专利名称：一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法。
背景技术：
活细胞成像技术可以在一段时间内实时观察细胞内部结构和细胞生理过程的动态变化，而小动物活体成像系统则可以实时监控细胞在活生物体内的活动和基因行为，这两项技术对生物学研究具有至关重要的作用。采用理想的突光探针来标记感兴趣的分子或细胞是活细胞成像技术和小动物活体成像系统顺利运行的必要前提。常用的荧光探针有荧光蛋白、小分子有机荧光染料和量子点等。荧光蛋白分子比较大，对于一些研究来说并不合适；小分子荧光染料和量子点无机纳米晶颗粒(小于IOnm)对于兴趣分子自然行为的影响更小。其中量子点荧光探针具有光稳定性好，荧光强度高，可以长时间实时监控等多种优点1_3。量子点探针在荧光成像应用中多与抗体、蛋白质或者糖类偶联使用；用于标记细胞时由于透膜性差，不能直接标记细胞。现阶段用于标记活细胞的量子点探针通常与穿膜肽(具有细胞膜穿透能力的小分子多肽)偶联后，借助穿膜肽的作用被导入细胞。例如Invitrogen公司的Qtracker CellLabeling Kits系列探针。穿膜肽修饰的量子点探针不仅制作成本高,而且由于穿膜肽的原因，量子点探针进入细胞后以囊泡的形式分散在胞浆中。这些囊泡的存在对目的细胞自然行为的影响远大于荧光蛋白，也 使量子点直径小、对兴趣分子影响小等优点不复存在。所以，对量子点探针的修饰方法仍有待改进。
发明内容
针对上述缺点，本发明公开了一种甘氨酸修饰的量子点荧光探针标记活细胞的方法。成功标记后，量子点-甘氨酸探针主要分布在胞浆中的线粒体和内质网上，发光分散均匀，可用于在激光共聚焦显微镜下或小动物活体成像系统中示踪活细胞。本发明采用的技术方案是，一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法，包括如下步骤
O甘氨酸与量子点偶联制备探针
将羧基水溶性量子点和甘氨酸分散在50mM硼酸盐缓冲液中(pH8. 4，含O. 05% NaN3)，加AN- (3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)，使水溶性量子点和甘氨酸在EDAC作用下进行偶联，得到量子点-甘氨酸偶合物；截留分子量为50kDa的超滤管纯化浓缩量子点-甘氨酸偶合物，即得量子点-甘氨酸探针。水溶性量子点包括羧基官能团水溶性量子点和氨基官能团水溶性量子点，进行偶联时，所述羧基官能团水溶性量子点的羧基与甘氨酸的氨基进行偶联，或氨基官能团水溶性量子点的氨基与甘氨酸的羧基进行偶联。鉴定量子点-甘氨酸探针，纯化的量子点-甘氨酸偶合物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图1所示。从上往下为负极到正极，电压为100V，60min，302nm紫外激发，537nm±35nm滤光片成像；从左到右分别为1:羧基官能团水溶性量子点、2:量子点-甘氨酸探针。2)细胞培养
采用胰酶组织消化法制取乳鼠组织细胞悬液，将乳鼠组织细胞悬液接种至细胞培养板或细胞培养瓶，置入细胞培养箱培养2 3d。3)量子点-甘氨酸探针标记细胞
弃去步骤2)中的细胞培养板或细胞培养瓶中的培养基，用磷酸盐缓冲液轻柔漂洗2 3次后，加入含有O. 5 μ M量子点-甘氨酸探针或O. 5 μ M水溶性量子点的磷酸盐缓冲液，37°C孵育30min后去除含有O. 5 μ M量子点-甘氨酸探针或O. 5 μ M水溶性量子点的磷酸盐缓冲液，用磷酸盐缓冲液轻柔漂洗2 3次，更换为普通细胞培养基，完成活细胞标记。4)激光共聚焦显微镜观察
根据水溶性量子点的类型选择相应的激发波长，将步骤3)中标记好的活细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。采用本发明方案达到的有益技术效果如下1、制备量子点-甘氨酸探针，只需要一步反应即可实现，反应时间短，实验条件要求不高，制备探针时可以快速实现，且成本低廉。2、量子点的羧基和甘氨酸的氨基通过化合反应高稳定性结合，制备的量子点-甘氨酸探针非常稳定，可以长期保存。3、探针使用方法简单方便，孵育时间短。
4、甘氨酸是必须氨基酸的一种，对细胞没有毒性，甘氨酸标记的量子点探针在使用中也未发现明显的细胞毒性。5、标记后，量子点-甘氨酸探针主要分布在胞浆中的线粒体和内质网上，发光分散均匀，可用于在激光共聚焦显微镜下或小动物活体成像系统中示踪活细胞。
图1为羧基官能团水溶性量子点和量子点-甘氨酸探针的琼脂糖凝胶电泳照片； 图2为羧基官能团水溶性量子点和量子点-甘氨酸探针标记心机细胞的照片，图中ER
表示内质网，Mito表示线粒体，QDs表示羧基水溶性量子点，QDs-Gly表示量子点-甘氨酸探针。
具体实施例方式该量子点-甘氨酸探针可适用于各种活细胞的标记，使用方法类似。但根据细胞的类型和培养方式(悬浮、贴壁)不同标记效果可能有差异，需要的探针浓度也应根据需要做出调整。并且羧基官能团水溶性量子点的羧基与甘氨酸的氨基偶联获得的量子点-甘氨酸探针，和氨基官能团水溶性量子点的氨基与甘氨酸的羧基偶联获得的量子点-甘氨酸探针在不同细胞实验和实验条件下达到的效果可能不同。下面以原代培养心肌为例具体说明。(一)试剂和仪器1、细胞采用原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞2、主要试剂
DMEM/F12培养基(Hyclone，美国)、胎牛血清(FBS ;Gibico，美国)、5_溴-2-尿嘧啶脱氧核苷(Brdu ;Sigma，美国)、胰酶(Amresco，美国)、羧基水溶性量子点(COOH-QDs)、量子点-甘氨酸探针(QDs-Glycine)、MitoTracker probes (M7513; Molecular ProbesTM,美国)、ER-Tracker Red (C1041; Beyotime,中国)；憐酸盐缓冲液(PBS)。3、主要仪器
细胞培养箱(Heraeus，德国)、激光共聚焦显微镜(TCS SP2 ;Leica，美国)。(二)实验步骤1、原代乳鼠心肌细胞培养
采用胰酶组织消化法制取心肌细胞悬液，并采用差速贴壁法和BrdU化学抑制法抑制成纤维细胞生长以纯化培养的心肌细胞。具体操作简述如下
取出生后I 3 d SD乳鼠，取其心室肌部分于PBS中反复清洗。将心肌组织剪碎至Imm3大�。迫胂恐杏�0. 1%胰酶磁力搅拌器搅动，37°C反复消化8 10次，每次5 8min，直至组织完全消化。收集上清以含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基灭活残留胰酶活性，快速离心5 min (I, 000 rpm)，收集沉淀并加入含有10 %胎牛血清和0. 01 mo I/L Brdu的DMEM/F12培养基，轻轻吹打至混匀。心肌细胞悬液转移至培养皿中。37°C静置60 min使成纤维细胞贴壁。细胞悬液接种至活细胞培养皿，置入细胞培养箱，隔日换液。2、量子点-甘氨酸 探针标记心肌细胞
培养2 3 d后的心肌细胞弃去原培养基，用PBS (37 °C )轻柔漂洗2 3次后，加入含有量子点-甘氨酸探针(0.5 μ M)或羧基水溶性量子点(0.5 μΜ)的PBS，37 1孵育30min后去除含量子点的培养基，用PBS (37 °C )轻柔漂洗2 3次，更换为普通培养基，然后用MitoTracker probes或ER-Tracker Red标记线粒体或内质网，置于激光共聚焦显微镜下观察。3、激光共聚焦显微镜下观察
根据MitoTracker probes,ER-Tracker Red和偶联量子点的类型选择合适的激发波长，激光共聚焦显微镜下观察摄像。(三)实验结果
如图2所示，第一列为内质网(ER)或线粒体(Mito)，第二列为量子点或甘氨酸-量子点探针标记的照片，第三列为第一列和第二列重合后的照片。在原代培养的心肌细胞中，未经甘氨酸修饰的羧基水溶性量子点(QDs)几乎不能透过细胞膜进入细胞，主要分布在胞膜周围，如第二列第一排和第三排所示。量子点与甘氨酸偶联后透膜能力强，量子点-甘氨酸探针(QDs-Gly)大量进入细胞，在胞浆中弥散分布，但不能进入细胞核；与内质网和线粒体的融合成像提示，QDs-Gly在线粒体和内质网上均有分布，如第三列第二排和第四排中浅色部分；与QDs相比较,QDs-Gly的颗粒更加细小均勻，提示量子点的成团(aggragate或cluster)现象减少，更有利于体现量子点在纳米水平上的标记优势。参考文献
lMattoussi H, Jaiswal J, Simon S， Mauro J. Long-term multiple colorimaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nat Biotechnol.2003;21:47-51。
2Resch-GengerU，Grabolle M，Cavaliere-Jaricot S，Nitschke R，Nann T. Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels. Nat Methods.2008;5:763-75。3GaoX，Yang Lj Petros J，Marshall F，Simons J，Nie S.1n vivomolecular and cellular imaging with quantum dots. Curr Opin Biotechnol.2005;16:63-72 PMI D 15722017。
权利要求
1.一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法，包括如下步骤 1)甘氨酸与量子点偶联制备探针 将羧基水溶性量子点和甘氨酸分散在50mM硼酸盐缓冲液中，加入N- (3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐，使水溶性量子点和甘氨酸进行偶联，得到量子点-甘氨酸偶合物；截留分子量为50kDa的超滤管纯化浓缩量子点-甘氨酸偶合物，即得量子点-甘氨酸探针； 2)细胞培养 采用胰酶组织消化法制取乳鼠组织细胞悬液，将乳鼠组织细胞悬液接种至细胞培养板或细胞培养瓶，置入细胞培养箱培养2 3d ; 3)量子点-甘氨酸探针标记细胞 弃去步骤2)中的细胞培养板或细胞培养瓶中的培养基，用磷酸盐缓冲液轻柔漂洗2 3次后，加入含有0. 5 ii M量子点-甘氨酸探针或0. 5 ii M水溶性量子点的磷酸盐缓冲液，37°C孵育30min后去除含有0. 5 U M量子点-甘氨酸探针或0. 5 U M水溶性量子点的磷酸盐缓冲液，用磷酸盐缓冲液轻柔漂洗2 3次，更换为普通细胞培养基，完成活细胞标记； 4)激光共聚焦显微镜观察 根据水溶性量子点的类型选择相应的激发波长，将步骤3)中标记好的活细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法，其特征在于所述水溶性量子点包括羧基官能团水溶性量子点和氨基官能团水溶性量子点。
3.根据权利要求2所述一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法，其特征在于水溶性量子点和甘氨酸进行偶联时，所述羧基官能团水溶性量子点的羧基与甘氨酸的氨基进行偶联，或氨基官能团水溶性量子点的氨基与甘氨酸的羧基进行偶联。
全文摘要
本发明公开了一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法。包括甘氨酸与量子点偶联制备探针、甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞、活细胞成像和示踪等步骤。量子点难透过细胞膜，用于活细胞成像探针必须与其他分子偶联以便进入细胞，现比较常用的偶联分子是穿膜肽。用水溶性量子点与甘氨酸偶联，可以增加量子点的透膜能力，使其进入细胞发挥标记和示踪活细胞的作用。甘氨酸修饰的量子点均匀分布在胞浆中，发光分散均匀，而未修饰的量子点主要附着于细胞膜上，颗粒相对粗大，且不均匀。与穿膜肽修饰的量子点比较，甘氨酸修饰的量子点探针具有成本低、制作快速、性质稳定、使用方便、胞内分布均匀等特点。
文档编号G01N21/64GK103048298SQ20121056087
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者胡炯宇, 韩健, 黄跃生 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
