专利名称：苦皮藤素原药、以及它的制备方法和质量检测方法
技术领域：
本发明属于植物源农药技术领域，具体地，涉及了一种苦皮藤素原药及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。
背景技术：
苦皮藤(Celastrusangulatus MaXim)系卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)多年生藤状灌木植物，分布在河北、山东、河南、陕西、湖北、甘肃、江苏、安徽等省[中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.科学出版社，1999，45 (3): 102]。苦皮藤是我国传统的杀虫植物，民间用其根、皮作蔬菜等农作物的天然无毒杀虫剂，故得名“菜药”、“萝卜药”研究证明其中所含的生物活性成分主要是β - 二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物及其生物碱，这类化合物一般具有强杀虫，抗肿瘤等生理活性。[①赵天增，等.苦 皮藤中一个倍半菇醇醋新活性化合物的结构.中草药，1999，30(4) :241.②吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用[M].化学工业出版社，2010]。目前文献报道的苦皮藤的提取方法均为溶剂回流法，提取溶剂包括石油醚、苯、丙酮、乙醚、甲苯、甲醇、乙醇等；其中工业化生产大多采用苯[朱文丽，等.苦皮藤根皮的化学成分.中国实验方剂学杂志，2011，17(13),271-276.]。虽然乙醇为环保溶剂，但与其他溶剂提取物相比，苦皮藤乙醇提取物化学成分极其复杂、多样，含有大量黄酮、卫矛醇、三萜等其他成分，β - 二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物含量很低(如苦皮素A含量O. 5%左右)左右，溶解性较差，难于制成相应剂型。因此，苦皮藤基本不采用乙醇提取。大孔吸附树脂(macroporous absorption resin)是近40余年来发展起来的一类有机高聚物吸附剂，利用其多孔结构和选择性吸附功能可从中药提取液中分离精制有效成分或有效部位，最大限度地去粗取精，并可实现大规模工业化。目前大孔吸附树脂在植物源农药领域已有应用，但应用于苦皮藤相关产品的工业化生产和乙醇提取物的分离均未见报道。苦皮藤素的品质不在于某个单一成分，其效果是多个成分协同配比的结果。研究证明苦皮藤中主要杀虫活性成分是以4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜骨架的多元醇酯化合物及其生物碱，统称苦皮藤素。苦皮藤素化学成分非常复杂，含有以苦皮素B、苦皮素A为主的多种杀虫成分，但目前苦皮藤原药中苦皮藤素组分的检测方法一是测定苦皮藤原药中水解后产生的苯甲酸，操作步骤极其复杂，结果不可靠，可行性差；二是参照制剂仅对其中一个组分苦皮素A (或苦皮藤素V)进行定量分析[①吴文君，等.植物杀虫剂0. 2%苦皮藤素乳油的研究与开发· Pesticides (农药)，2001，40 (3) : 17.②卢桂荣，等· RP-HPLC法测定苦皮藤素中苦皮素A的含量.河南科学,2007, 25 (3):395.]。这种针对单一成分进行定量分析的质量控制模式不能有效控制苦皮藤原药的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制苦皮藤产品质量的迫切要求。指纹图谱技术已成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[罗国安，等.中药指纹图谱的分类和发展.中国新药杂志，2002，11(1) :46. J0目前关于苦皮藤提取物及其产品的指纹图谱未见报道。
I⑶核磁共振碳谱偶联(I⑶13C NMR coupling)指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱(1H NMR)指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药，2000，31 (11):868-870.]的基础上联合其他技术(例如目前应用最广泛的高效液相(HPLC)指纹图谱技术)提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。随着药品、食品安全日益受到国家和社会的高度重视，可广泛应用于无公害蔬菜、农作物和非作物类的害虫防治的苦皮藤素需求量很大，为IG D核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的应用提供了广阔的基础。苦皮藤素原药及其 制剂的IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的研究与应用，不仅可以解决其中活性成分的定性问题，也为加强其内在成分研究的系统化与标准化，加快植物源农药苦皮藤素现代化的发展，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决植物源农药现有技术、质量等方面存在的问题，本发明的目的在于，提供一种优良的植物源农药苦皮藤素原药及其水乳剂。本发明的另一目的在于，提供一种所述苦皮藤素原药及其水乳剂的制备方法。本发明的又一目的在于，提供一种所述苦皮藤素原药及其水乳剂的质量检测方法。为实现上述目的，本发明提供的一种苦皮藤素原药，其中含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素A6. (T9. 5%，苦皮素B7. 5 9. 5%，苦皮素C和苦皮素F4. 0 6· 5%，苦皮素G6. 5" 0. 5%,苦皮素Α、苦皮素Ε、苦皮藤素C和苦皮藤素ΧΙΧ11. 5 15. 5%,苦皮素Η3. 5飞.0%。本发明苦皮藤素原药中的所述活性成分均为4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。其中，苦皮藤素C的质量百分含量为O. 5^2. 0%，苦皮藤素XIX的质量百分含量为O. 4 I. 5%。本发明所述苦皮藤原药中各活性成分(4-ΟΗ-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物)总的质量百分含量不小于35%。进一步地，苦皮藤原药中各活性成分总的质量百分含量为35. (Γ45. 0%。更进一步地，品种为陕西宝鸡的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为35. (Γ38. 5%，品种为陕西华县的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为42. (Γ45. 0%。本发明提供的苦皮藤素原药为固体状。本发明提供的苦皮藤素原药的制备方法包括称取苦皮藤根或/和皮粉碎，加入体积为2飞倍量、9(Γ95%的乙醇于6(T80°C下回流或超声提取2 3次，每次提取广2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为广2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以20 25%乙醇、40 50%乙醇、75% 85%乙醇和90 95%乙醇冲柱，收集75% 85%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得苦皮藤素原药。这里表示乙醇浓度的百分数均为质量比。进一步地，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201或SP-70，优选HP-20，D-101。进一步地，所述大孔吸附树脂的径高比为8: f 15:1，优选1(Γ12:1。进一步地，苦皮藤根或/和皮粉碎后过1(Γ24目筛。进一 步地，浓缩后滤液的密度为O. 9(Tl. 19。进一步地，用于冲柱的乙醇的体积为浓缩后滤液的2(Γ40倍，优选四次冲柱的体积分别为25，30，40，20倍。苦皮藤根或/和皮中的活性成分，除了本发明苦皮藤素原药所述的成分外，还包括苦皮素U、x ;苦皮素P、苦皮藤素IV、苦皮藤素VII、苦皮藤素XIX ;苦皮素J、苦皮藤素III等4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，以及黄酮、生物碱、三萜等其他类别的成分。本发明提供的苦皮藤原药，可以制成水悬浮剂、可湿性粉剂、水乳剂等各种剂型用于植物源农药杀虫剂。本发明提供的一种苦皮藤素水乳剂，包含所述苦皮藤素原药。本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂，包括以下重量份的成分所述苦皮藤素原药8 10份，乳化剂8 12份，抗冻剂3 5份。本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂，优选地，包括以下重量份的成分所述苦皮藤素原药8、份，乳化剂 Γ Ο份，抗冻剂5份。其中，所述乳化剂为烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚，优选烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚。其中，所述抗冻剂为乙二醇或丙二醇，优选乙二醇。 本发明提供的一种苦皮藤素水乳剂，还包括溶剂。其中，溶剂为水。本发明所述的苦皮藤素水乳剂，其中的辅料，S卩乳化剂、抗冻剂以及溶剂，也可以是本领域的常规种类及用量。还可以使用助剂，也是本领域的常规选择。本发明所述苦皮藤素水乳剂中各活性成分(4-ΟΗ-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物)的总的质量百分含量不小于3%。进一步地，苦皮藤水乳剂中各活性成分总的质量百分含量为3. (Γ4. 0%。更进一步地，品种为陕西宝鸡的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为3. (Γ3. 5%，品种为陕西华县的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为3. (Γ3. 5%。本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂的制备方法，包括将所述苦皮藤素原药与乳化剂、抗冻剂和溶剂按所述比例混合，即得。本发明提供的苦皮藤素原药的质量检测方法，包括以下步骤I)对苦皮藤素原药进行提�。玫胶谢钚猿煞肿榈目嗥ぬ偎卦┨卣魈崛∥铮�2)对苦皮藤素原药特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素原药特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式(IGD核磁共振碳谱指纹图谱)测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤素原药中所述标准参照品的绝对含量；4)利用所述特征峰峰强度(各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度)的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。其中，步骤I)中，苦皮藤素原药特征提取物的制备方法，包括称取苦皮藤素原药，加入体积为6 12倍的氯仿，75 85°C下超声或回流提取2(T40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素特征提取物。苦皮藤素原药特征提取物处理及检测方法如下取苦皮藤素原药特征提取物，溶于CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。其中，步骤2)中，所述苦皮藤素原药特征提取物中的活性成分特征峰为C_15吸收峰，其化学位移为Sc 60. (Γ66. O。进一步地，选择C-8作为特征峰进一步区别苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX，其(C-8)化学位移为δ c73. 3^74. 7 ;选择C_9作为特征峰进一步区别苦皮素C、苦皮素F，其(C-9)化学位移为SJ0. 6 72. 6。其中，步骤2 )中，所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。其中，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中标准参照品的质量百分含量。其中，所述定量分析手段为高效液相色谱(HPLC)法。进一步地，HPLC法的条件为色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为甲醇乙腈和水=(30 40) :(20 30) :(35 45)的混合溶剂，流速为lmL/min，检测波长为242nm。乙腈水优选35:25:40。其中，所述标准参照品为苦皮素B。其中，苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量计算是通过偶联计算公式将IGD核磁共振碳谱和定量分析手段偶联，即步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为
权利要求
1.一种苦皮藤素原药,含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素A6. (Γ9. 5%,苦皮素B7. 5 9. 5%，苦皮素C和苦皮素F4. 0 6· 5%，苦皮素G6. 5 10. 5%，苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIXl I. 5^15. 5%，苦皮素H3. 5^6. 0% ;所述活性成分均为4-0H- β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
2.根据权利要求I的苦皮藤素原药，其特征在于，其中苦皮藤素C的质量百分含量为O.5 2. 0%，苦皮藤素XIX的质量百分含量为O. ri. 5%。
3.根据权利要求I或2所述的苦皮藤素原药，其特征在于，4-ΟΗ-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物总的质量百分含量不小于35% ;优选为35. (Γ45. 0%。
4.权利要求Γ3任意一项所述苦皮藤素原药的制备方法，包括称取苦皮藤根或/和皮粉碎，加入体积为2飞倍量、9(Γ95%的乙醇于6(T80°C下回流或超声提取2 3次，每次提取广2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为广2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以20 25%乙醇、40 50%乙醇、75% 85%乙醇和90 95%乙醇冲柱，收集709Γ80%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得苦皮藤素原药。
5.一种苦皮藤素水乳剂，包含权利要求广3任意一项所述的苦皮藤素原药。
6.根据权利要求5所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，包括以下重量份的成分所述苦皮藤素原药8 10份，乳化剂8 12份，抗冻剂3飞份。
7.根据权利要求6所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，所述乳化剂为烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚；所述抗冻剂为乙二醇或丙二醇。
8.根据权利要求5 7任意一项所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，该苦皮藤素水乳剂中4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的总的质量百分含量不小于3% ;优选为 3. 0 4· 0%。
9.一种权利要求f 3任意一项所述苦皮藤素原药的质量检测方法，包括以下步骤 1)对所述苦皮藤素原药进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤素原药特征提取物； 2)对苦皮藤素原药特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素原药特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度； 3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤素原药中所述标准参照品的绝对含量； 4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素原药中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于，所述苦皮藤素原药特征提取物的制备方法，包括称取苦皮藤素原药，加入体积为6 12倍的氯仿，75 85°C下超声或回流提取2(T40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素原药特征提取物。
11.根据权利要求9或10所述的质量检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述苦皮藤素原药特征提取物中的活性成分特征峰为C-15吸收峰，其化学位移为δ C60. (Γ66. O ;优选地，选择C-8作为特征峰进一步区别苦皮素Α、苦皮素Ε、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX，C-8的化学位移为δ C73. 3^74. 7 ;选择C-9作为特征峰进一步区别苦皮素C和苦皮素F，C-9的化学位移为SC70. 6 72. 6。
12.根据权利要求 Γ I任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中标准参照品的质量百分含量；所述定量分析手段为高效液相色谱法。
13.根据权利要求扩12任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述标准参照品为苦皮素B。
14.根据权利要求扩13任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为
15.根据权利要求14所述的质量检测方法，其特征在于，计算苦皮藤素原药中各活性成分的系数和总系数的公式为
16.一种权利要求51任意一项所述苦皮藤素水乳剂的质量检测方法，利用权利要求9^15任意一项所述方法检测得到苦皮藤素原药中各活性成分的含量，再利用以下公式推算出苦皮藤素水乳剂中各活性成分的质量百分含量=Xn=X1Fn ;其中 Xn为苦皮藤素水乳剂中某一活性成分质量百分含量； X1为用定量分析手段测定得到的苦皮藤素水乳剂中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量； Fn为权利要求15所述的苦皮藤素原药中某一活性成分与其对应的标准参照品质量百分含量的比值系数； 苦皮藤素水乳剂中活性成分组的含量为各活性成分Xn相加之和；该苦皮藤素水乳剂由苦皮藤素原药制备得到。
全文摘要
本发明涉及一种苦皮藤素原药及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。所述苦皮藤素原药，含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素A 6.0~9.5%，苦皮素B 7.5~9.5%，苦皮素C和苦皮素F 4.0~6.5%，苦皮素G 6.5~10.5%，苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX 11.5~15.5%，苦皮素H 3.5~6.0%。该苦皮藤素原药采用大孔吸附树脂法制备得到，质量检测方法采用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术；本发明的苦皮藤素原药含量大幅提高，质量检测方法准确性和稳定性、重复性和可行性也较高。
文档编号G01N30/02GK102893989SQ201210374789
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者张海艳, 赵天增, 董建军, 于立芹, 刘雨晴, 范毅, 郭唯, 常霞, 王伟, 魏悦, 王涛 申请人:河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司, 河南省生物技术开发中心
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