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专利名称：胶体金－银增强方法检测蛋白质芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种通过胶体金-银增强方法检测蛋白质芯片的方法。
背景技术：
蛋白质芯片是研究生物体蛋白质组动态变化的重要工具，它可以用来在临床检验上实现同时检测多种蛋白质标识分子。通常，蛋白质芯片是由可特异识别样品中不同蛋白质标识分子的各种探针在片基上所形成的微阵列。现有的蛋白质芯片大都采用已在DNA芯片技术中成熟应用的荧光标记的检测方法(MacBeath，G.，和Schreiber，S.L.(2000)Science 289，1760-1763.Robinson，W.H.et al(2002)Nature Medicine 8，295-301.Zhu，H.et al(2001)Science 293，2101-2105)。然而荧光探针和激光生物芯片扫描仪居高不下的价格一定程度上限制了生物芯片的广泛应用，尤其是临床检验中的应用。
胶体金标记和银增强反应在免疫组织化学技术上的各自应用分别已经有几十年的历史。由于其制备和应用的方便和低成本，以及检测设备的简单等优点，因此本领域一直想开发低成本、简便有效的检测生物芯片的方法。
最近有人将胶体金标记和银增强反应两者尝试用在DNA芯片检测上，取得了和荧光方法相近的灵敏度(Taton，T.A.，Mirkin，C.A.，和Letsinger，R.L.(2000)Science 289，1757-1760)。然而到目前为止，由于技术不成熟等种种原因和，尚没有将胶体金标记和银增强反应组合用于蛋白质芯片检测的报道。
综上所述，本领域对于蛋白质芯片的有效检测手段还仅限于荧光标记的检测方法，成本居高不下。另外，蛋白质芯片的另一种检测方法-酶联免疫反应检测方法-不适用于以载玻片为片基的蛋白质芯片的检测。因此本领域迫切需要开发简便有效且低成本的检测蛋白质芯片的方法。

发明内容
本发明的目的就是提供一种简便有效且低成本的检测蛋白质芯片的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测蛋白质芯片的方法，包括以下步骤(a)在待检测物质与蛋白质芯片点样区的点样蛋白形成结合的条件下，将蛋白质芯片与待检测样品反应，在蛋白质芯片上形成待检测物质-点样蛋白的第一复合物；(b)将步骤(a)的蛋白质芯片与识别第一复合物的识别分子反应，形成由第一复合物和识别分子构成的第二复合物，其中所述的识别分子带有第一偶联配对物；(c)将步骤(b)的蛋白质芯片与带有第二偶联配对物的胶体金溶液混合，形成由第二复合物和胶体金构成的第三复合物，其中第二偶联配对物和第一偶联配对物之间形成偶联；(d)将步骤(c)的蛋白质芯片与银增强溶液混合，使银离子在金的催化下形成金属银；(e)中止步骤(d)的蛋白质芯片的银增强反应，并检测蛋白质芯片各点样区的灰度值。
在另一优选例中，蛋白质芯片点样区的点样蛋白是抗原，而待检测物质是抗所述抗原的抗体。
在另一优选例中，待检测物质是抗原，而蛋白质芯片点样区的点样蛋白是抗所述抗原的抗体。
在另一优选例中，所述抗原是病原体抗原。
在另一优选例中，所述的第一偶联配对物选自下组生物素、生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素或其混合物，第二偶联配对物选自亲和素、卵白亲和素、链亲和素、或其混合物。
在另一优选例中，步骤(b)中的识别分子是抗第一复合物的抗体。
在另一优选例中，步骤(d)中的银增强溶液是通过混合将含可溶性银盐(如硝酸银)的银增强溶液A和含氢醌的银增强溶液B而制得的。这些溶液可用常规方法购买或者从Sigma公司等购得。
在另一优选例中，在步骤(a)中，结合于蛋白质芯片中各点样区的待检测物质点样蛋白的数量为1pg-1ng/点样点。
在另一优选例中，在步骤(a)中，待检测样品中的待检测物质的浓度为1ng-5μg/ml。
在另一优选例中，在步骤(a)中，待检测样品中的待检测物质的浓度为2ng-2.5μg/ml。


图1显示了胶体金-抗体复合物识别和信号的银增强示意图。
图2显示了银增强时间对灰度值的影响。其中，芯片上人IgG的点样浓度为250μg/ml。生物素偶联的抗人IgG的浓度分别为110ng/ml(▲)，1.1μg/ml(■)，和11μg/ml(●)。
图3显示了点的灰度值和芯片上固定的人IgG的浓度的依赖关系。其中，内插图是不同浓度的人IgG所形成的微阵列的胶体金-银增强检测图像。1到12列的人IgG点样浓度依次为；2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.13mg/ml，62.5μg/ml，31.25μg/ml，15.63μg/ml，7.8μg/ml，3.9μg/ml，1.95μg/ml和0.97μg/ml。生物素偶联的抗人IgG的浓度为11μg/ml；银增强时间为15分钟。曲线中的数据取自内插图中7个重复点的平均值。
图4显示了溶液中不同浓度生物素偶联的抗人IgG的检测。其中，(A)用胶体金-银增强方法检测溶液中不同浓度生物素偶联的抗人IgG的图像。微阵列中所有点都是由250μg/ml人IgG形成的。生物素偶联的抗人IgG的浓度标明在图的左方。银增强时间为25分钟。
(B)胶体金-银增强方法的检测动态范围。数据按图3的方法取自(A)中的图。
图5显示了人IgG形成的微阵列的胶体金-银增强检测图像。其中，黑色的点均为250μg/ml人IgG。空白点B2，D2和F2250μg/ml牛血清白蛋白；B4，D4和F4100μg/ml兔肌球蛋白；B6，D6和F6磷酸盐缓冲液。生物素偶联的抗人IgG的浓度为110ng/ml。银增强时间为20分钟。
图6显示了胶体金-银增强方法和荧光方法检测TORCH抗原芯片的图像。其中，银增强时间为15分钟。荧光图像为ScanArray 5000扫描，激光能量和光电倍增管增益的设置均为80％。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，发现将胶体金法和偶联银增强法巧妙合理地组合起来检测方法，可以有效地检测蛋白质芯片的杂交结果，在此基础上完成了本发明。
可用于本发明的蛋白质芯片没有特别限制，可以是本领域的各种蛋白质芯片。通常，蛋白质芯片包括(a)常规固相载体(即基片)、(b)位于基片上点样区的点样蛋白。点样蛋白可以是任何种类的蛋白，代表性的蛋白是抗原和抗体。
如本文所用，术语“蛋白质芯片固相载体”就是在其上点有蛋白质点样点的基片材料，常见的载体包括玻璃片、塑料片、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜等，其中特别优选的是NC膜、玻璃载玻片。
可用于本发明的识别分子没有特别限制。代表性的例子包括(但并不限于)抗体(识别抗原)、抗原(被抗体识别)、配体(识别受体)、受体(识别配体)等。
可用于本发明的偶联配对物没有特别限制。代表性的例子包括(但并不限于)生物素-亲和素构成的配对物，地高辛-抗地高辛抗体构成的配对物等。
可用于本发明的亲和素没有特别限制。代表性的例子包括(但并不限于)卵白亲和素、链霉亲和素或其混合物等。
可用于本发明的生物素没有特别限制。代表性的例子包括(但并不限于)活化生物素，例如生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素、生物素酰肼或其混合物等。
用于本发明的银增强技术和试剂没有特别限制，可以选用本领域现有的技术和试剂(例如已经商品化的试剂)。
现参见图1。在该代表性的优选例中，蛋白质芯片点样区的点样蛋白是抗原，而待检测物质是抗所述抗原的抗体(如人IgG)，带有第一偶联配对物(partner)的识别分子是带有生物素标记的抗-人IgG抗体，带有第二偶联配对物(partner)的胶体金是带有链亲和素的金颗粒(或称为金偶联的链亲和素)。
更具体地，代表性的例子是对TORCH芯片的检测。TORCH芯片是一种常规的的蛋白质芯片，其中点样蛋白是TORCH的五种抗原CMV、Tox、Rub、HSV和CVB6，带检测的物质是血清中抗TORCH抗原的抗体，带有第一偶联配对物(partner)的识别分子是带有生物素标记的抗-人IgG抗体，带有第二偶联配对物(partner)的胶体金是带有链亲和素的金颗粒(或称为金偶联的链亲和素)。
蛋白质芯片首先与欲检测的样品反应，然后与胶体金-识别分子复合物反应，然后将含有银离子的银增强溶液A和含有还原剂的银增强溶液B混合，立即与上述蛋白质芯片反应。银离子在金的催化下被还原成金属银，生成的金属银又可以自催化更多的银离子还原为金属银。一定时间内金属银在蛋白质芯片表面沉积的量与蛋白质芯片上探针所结合的样品中标识分子的量有关(图1)，在蛋白质芯片的图像中反映为各个探针点的灰度值。
测量每个点的灰度值，与同一芯片上的标准曲线对照，可以间接确定每个点所结合样品中标识分子的量。
基于胶体金-银增强反应来检测蛋白质芯片的具体过程如下首先将蛋白质芯片与胶体金-特异识别分子复合物反应(例如常温1小时)，充分洗涤除去多余的胶体金-特异识别分子复合物以及其他金属离子。然后将银增强溶液A和B混合，与上述芯片反应，选择适当的时间(通常为5-60分钟，较佳地为5-30分钟，更佳地为5-25分钟)。充分洗涤，中止银增强反应。银增强时间的选择以及芯片表面的清洁度对于胶体金-银增强方法检测蛋白质芯片十分重要。然后置普通低倍显微镜下用普通数码相机拍照。测算每个点的灰度值，进行数据分析。
用于上述检测的胶体金和特异识别分子可用常规方法制备和偶联，或者直接购买商品化试剂。银增强溶液A和B是商品化试剂(购自Sigma公司)，图像获取可以用普通数码相机配合普通显微镜。
本发明人实现了最低固定在载玻片上的人免疫球蛋白分子G(IgG)检测限量为1pg，线性动态范围从4pg到1ng。
可以检测到溶液中抗人IgG的最低浓度为2.75ng/ml(17.2pM)，线性动态范围为5.5ng/ml(34.4pM)到1.4μg/ml(8.8nM)。
与常规的荧光芯片检测法相比，本发明的胶体金-银增强方法得到了和荧光检测方法相近的结果，可以达到实际应用的要求，同时成本却可以大大降低。
本发明的主要优点在于(1)胶体金-银增强的检测方法不需要昂贵的荧光试剂，检测试剂的制备和应用很方便且成本低廉。
(2)不需要昂贵的专用检测仪器，检测设备简单，不像荧光方法一样那么复杂。
因此，本发明方法在临床检验和一般的实验室应用中有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1通用的胶体金-银增强法检测条件(a)蛋白质芯片与待检测样品在室温反应1小时，然后依次用PBST(含0.1％Tween 100的PBS)、PBS和去离子水洗涤，200g离心甩干；形成待检测物质-点样蛋白的第一复合物；(b)将步骤(a)的蛋白质芯片与识别第一复合物的识别分子反应，形成由第一复合物和识别分子构成的第二复合物，其中所述的识别分子带有第一偶联配对物；反应条件及洗涤、甩干方法同步骤(a)；(c)将步骤(b)的蛋白质芯片与带有第二偶联配对物的胶体金溶液混合，形成由第二复合物和胶体金构成的第三复合物，其中第二偶联配对物和第一偶联配对物之间形成偶联；反应条件及洗涤、甩干方法同步骤(a)；(d)将银增强溶液A、B(购自Sigma公司)等比混合，立即与步骤(c)的蛋白质芯片室温反应，反应时间可以通过跟踪银增强的效果确定；(e)大量去离子水冲洗步骤(d)的蛋白质芯片以终止银增强反应，置低倍显微镜下用数码相机拍照，测量蛋白质芯片各点的灰度值。
实施例2胶体金-银增强法检测中银增强溶液与蛋白质芯片混合时间对结果的影响重复实施例1的方法，不同点在于，然后将银增强溶液A和B混合，与蛋白质芯片反应，分别在5、10、15、20、25和30分钟中止反应。然后测定灰度值。
结果如图2所示，在不同浓度(蛋白质芯片上人IgG的点样浓度为250μg/ml。生物素偶联的抗人IgG的浓度分别为110ng/ml(▲)，1.1μg/ml(■)，和11μg/ml(●))下，当银增强溶液与蛋白质芯片混合时间宜为5-30分钟，更佳地为5-25分钟。
实施例3结合于蛋白质芯片中各点样区的点样蛋白的数量对结果的影响重复实施例1的方法，不同点在于，改变结合于蛋白质芯片中各点样区的点样蛋白的数量。然后测定灰度值。
结果如图3所示，显示了点的灰度值和芯片上固定的人IgG的浓度的依赖关系。其中，内插图是不同浓度的人IgG所形成的微阵列的胶体金-银增强检测图像。1到12列的人IgG点样浓度依次为；2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.13mg/ml，62.5μg/ml，31.25μg/ml，15.625μg/ml，7.8μg/ml，3.9μg/ml，1.95μg/ml和0.97μg/ml。生物素偶联的抗人IgG的浓度为11μg/ml；银增强时间为15分钟。曲线中的数据取自内插图中7个重复点的平均值。
结果表明，最低固定在载玻片上的人免疫球蛋白分子G(IgG)检测限量为1pg，线性动态范围从4pg到1ng。
实施例4检测样品中待检测物质的浓度对结果的影响重复实施例1的方法，不同点在于，改变待测样品中待检测物质的数量浓度。然后测定灰度值。
结果如图4所示，图4显示了溶液中不同浓度生物素偶联的抗人IgG的检测。其中，其中，图4A是用胶体金-银增强方法检测溶液中不同浓度生物素偶联的抗人IgG的图像。微阵列中所有点都是由250μg/ml人IgG形成的。生物素偶联的抗人IgG的浓度标明在图的左方。银增强时间为25分钟。图4B是胶体金-银增强方法的检测动态范围。数据按图3的方法取自图4A。
结果表明，可以检测到溶液中抗人IgG的最低浓度为2.75ng/ml(17.2pM)，线性动态范围为5.5ng/ml(34.4pM)到1.4μg/ml(8.8nM)。
实施例5胶体金-银增强法检测按常规方法(将点样蛋白溶解在含40％甘油的PBS缓冲液中，利用生物芯片点样仪在活化的玻璃载玻片上)制作了人的IgG芯片，与生物素标记的羊抗人IgG反应，然后与链霉亲合素-胶体金复合物反应，随后进行银增强反应。方法同实施例1图5显示了应用胶体金-银增强检测方法对该芯片的检测结果。从图中可以明显看到的点都是人IgG，中央的空白点分别为牛血清白蛋白、兔肌球蛋白和磷酸盐缓冲液等阴性对照点，即每一个阴性对照点都为周围8个阳性人IgG点所包围。所有的阴性对照都没有信号(与背景基本一致)，而阳性信号非常明显，这样高的信噪比完全可以应用普通数码相机配合普通显微镜进行信号采集，说明胶体金-银增强方法可以应用于蛋白质芯片的检测。
实施例6胶体金-银增强法检测和与荧光检测法的比较在该实施例中，将胶体金-银增强方法应用到实际临床检验中。用购自Biodesign等公司的CMV、Tox、Rub、HSV和CVB6共五种抗原，用常规方法制作了产前检查的TORCH抗原芯片(制作方法同实施例5)，检测项目包含巨细胞病毒(CMV)、弓形虫(Tox)、风疹病毒(Rubella)、单纯疱疹病毒(HSV)、克萨奇病毒(CVB)5个指标。
Torch抗原芯片与血清反应后，与胶体金标记的羊抗人IgG反应，随后进行银增强反应，图像采集与数据处理与模型实验完全相同；同时用荧光检测方法进行对照实验，Torch芯片与血清反应后，再与CyTM5标记的羊抗人IgG反应，用ScanArray 5000(Packard Biochip Technologies，Billerica，MA)进行图像采集。
结果如图6显示了胶体金-银增强方法和荧光检测方法的对照，从图中可以看出，对于不同的指标，两种方法相比较，得到的结果基本上是一致的，如对巨细胞病毒(CMV)的检测，两种方法得到的信号都很强，而对于风疹病毒(Rubella)的检测，两种方法得到的检测信号都相对较弱。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种检测蛋白质芯片的方法，其特征在于，包括步骤(a)在待检测物质与蛋白质芯片点样区的点样蛋白形成结合的条件下，将蛋白质芯片与待检测样品反应，在蛋白质芯片上形成待检测物质-点样蛋白的第一复合物；(b)将步骤(a)的蛋白质芯片与识别第一复合物的识别分子反应，形成由第一复合物和识别分子构成的第二复合物，其中所述的识别分子带有第一偶联配对物；(c)将步骤(b)的蛋白质芯片与带有第二偶联配对物的胶体金溶液混合，形成由第二复合物和胶体金构成的第三复合物，其中第二偶联配对物和第一偶联配对物之间形成偶联；(d)将步骤(c)的蛋白质芯片与银增强溶液混合，使银离子在金的催化下形成金属银；(e)中止步骤(d)的蛋白质芯片的银增强反应，并检测蛋白质芯片各点样区的灰度值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白质芯片点样区的点样蛋白是抗原，而待检测物质是抗所述抗原的抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，待检测物质是抗原，而蛋白质芯片点样区的点样蛋白是抗所述抗原的抗体。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述抗原是病原体抗原。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一偶联配对物选自下组生物素、生物素N-羟基丁二酰亚胺酯、长臂生物素或其混合物，第二偶联配对物选自亲和素、卵白亲和素、链亲和素、或其混合物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的识别分子是抗第一复合物的抗体。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中的银增强溶液是通过混合将含可溶性银盐的银增强溶液A和含氢醌的银增强溶液B而制得的。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，结合于蛋白质芯片中各点样区的待检测物质点样蛋白的数量为1pg-1ng/点样点。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，待检测样品中的待检测物质的浓度为1ng-5μg/ml。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，待检测样品中的待检测物质的浓度为2ng-2.5μg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种通过胶体金－银增强方法检测蛋白质芯片的方法，包括步骤(a)将蛋白质芯片与待检测样品反应，形成待检测物质－点样蛋白的第一复合物；(b)将芯片与识别第一复合物的识别分子反应，形成由第一复合物和识别分子构成的第二复合物；(c)将芯片与带有第二偶联配对物的胶体金溶液混合，形成由第二复合物和胶体金构成的第三复合物；(d)将芯片与银增强溶液混合，使银离子在金的催化下形成金属银；(e)中止银增强反应，并检测芯片各点样区的灰度值。本发明方法可简便有效且低成本的检测生物芯片。
文档编号G01N33/543GK1635378SQ20031012208
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者阮康成, 梁汝强, 谭翠燕 申请人:中国科学院上海生命科学研究院