专利名称：那西肽制品生物效价含量的高效液相色谱(hplc)检测方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种饲料药物添加剂那西肽及其各种制品的含量检验 方法，具体涉及那西肽各种制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。
在词料中添加各种药物添加剂，以防止疾�。俳ぃ岣咚橇侠寐剩殉晌橇� 界广泛采用和公认有效的做法之一。半个世纪以来，人们不断寻找更好更新型的添加成分， 以克服传统成分存在的不足和缺陷。新兽药那西肽(又名诺西肽，英文名Nosih印tide )是 生物工程的产物，由Str印Loraycesactuosus发酵产生，是一种新型非吸收型的词用抗生素。 作为新型的含硫环状多肽类抗生素属的新成员，那西肽具有适用范围广，广谱抗菌，促生长 性优良、添加量少、改善饲料利用率，消化道不吸收、机体无残留和对环境影响小、服用安 全性高、基本无耐药性及不与其他抗生素产生交叉等特点，尤其是极好的适应性和极小的残 留特性在饲料工业中得到广泛的应用，是一种比较理想的饲用抗生素换代品。
纯品那西肽是一种黄色结晶，属脂溶性物质，其分子量为1222，分子式为C51H43N13012S6 ， 分子结构(Merck index , fourth edition )，是由12种氨基酸及衍生物形成的的含硫多 肤类物质，结构参见下图。<formula>formula see original document page 3</formula>
背景技术：
由于那西肽的生产是由微生物发酵产物提取纯化而获得的，而在其发酵粗物中存在大量 的与那西肽共生的，分子量及结构式均与之较为近似的其它组分，这些组分也有一定的抗菌 作用，他们应属于与那西肽有相互关联关系的共生组分。因此，在测定那西肽的含量时，其 中非那西肽部分的有效作用也不能被忽略。
抗生素的种类很多，化学性质不同，因此具体检测方法也千差万别，但总归起来可以归 为两类化学测定法和微生物检定法(免疫测定法)。
微生物检定法(免疫测定法)是抗生素国内外公认的通用特效检验方法，其结果能反映 抗菌素中抗菌物质复合组分或称多重组分的综合效应。那西肽生物效价含量现行规定也指定 为微生物检定法来评估结果。
但由于诸多原因，造成目前规定测试方法的实用性差，费时费力而且测定结果精密度难 达到要求。首先，其具体检验过程实验周期较长，单次样品实验需用时平均为18个小时；其 次，单次实验的实验材料的利用率平均为60%—70%，实验材料消耗浪费较大；再者，领啶 结果的方法可信限率出现>5%的概率平均为80%以上。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，采用快速直观的HPLC测定方法，通过 特殊处理，将那西肽制品含量结果能直接表达为生物效价含量。
本发明包括如下内容
那西肽制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法，包括待测样品的预处理， 指定的色谱条件，测定图谱的处理分析等-
(1) 用对那西肽有相当脂溶性的有机溶剂和缓冲液的混合溶液对其制剂进行提�。员隳� 完全提取那西肽，从而获得HPLC测定所需的待测液；
(2) 指定的色谱条件为带紫外可见分光检测器的高效液相色谱仪，乙氰水相=50 :
50的流动相；0.5ml/min 2. Oml/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱； 230nm-250nm的检测波长；
(3) 将测定图谱的各个副峰的面积以面积折算系数(K)对其折算后，再用处理主峰的方法 处理结果，该面积折算系数(K)为1/2 3/4;
(4) 将HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得生物效价含量，含量矫正 系数(P)为0.970 1.050。
本发明所述的提取用的混合溶液中的有机溶剂是指N, N- 二甲基甲酰胺 (N, N-dimethylformaraide DMF)，缓冲液是指磷酸一磷酸盐缓冲液。 以上(2)的所述水相为《0.50%重量百分比的磷酸水溶液。 综上所述1、 本发明叙述了采用有机溶剂与缓冲液的混合溶液高效提取那西肽，以获得待测样提取 液的预处理方法。该处理液可用于那西肽制品含量测定或用于其它非测定目的。
2、 本发明详细叙述了在指定的HPLC条件下测定那西肽制品主成分及相关其它成分含量 的方法，该方法快速实用、干扰少、测定结果重复性好，是一个有效可靠的新颖测定方法。
3、 本发明用HPLC测定结果在处理后可直接代表那西肽制品生物效价含量的方法，以及 在对测定结果进行处理时采用有效而可靠的计算方法。
具体实施例方式
本发明涉及的检测仪器、条件、方法步骤如下
① 、检验设备条件
高效液相色谱仪(带紫外可见分光检测器)
流动相乙氰水相(《0.50%重量百分比的磷酸水溶液)=50 : 50;
流速 0. 5ml/min - 2. 0ml/mim。
检测柱反相碳十八大分子填充柱。
检测波长230nm-250咖。
② 、供试液预处理
标准贮备液
精密称定已知那西肽制品含量(或已知相当的生物效价的)的标准品于适宜的容量瓶中，
加入20ml的DMF液超声至彻底溶解，用面F液稀释到容量瓶满刻度，将其制备成1000ppm的 贮备液。避光低温保存，其有效期为三个月。 标准供试液
上述标准贮备液恢复至室温后，准确移取预先计算所需的体积数，并置于适宜的容量瓶 中，加入10ml的DMF，混均匀后用甲醇液稀释到容量瓶满刻度，将其制备成50ppm的供试液， 或配制成稀释系列液。
用微过滤膜滤过，以备HPLC检验测定用。该液应临用时配制，并尽可能避光。
待检样供试液
精密称定预先计算制备50ppm浓度所需要的待检样品的相当质量，置于适宜体积的容量 瓶中，加入40ml的DMF液液，及10ml的磷酸磷酸盐缓冲液，将样品充分润湿。室温下用超 声或用振摇法提�。瓿珊笥肈MF液液稀释到容量瓶满刻度，而将其制备成约50ppm的待检 样供试液。用微过滤膜滤过，供HPLC检验测定用。该液应临用时配制，并尽可能避光。为保 证置信度，同一批号样应进行三个或以上的同等处理平行样。
③ 、样品HPLC测定
打开HPLC仪器，按照本发明①指定的检验条件进行设定，预运行仪器以获得平稳的基线。用微量注射进样器对标准供试液和待检样供试液操作进样，每个样液每次进样20ul，以获得 相应的色谱谱图。
④ 、测定结果的计算方法
以峰面积外标工作曲线法或以单点峰面积外标法进行处理计算。
⑤ 、不同时间出峰组分在测定结果计算中的处理原则
在处理主峰那西肽峰时，可直接用标准那西肽峰的峰面积外标法(工作曲线法或以单点 计算法)进行比对计算，以求得待检样中那西肽的含量。
在处理非那西肽的其它组分(与主峰有关联性的其它组分峰，副峰)时，可以将各个副 峰的面积先用面积折算系数(K)进行折算后，再用处理那西肽峰同等的计算方法来进行处理。
在直接用标准品主峰计算获得其它副峰的含量结果，已经证明与用这些组分的纯品分别 计算各自的结果之间存在一定的差异，但这种出入非常�。⑶壹负蹩梢院雎圆患啤�
一般情况下，会出现两到三个副峰，但只有一个最接近主峰的副峰才有计算意义。即该 副峰的结果会对最终结果产生一定的影响，而其它副峰结果均可忽略不计。
在特殊的样品中会出现多个较大副峰的情况，此时所有副峰对最终测定结果的影响应该 被重新计算考虑。
◎、在得到那西肽的HPLC结果后，可以直接采用含量矫正系数(P)来计算得出其生物效价含量表达值。
对本发明方案的可行性分析如下-
1、待检样供试液对样品中待测定成分的代表性研究
本发明中使用的用混合液高效提取处理待测样的方法是通过以下研究获得的。 研究理论表明不论采用什么方法进行含量测定，样品的前处理是十分重要的，要求是前处理获得的待检样供试液必须能稳定地代表样品的待测成分的真实含量值。即处理液的回收率较大(》95%)且能保持一定的稳定性(RSD， CV《2%)时，该方法才会是一个可靠的定量 检验方法。
由于那西肽的大分子结构决定了其对提取条件有相当的敏感性，影响那西肽高效稳定地 被提取的因素有很多，如温度、时间、pH、溶剂类型等，均会对其溶出度或者在溶出后的稳 定性产生影响。前处理过程或条件控制得不好，极易造成提取不完全或形成降解。我们用不 同实际含量的预混剂，按不同条件进行提取比较操作，并进行统计分析。通过影响因素的效率统计研究表明前处理条件的不同会导致完全不同的提取液浓度情况，从而导致最终的检测结果不同。只有使用了适宜的处理条件，才能获得较高的回收值。
实验证明
①、采用有机溶剂和缓冲溶液的混合溶液进行处理，才能达到有效率地提取。② 、不同的有机溶剂对脂溶性那西肽进行提取的效果不同。
③ 、采用合适的有机溶剂(DMF)与适宜的缓冲液混合提取那西肽，才可以获得最高的提 取值和最稳定的提取效率。
数据研究表明该提取方法获得的待检样供试液的平均回收率值达到102. 6%，满足90% — 110%的方法要求；此平均回收率的CV (%)为0.6%，明显小于2%的方法理论规定。 2、本发明测试方法可靠性研究
本发明中使用的方法条件组合是通过以下研究获得的。
方法研究理论表明检测方法的可行性和可靠性是决定检测结果的关键。因此需要对其进 行科学的评价，下面通过方法精密度、准确度、线性范围对液相色谱测定方法进行验证
① 、精密度-
方法精密度是指分析结果的重复性或重现性。对于一个实用的定量方法，其重复性的精 密度(既变异系数CVn/。， RSD%)必须控制在尽可能小的范围内，考虑到方法本身和操作因
素外精密度大小还与待测物浓度有关，而一般指标是若浓度在^100mg/kg时，CV(。/。)应芸 5%。
我们用理论含量为0. 5%的某批号制剂样品进行平行性实验，共检测40个平行样。测试研 究数据证明表明在本发明条件下检测获得的样品测试结果的CV (%) =0.539%，明显小于5% 的要求，说明该方法的重复测试精密度完全达到方法理论规定。
② 、准确度
方法的准确度是指测定值与真实值的接近程度，通常采用添加回收率来表示。作为一个可 用的定量方法，回收率一般应在80%~110%的范围内。而作为一个高效的定量方法，回收率 应在控制在95%~105%的范围内，且其回收率的精密度应保持在2%以下。
通过对同一浓度样品的多次重复测试及对不同真实浓度的测试数据研究表明，本方法在那 西肽浓度从0.1%到96.0%范围内，其样品平行测定结果精密度最差为0.30%，满足《2%的要 求；不同浓度的制剂回收率保持在102% —104%的范围内，而各个浓度的回收率精密度最差 为1.24%，满足方法理论规定。
③ 、线性范围-
方法的线性范围表示了该方法可以应用样品测试的广泛性，在此线性范围内的样品使用本 方法进行测试，有线性保障。 一个有效的定量分析方法的有效线性范围，应至少保证5个浓 度的统计线性相关系数r ^ 0.995，并且应保证不同浓度回收率的精密度RSDS59L
通过对那西肽浓度从0.1%到96. 0%的范围内近15个不同真实浓度的那西肽样品的测试数 据研究表明，回收率及回收率CV保持符合方法规定要求外，其线性相关系数r=0. 999984%， 满足方法理论规定。因此认为本方法在此范围内的那西肽制品生物效价含量的测定均适用。3、 测定中其它相关组分峰(副峰)的处理 本发明中测定结果的处理原则是通过以下研究获得的。
由于那西肽是通过微生物发酵培养后再经过某种方法而提纯获得的，因此那西肽中存在着 其它组分。
在正确表达那西肽的生物效价含量时，应该考虑到那西肽是一种生物抗菌素，其共生或共 存的相关组分的作用不应被忽视，应充分考虑那西肽及其它各组分在抗菌中共同表现的综合 效果。而在用免疫测定法(微生物检定法)测定那西肽的生物效价含量时获得的结果， 一定 是那西肽与其共生组分的共同作用结果。这些组分在性质、分子结构或分子量与那西肽不同， 但它们与那西肽存在着相互关联性，或类似或很接近。并且这些组分也表现出一定的抗菌作 用，但比起那西肽的作用效率要低一些。
在用HPLC方法测定那西肽峰(主峰)的时候，这些组分也会出峰，在此笼统地称之为副峰。
理论上，应该分别用这些组分的纯品来分别定量计算这些组分的其含量结果，但这些组 分纯品的获得是十分困难，甚至是几乎不可能的。因此有采用那西肽主峰来直接定量它们， 是一种比较简便的方法，关键是由此会造成多大的测定误差。通过研究表明，采用本简化方 法进行处理后的结果，与实际值的出入非常�。踔良负蹩梢院雎�。
因此，我们在处理这些副峰时，可以采用如下原则来进行计算
① 、可直接用西肽标准品的主峰直接来定量计算副峰而获得其结果。可以将各个副峰的 面积先以某个面积折算系数(K)对其面积进行折算后，再用主峰处理的同等处理方法法处理。
而这个面积折算系数(K)的具体数值是由比较同一浓度样品的HPLC结果与微生物检定法结 果而获得的。通过研究，我们得到该面积折算系数(K) 一般在1/2 - 3/4的范围内。
② 、 一般情况下会出现两到三个副峰，但只有一个最接近主峰的副峰才比较有计算意义， 其它峰极�。锤酶狈宓慕峁宰钪战峁岵欢ǖ挠跋欤渌狈褰峁珊雎圆患�。
③ 、在特殊情况下，会出现多个较大副峰的情况，此时应该重新考虑如何折算所有副峰 对最终测定结果的影响。
4、 那西肽HPLC含量与生物效价含量的转换
本发明中那西肽的生物效价含量用HPLC含量来转换表达的方法是通过以下研究获得的。
由于生物效价能更为准确地反映抗菌素的综合效果，抗生素的测定结果一般要求用生物 效价含量来表达，含硫多肽类抗生素那西肽的最终结果可以用生物检定法测得其生物效价含
那西肽的HPLC测定结果表达了制剂中那西肽和其它成分的质量百分率。由于那西肽制剂抗菌效果是由制剂中那西肽和其它组分表达出来的能力，当制剂中那西肽百分率增高时， 其抗菌效果会增强，同时，其它组分百分率增高也会部分地增强其抗菌效果。
如果这重百分含量与其生物效价含量间存在固定的关联性，即两者的比值保持固定值， 则可以通过HPLC的结果直接换算成其生物效价含量。这种关联可以通过考察两者的比值是 否保持为一个相对固定的系数，并且此系数有高精密度而加以证明。
通过对不同浓度样品的两种测试方法的结果研究表明，此比值P (含量矫正系数)确实存 在。当制剂浓度在0.1% - 96.0%的范围内变化时，研究结果表明含量矫正系数(P)波动很 �。液拷谜凳�(P)的离散系数CV为0.954%,明显小于5%的方法理论要求，这说明那 西肽生物效价含量可以直接用HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得。一 般含量矫正系数(P)保持在0.970 - 1.050的范围内。
本发明采用快速直观的HPLC测定方法，通过特殊处理，将那西肽制品含量结果能直接 表达为生物效价含量，这就大大地縮短了时间，减轻了劳动强度，减少了实验材料的消耗， 因此有较大的实用性和经济价值。
权利要求
1、那西肽制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法，包括待测样品的预处理，指定的色谱条件，测定图谱的处理分析，其特征在于(1)用对那西肽有相当脂溶性的有机溶剂和缓冲液的混合溶液对其制剂进行提取，获得那西肽HPLC待测液；(2)指定的色谱条件为带紫外可见分光检测器的高效液相色谱仪，乙氰∶水相＝50∶50的流动相；0.5ml/min～2.0ml/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm-250nm的检测波长；(3)将测定图谱各个副峰的面积以面积折算系数(K)对其折算后，再用处理主峰的方法处理结果，该面积折算系数(K)为1/2～3/4；(4)将HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得生物效价含量，含量矫正系数(P)为0.970～1.050。(5)该发明方法可同等用于那西肽的发酵原液或其各种制剂。
2、 如权利要求l所述那西肽制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法，所述对那西肽有相当脂溶性的有机溶剂是指N，N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide DMF)， 混合的缓冲液是指磷酸一磷酸盐缓冲液。
3、 如权利要求1所述那西肽制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法，其(2) 的所述水相为《0. 50%重量百分比的磷酸水溶液。
全文摘要
本发明属生物化学技术领域，涉及那西肽制剂生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。在那西肽制剂稀释处理前，预先加入有机溶剂和缓冲液的混合溶液进行提�。徊捎么贤饪杉止饧觳馄鞯母咝б合嗌滓牵仪琛盟啵�50∶50的流动相；0.5ml/min～2.0ml/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm-250nm的检测波长；将各个副峰的面积以面积折算系数(K)对其折算后，再用处理主峰的方法处理结果，将HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得生物效价含量。
文档编号G01N30/89GK101303334SQ20081006241
公开日2008年11月12日 申请日期2008年6月6日 优先权日2008年6月6日
发明者瑜 丁, 曹春华, 胡玉霞, 陈贵才 申请人:浙江汇能动物药品有限公司
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