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专利名称：碱性橙半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全技术领域。具体涉及碱性橙半抗原、人工抗原和抗体的制备 方法及应用。
背景技术：
碱性橙，化学名为2，4- 二胺基偶氮苯，俗名“王金黄“，是一种偶氮类碱性工业染 料，用于腈纶、蚕丝、羊毛、二醋纤单宁媒纤维的染色，也可以用于皮革麻的染色和竹、木、纸 张、蚊香的着色及制造色淀、溶剂染料、阳离子染料。碱性橙在体内代谢成胺类，有强致癌性。根据美国卫生研究所(OTH)化学品健康 与安全数据库资料表明摄取、吸入以及皮肤接触该物质均会造成急性和慢性的中毒伤害。 根据《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》(G B2760)及《中华人民共和国食品卫生 法》的相关规定，该物质为禁止用作食品添加剂的化学制品。由于在中性及偏碱性条件下，碱性橙与蛋白质吸附较牢固，不易褪色，因此有些不 法商人就将其用于豆制品的染色，使腐竹、豆皮的色泽光亮，欺骗消费者，使消费者的身体 健康受到严重影响。对碱性橙残留的检测具有重要的意义。对碱性橙残留的检测目前主要要有薄层层析(TLC)、高效液相色谱/紫外检测器 (HPLC/UVD)、高效液相色谱/光电二级管陈列(HPLC/PDA)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、 气相色谱-质谱联用(GS-MS)等方法。这些仪器检测方法操作复杂、需受过专门训练的专 业人员才能操作，而且存在着适用范围窄、设备昂贵、成本高等问题。目前我国相应的碱性 橙检测技术不完备，很有必要研制更加简单快捷方便的检测方法和产品。免疫检测方法应用于碱性橙的检测相对简单快捷。免疫检测方法包括胶体金免疫 层析法、ELISA法，是目前食品安全快速检测的两种重要方法，已经在食品安全检测中发挥 着越来越明显的作用。免疫检测方法都必须首先制备出碱性橙半抗原、抗原及抗体，然后才 能利用这些试剂建立免疫检测方法。胥传来等公开了一种专利《一种碱性橙II完全抗原的合成方法》(申请号 200910031728. X),以碱性橙II为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联制备 抗体；赵志磊等公开了一种专利《碱性橙人工抗原合成及抗体制备方法》(申请号 200810079538. 0)，以戊二醛为偶联剂分别与牛血清白蛋白。但是，碱性橙与很多偶氮类燃料很类似，其苯环上的氨基数目及位置是区别于其 他染料的特征结构，在半抗原设计时若不保留特征结构，抗体的特异性将受到很大影响。因此，需要寻找新的方法，在半抗原设计时能保留碱性橙的特征结构，保证抗体的 特异性才能获得理想的检测效果。

发明内容
本发明的一个目的是填补碱性橙现有检测技术的不足，提供一种碱性橙人工半抗 原、人工抗原和特异性抗体。
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本发明的另一个目的是提供所述碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的制 备方法。本发明还有一个目的是提供所述碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的应 用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现 提供一种碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体，所述碱性橙人工半抗原具 或式(II)所示结构
权利要求
一种碱性橙人工半抗原，其特征在于具有式(I)或式(II)所示结构其中，式(I)或式(II)中n＝0～3。FSA00000234666000011.tif
2.—种权利要求1所述碱性橙半抗原的制备方法，其特征在于是以间苯二胺与对氨基 苯酸或间氨基苯酸通过重氮化反应生成含羧基的半抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将对氨基苯酸或间氨基苯酸1 3mmol溶于20ml水中，加入IOml0. lmol/1的盐 酸，加入含1. 15 3. 3mmol的亚硝酸钠水溶液lmL，反应2h，反应液为重氮液；(2)将1 3倍于对氨基苯酸或间氨基苯酸物质的量的间苯二胺溶于5mL水中，用 lmol/L盐酸调节pH值至6 7，然后逐滴加入步骤(1)制备得到的重氮液，静置过夜，离心 所得沉淀即为半抗原。
4.一种碱性橙人工抗原，其特征在于具有式(III)或式(IV)所示结构
5.一种权利要求4所述抗原的制备方法，其特征在于可用活泼脂法制备，步骤如下(1)将权利要求1所述的或权利要求2或3制备得到的半抗原5 IOmg溶解于1 3ml 二氧六环或二甲基甲酰胺中，加入5 IOmg 二环己基碳二亚胺和5 IOmg N-羟基琥 珀酰亚胺，反应3. 5 5h，离心除去沉淀得上清；(2)将上清滴入2mLpH值为7. 4 9. 6、lmol/L含有10mg/mL载体蛋白的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，反应8 12h，用0. 85%的生理盐水透析4天得所述抗原。
6.一种权利要求4所述抗原的制备方法，其特征在于还可按照混合酸酐法制备，步骤 如下(1)将权利要求1所述半抗原5 IOmg溶解于1 3ml二氧六环或二甲基甲酰胺中， 加入5 IOmg加入氯甲酸异丁酯，搅拌反应0. 5 2h，得甲液；(2)将载体蛋白10 20mg溶于1 2mLlmol/L、pH 9. 6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液 中，得乙液；(3)将甲液缓慢滴加到乙液中，搅拌反应过夜，反应液用0.85%的生理盐水透析4天得 抗原。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、 匙孔血蓝蛋白或卵清白蛋白。
8.—种权利要求4所述碱性橙抗原的应用，其特征在于是可应用制备碱性橙多克隆抗 体或单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于所述碱性橙抗原或碱性橙多克隆抗体或单克 隆抗体应用于食品样品中的碱性橙残留检测方面。
全文摘要
本发明公开了一种碱性橙半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明以间苯二胺与对氨基苯酸或间氨基苯酸通过重氮化反应生成含羧基的半抗原；通过活泼酯法或者混合酸酐法将所述半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原；以所述人工抗原制备得到碱性橙特异性抗体。所述抗体可用于碱性橙免疫检测，对实现碱性橙的安全监控具有重要实际应用意义。
文档编号G01N33/535GK101962343SQ20101025694
公开日2011年2月2日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者刘珒, 孙远明, 宋利军, 王强, 雷红涛 申请人:华南农业大学