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专利名称：单细胞全环境力学动态调控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分析技术领域，是一种动态调控细胞力学环境的芯片。
背景技术：
细胞作为生命体的基本单元，不断与其环境(包括流体介质与胞外基质)相互作用，这种相互作用使细胞始终处在力学动态变化的环境中，并对细胞的生长、增殖、分化、凋亡和迁移等生命活动产生重要影响。另一方面，细胞活动的一个重要表现就是细胞产生力学变化，并以此进一步调控细胞活动。因此，细胞如何感应环境的力学刺激并将其转换为力学信号、调控细胞活动，即细胞力学，构成了生命活动的基本问题之一。作为支撑平台，细胞力学技术的发展，推动着对这一基本问题的认识不断深入，为改善人类健康发挥着日益重要的作用。传统的细胞力学技术是在固定时间点、静态地研究集团细胞的平均行为，不能对单个细胞进行环境动态调控，已远不能满足现代细胞力学研究与应用的需要。在单细胞水平上，监测随环境变化的细胞力学信号，正成为现代细胞力学技术的主要目标(参见 Discher D, et al. Biomechanics Cell Research and Applications for the Next Decade. Annals of Biomedical Engineering, 2009，37: 847 - 859)。现代细胞力学技术始于微管吸吮技术(MAT)的发明，其核心是利用微管负压调制外力，对微管吸持的单细胞进行粘附强度测试。MAT经过二十多年的发展，已建立起较为成熟的测试系统与理论模型，力的调试精度可达几个皮牛顿(10_12 N)，在细胞和分子生物力学中得到了广泛应用(参见Addae-Mensah KA, Wikswo JP. Measurement techniques for cellular biomechanics in vitro. Experimental Biology and Medicine, 2008, 233: 792 — 809)。
利用光镊、磁镊和原子力显微镜(AFM)等精密手段，通过细胞表面固定力学探针，可施加小至几个飞牛顿(10_15 N)的力，正成为细胞力学研究的重要技术手段，并获得了多项重要禾斗学发现(参见 Neuman KCj Nagy A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods, 2008， 5: 491 - 505)。如采用AFM和流动腔技术，证实了细胞粘附中存在键寿命能够随力增加而增力口的‘‘逆锁键，，(参见 Marshall BT, et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature, 2003，423: 190-193)；采用基于 AFM 的单细胞力谱技术，实现了细胞粘附单个受体-配体键强度的测量(参见Helenius J, et al. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science, 2008， 121: 1785-1791); 采用基于微磁珠的磁扭细胞测量技术，探测到细胞在受到外加短暂拉伸后其力学和动力学行为的改变过程，揭示了一系列新颖的细胞力学行为(参见iTr印at X，et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature, 2007, 447: 592-595)。同时，微纳制造技术也开始应用于细胞力学平台的构建(参见Kim DH, et al. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annual Review of Biomedical Engineering, 2009, 11: 203-233)。其中，采用微流控芯片可对流体介质的力学性质进行动态调节，具有简便、高通量的特点；如通过改变微流流速实现了流体介质的力学动态调控，即对粘着细胞的剪切力调制(参见Lu H, et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry, 2004, 76: 5257-5沈4)。另一方面，利用压电振动可对表面物质进行力学动态调控；如采用厚度剪切振动模式的石英压电谐振器，通过调节其激励电压改变谐振振幅，实现了外力调制，使谐振器表面化学结合的病毒微粒割离脱落(参见Cooper MA, et al. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nature Biotechnology, 2001， 19: 833-837)。单细胞力学的关键技术之一是对单细胞包括流体介质和胞外基质的全部环境同时进行力学动态调控。在这个关键问题上，现有细胞力学分析技术还存在明显不足。如以 MAT、AFM为代表的精密手段，需在细胞表面固定微珠等力学探针，通过使微珠运动直接对细胞进行力学刺激，但不能对胞外基质进行力学动态调节，即存在胞外基质这一环境调控盲区。而细胞与非流体表面接触形成的胞外基质对细胞活动起着十分关键的作用，新近发现作为细胞支撑的胞外基质与细胞核之间存在力学耦合(参见Wang N, Tytell JD, Ingber DE. Mechanotransduction at a distance mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009， 10， 75-82)，因此对胞外基质进行力学调控将具有重要的科学和应用价值。另外，MAT、AFM等技术需要精密、复杂的设备装置，难以实现与高通量芯片的集成，在实现高通量细胞生物力学分析上存在难以逾越的障碍。目前还没有能对流体介质和胞外基质即细胞全环境同时进行力学动态调控的技术报导。

发明内容
本发明的目的是针对现有细胞力学技术存在的上述问题，提供一种单细胞全环境力学动态调控芯片，可同时对单细胞的流体介质和胞外基质进行力学动态调控，不存在环境调控盲区，并具有简便灵活、高通量等特点，适用于生物力学、组织工程、药物筛选、临床医学等领域。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
所述单细胞全环境力学动态调控芯片包含微流控层、压电振动层和至少一个单细胞池；上述微流控层是具有刚性、绝缘性和生物相容性的材料薄片，在该材料薄片的一面采用通常的微细加工方法制作多个溶液出入孔，另一面微加工至少一个凹阱以及多个各种图形的微管道，溶液出入孔分别通过微管道与凹阱连通；上述压电振动层是具有压电性和生物相容性的材料薄片，在该材料薄片的一面采用通常的微细加工方法制作至少一个凹阱，在该材料薄片的两面或一面采用通常的薄膜制备方法制作至少一对电极，压电薄片与其表面的电极对构成压电微谐振器；微流控层与压电振动层键合构成单细胞全环境力学动态调控芯片，微流控层与压电振动层的凹阱两两吻合形成上述单细胞池。本发明将微流控层与压电振动层在芯片上集成，通过调节进入该芯片的微流体的方向和流速进行单细胞的流体介质的力学动态调控，同时通过调节该芯片压电振动的振幅和频率进行单细胞的胞外基质的力学动态调控，从而在芯片上同时实现单细胞的全环境的力学动态调控。
使用本发明时，采用通常微流控的方法，导入细胞溶液并使单个细胞定位于单细胞池；然后通入流体介质；同时采用通常压电振动的方法，使压电振动层与细胞在其表面形成的胞外基质(细胞与压电振动层接触，在两者之间的表面存在胞外基质)产生振动；上述微流控方法包括按各种模式改变流体介质的流速，上述压电振动方法包括按各种模式改变电极对外加电压的振幅和频率。本发明与已有细胞力学技术相比具有以下优点和效果
1、本发明单细胞全环境力学动态调控芯片，通过将微流控与压电振动相结合，具有同时对流体介质和胞外基质的细胞环境进行全方位力学动态调控的优点；
2、本发明单细胞全环境力学动态调控芯片，可动态调控胞外基质的力学行为，具有不存在环境调控盲区的优点，并能对细胞环境进行多模式的力学动态调控；
3、本发明单细胞全环境力学动态调控芯片，具有可阵列化的优点，能应用于高通量单细胞力学分析。本发明设备简单、方法灵活，适用于检测、研究力学环境对细胞的调控作用，在组织工程、药物筛选、临床医学等领域具有广泛的应用前景。


图1是本发明的一种单细胞全环境力学动态调控芯片示意图。图2是本发明的一种单细胞全环境力学动态调控芯片微流控层示意图。图3是本发明的一种单细胞全环境力学动态调控芯片压电振动层示意图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明作进一步地说明，但本发明不限于附图所示实施例。单细胞全环境力学动态调控芯片如图1所示，由微流控层10、压电振动层20和至少一个单细胞池30构成。芯片呈平片形，其片面形状可为圆形、或椭圆形、或边数η ？ 3 的η边形。上述的微流控层10如图2所示，是具有刚性、绝缘性和生物相容性的材料薄片，如石英、玻璃、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯等无机或有机材料。采用通常的微细加工方法，在该材料薄片的一面制作深5(T200 mm、直径5(T500 mm的四个溶液出入孔，分别是细胞溶液入孔 11、两个流体介质入孔12、一个溶液出孔13，在该材料薄片的另一面制作至少一个5(Γ200 mm、直径50 500 mm的凹阱14，以及深50 500 mm、宽100 1000 mm的与溶液出入孔数量对应的具有各种图形的微管道。上述的压电振动层20如图3所示，是采用具有压电性和生物相容性的材料薄片， 如石英、钽酸锂、锆钛酸铅、偏聚氟乙烯等无机或有机材料以及两者混合的复合材料，在该材料薄片的两面(图3A)采用通常的薄膜制备方法制作厚度为0. 1 10 mm、直径0. 6飞.0 mm的电极膜21，电极材料包括钼、金、银、钛、铝等金属或是多种金属的复合材料。在该材料薄片的一面采用通常的微细加工方法制作至少一个直径5(T500 mm的凹阱22，上述凹阱22 位于电极膜21的中心(图3A)。电极膜21也可制作在材料薄片的一面，如图:3B，形成一对， 凹阱22则位于两电极膜21的中间位置。上述的微流控层10与压电振动层20采用通常的键合方法，如热压、超声波微熔融等方法，结成一体构成单细胞全环境力学动态调控芯片，芯片内微流控层10与压电振动层 20的凹阱两两吻合构成单细胞池30。 在该芯片上，采用通常的微流控方法，如采用注射泵调节液速进行液流操控，从细胞溶液入口 11导入细胞溶液，同时从入口 12以相同流速通入同一缓冲溶液，使单个细胞31 在微管道中分离，流入单细胞池30后停止溶液流动，细胞进入细胞池后由于压电振动层的凹阱可使细胞在一定流速以下保持在池内，溶液流动由注射泵控制。然后从入口 12通入流体介质32，通过改变流体介质32的流速，实现流体介质32的力学动态调控。采用通常的压电振动方法，如在电极对上外加交流电压使压电振动层20振动，同时带动压电振动层表面的胞外基质33振动。通过改变外加交流电压的振幅和频率，改变压电振动层20振动的振幅和频率，实现胞外基质33的力学动态调控。如此，采用该芯片，单个细胞被捕获在单细胞池30内，可同时进行其流体介质和胞外基质的力学动态调控。上述力学动态调控包括按各种模式改变上述细胞流体介质的流速以及外加电压的幅度和频率，如流速、幅度和频率等参数随时间按线性、三角等函数关系变化。
权利要求
1. 一种单细胞全环境力学动态调控芯片，其包括微流控层、压电振动层和至少一个单细胞池；其特征在于所述微流控层与压电振动层键合成一体，构成单细胞全环境力学动态调控芯片；所述微流控层由具有刚性、绝缘性和生物相容性的材料薄片制成，其与压电振动层键合面具有多个微管道和至少一个凹阱，另一面有多个溶液出入孔，溶液出入孔分别通过微管道与凹阱连通；所述压电振动层由具有压电性和生物相容性的材料薄片制成，其与微流控层键合一面具有至少一个凹阱，其一面或两面上分布有至少一对电极，压电材料薄片与其表面电极对构成压电微谐振器产生压电振动；在所述调控芯片内，微流控层与压电振动层的凹阱两两吻合构成至少一个单细胞池；所述调控芯片是通过调节进入芯片的微流体的方向和流速进行单细胞的流体介质的力学动态调控，同时通过调节所述芯片压电振动的振幅和频率进行单细胞的胞外基质的力学动态调控，从而在芯片上同时实现单细胞的所有环境的力学动态调控。
全文摘要
本发明提供一种单细胞全环境力学动态调控芯片，包括微流控层、压电振动层和至少一个单细胞池，其特征在于，将微流控层和压电振动层在芯片上集成，通过调节该芯片微流体的方向和流速进行单细胞的流体介质的力学动态调控，同时通过调节该芯片压电振动的振幅和频率进行单细胞的胞外基质的力学动态调控，从而在芯片上同时实现单细胞的所有环境的力学动态调控。本发明旨在解决在单细胞力学技术中存在环境动态调控困难的问题，不存在力学动态调节盲区，并具有简便灵活、高通量的特点，可在细胞和分子层面上、在时间和空间上发现细胞的生物力学特性，适合于生物力学、组织工程、药物筛选、临床医学等广泛领域应用。
文档编号G01N33/487GK102279255SQ20101051299
公开日2011年12月14日 申请日期2010年10月20日 优先权日2010年10月20日
发明者单振秀, 王崇均, 王竹青, 韦晓兰 申请人:重庆工商大学