加入缓冲液、引物和探针的混合物，然后加入正对照、负对照或从检测样品中提取的模版DNA，并用ddH20补足到一定体积，混勻；(3)将PCR薄壁管中混勻的混合物在荧光定量PCR仪上扩增；(4)分析荧光定量结果并进行结果判断。本发明配制的一种可检测霍乱弧菌01群的可产业化生产的试剂盒，将荧光PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待检样品基因组，同时经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测、试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得， 用该试剂盒检测检测霍乱弧菌01群操作简便，快速，成本低。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1是菌落PCR鉴定含rfbH基因的阳性克隆的电泳图；图2是霍乱弧菌01群标准品各稀释度的扩增曲线；图3是霍乱弧菌01群标准品制订的标准曲线；图4是霍乱弧菌01群的扩增曲线；图5是未分型的霍乱弧菌和其他弧菌的扩增曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。此外，应理解在阅读了本发明讲述的内容以后，本领域的技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求所限定的范围。本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在 PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(第三版)(J.萨姆布鲁克等著)或按照试剂厂商说明书的条件。所用无机化学和有机溶剂均符合分子生物学试验要求。引物和探针由大连宝生物公司合成，PGEM-T Easy Vector和T41igase均购自Promega，Taq DNA聚合酶购自上海生工生物工程技术公司，荧光PCR仪为美国ABI的7300。实施例1引物和探针设计根据GeneBank公布的霍乱弧菌01群的0抗原基因簇序列(序列接收号X59554)， 通过对该0抗原序列的各基因的功能分析和蛋白质输水结构分析，选择霍乱弧菌01群的 rfbH基因为靶基因，设计特异引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。所设计的引物和探针都经Blast检索能检测出所有已知的霍乱弧菌01群菌，不与其他霍乱弧菌血清型和其他细菌产生阳性结果。最优引物、探针序列组合如下(1)霍乱弧菌 01 群的上游引物，其序列为 VCOlF 5-CGTTGCAGATGCTCGAGTATACC-3 (SEQ ID NO 1) (2)霍乱弧菌 01 群的下游引物，其序列为 VCOlR 5-GAAGAATCAGCACGTTCCGATAT-3 (SEQ ID NO 2)(3)霍乱弧菌 01 群的 TaqMan 探针，其序列为 01-P 5-CAACCTTTTATGCTTTCAGTCGG TGCTCA-3(SEQ ID NO 3)下述为GeneBank公布的X59554号霍乱弧菌01群的rfbH基因的核酸序列(SEQ ID NO :4，下述序列中的开始粗体到末后粗体之间的序列为531bp)及标注的设计引物和探针序列的设计区，其中下划线标识的为real-time PCR上下游引物设计区，斜体为TaqMan 探针设计区。ATGTATTTTTTGGGAATGAAAATGCTTAAAGATATAGTTTCGGTTTTTTATAATTGGCGTATTGTG CATCTATTGGGGGTTTCTACACTTAGAAGTAGATACTCTCGGTCTAAATTTGGACAAACTTGGTTAAGCATCACAAT GTTCGTACAAATTCTCTGTATAGGGCTAATTTGGTCTTT AATATGGAGAATGGGAGTAG ATGATTATTTAC CATATGTCGGTGTTGGACACATAATTTACTTGTTTTATACTCAAACAATTAACGAAAGCACAGGAATCTTCGTTGCA GATGCTCGAGTATACCTAAATGATAGG CAACCTTTTATGCTTTCAGTCGGTGCTCA CATATATCGGAACGTGCT GATTCTTCTTCATAATATACCAACCATATTTTTGCTTGTCATATGGTCTAGCTCGGCAAACTTTGAATTTAGTTTTA TGTTTGTCATTTCGTTGAGTTTAAGTCTGTTTTTCGTCCTATTTGCTAGCTATTTTTGTGCTGTTATTTCAACGAGA TTTAGAGACTTAATCCAGCTGATTGGGCTTTTGATGCAGTTAGCTTTCTTTGTAAGTCCTGTCATGTGGAAAGTAAG CTTTCTACCCGAACAATATCAAAACTATGTGTACATAAATCCATTTGCTTCGCTATTGGAATTAATTAGAAATCCGA TAATAGGAATCGACGTTAAT CCTTTAGCATTTGTTTCGTT AGTAGCATGGACTTTTATAATTGGTATGGTCA GCTACTTCTCGTACAAAGTACTCGATAAAAAAGTCATTTTTTGGGTGTAG实施例2霍乱弧菌01群标准品的制备和标定(I)PCR扩增目的带
用PCR方法将包含有real-time PCR引物和探针的序列扩增出来(引物序列如SEQ ID NO :1-2所示)，PCR反应程序如下94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，50°C退火30秒， 72°C延伸1分钟，进行30个循环；最后72°C继续延伸5分钟，得到PCR产物，用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；产物长度为531bp。PCR产物切胶回收，并用上海生工生物工程技术公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。(2)连接将PCR纯化产物与Promega公司的3 X 10_3的pGEM-T-Easy载体于4°C连接24小时，总体积为 ο μ 1，其中有1 μ 1的IOX缓冲液和0. 5U的T4DNA连接酶，得到连接产物。(3)电转化用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5 α细胞，取2-3 μ 1上述O)的连接产物与60 μ 1感受态大肠杆菌DH5 α混合后，转到Bio-Rad 公司的0. 2cm的电击杯中电击，电压为2. 5kv,时间为5. 0毫秒-6. 0毫秒，电击后立即在杯中加入ImL的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37°C过夜培养，次日得到蓝白菌落。(4)菌落PCR鉴定随机挑取4个白色菌落即白色克隆进行菌落PCR鉴定。PCR反应体系和反应条件同本实施例(1)中的常规PCR相同。反应结束后，取3μ1 PCR扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果见图1所示(泳道M :DL2000Marker，泳道1_4分别为随机挑取的白色菌落1-4)，结果4个克隆经PCR鉴定都有531bp的目的条带，都为正确克隆。(5)质粒提取取上述中鉴定正确的阳性克隆菌落1(命名为H1981)，将其接种于含氨苄的 LB液体培养基中过夜培养，采用《分子克隆试验指南》(第三版)(J.萨姆布鲁克等著)(请确认)中SDS碱裂解法提取质粒。该质粒命名为PLW1536。(6)测序用SP6和T7引物对提取的PLWl536质粒进行测序，结果表明PLWl536所携带的扩增片段序列具有上述的531bp的核苷酸序列，表明PLW1536所携带的531bp的扩增片段与霍乱弧菌01群的rfbH基因待扩增的序列完全一致，构建的质粒序列完全正确。(7)PLW1536 的浓度测定取1 μ 1 PLW1536的原液用NanoDrop OD仪测定OD260值，结果测得的PLW1536原液的浓度为153ng/l·! 1，1 μ 1 PLW1536原液含有4X 101°个拷贝。实施例3.绘制标准曲线将PLW1536 原液 10 倍梯度稀释得到 4X 107、4X 106、4X 105、4X 104、4X IO3 个拷贝 real-time PCR检测，25 μ 1反应体系见下表1 表 lreal-time PCR 反应体系
权利要求
1.一种用于检测霍乱弧菌01群的引物，其特征在于，由SEQ IDNO :1-2所示的核苷酸序列组成。
2.权利要求1所述的引物在制备用于检测霍乱弧菌01群的试剂盒和/或基因芯片中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的基因芯片为微列阵芯片。
4.一种用于检测霍乱弧菌01群的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含探针，该探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包含标准品、阳性对照、阴性对照、缓冲液和DNA聚合酶。
7.一种用于检测霍乱弧菌01群的基因芯片，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。
8.根据权利要求7所述的基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片为微列阵芯片。
全文摘要
本发明提供一种用于检测霍乱弧菌O1群的引物和试剂盒，该引物由SEQ ID NO1-2所示的核苷酸序列组成，其试剂盒中含有上述的引物。使用本发明的引物和试剂盒，经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测霍乱弧菌O1群，操作简便，快速，成本低。
文档编号G01N21/64GK102296107SQ201010212469
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者刘斌, 吴凡, 张曦, 王敏, 王磊, 陈敏 申请人:上海市疾病预防控制中心, 上海市预防医学研究院, 天津生物芯片技术有限责任公司
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