专利名称：细胞代谢物相对含量作为细胞数量指标进行数据校正的新方法
技术领域：
本发明涉及利用体外培养细胞进行疾病、药效、药物毒性等相关的代谢组学研究的新方法，具体涉及体外培养细胞生化代谢的快速猝灭、细胞内小分子化合物高效提取、细胞代谢物相对含量作为细胞数目定量指标并用于代谢组学数据校正的方法。
背景技术：
目前，细胞代谢组学研究的方法尚不成熟，尤其是体外培养的贴壁细胞的代谢组学研究相对滞后，存在一系列的问题，主要表现在以下三个方面1.细胞数量定量问题不同细胞增殖速度的差异，同种细胞受起始接种密度及不同处理方法(环境或药物刺激)的影响，会导致不同的细胞株或同种细胞株在不同状态下生长获得的细胞数目存在差异，在进行数据处理时需要对细胞数量差异进行校正。而目前普遍用于细胞数量校正的常用方法如细胞计数、细胞湿重称量、蛋白量测定等方法不仅费时、费力(如计数和细胞称重不仅需要进行额外实验，贴壁细胞在胰酶的消化作用下还不可避免地产生代谢谱的偏移；蛋白含量测定方法需要进行额外实验，同时还消耗数量本来就有限的细胞样品)，导致细胞内各种代谢物水平的变化，也延迟了细胞内生化代谢的猝灭，造成校正数据的偏差。2.提取效率问题生物样本的前处理方法极大地影响代谢组学研究结果，特别是其中小分子化合物的提取方法直接影响细胞内小分子化合物的提取效率(回收率)和精密度(重复性)，从而对代谢组学结果产生影响。筛选合适的提取溶剂是稳定和充分地提取出细胞中的小分子代谢物的关键问题之一。3.细胞内牛化代谢快谏粹灭的问题为了准确获得细胞中小分子化合物定量信息，需要快速猝灭活细胞中不断进行的生化代谢，否则容易导致细胞代谢谱的偏移，影响实验结果的可靠性。由于绝大多数体外培养细胞具有贴壁生长的特性，如何快速收获细胞并迅速进行代谢猝灭以供代谢组学分析也是关键问题。总之，现有的细胞代谢组学研究的方法局限性较大，一方面，现有的细胞数量校正方法操作繁琐，容易引起细胞内代谢物含量偏差，另一方面现有的贴壁培养的细胞前处理方法复杂、难以进行快速的代谢猝灭、容易引入系统误差，迫切需要创立新的研究方法。代谢猝灭越快，前处理步骤越简易，代谢组学的研究结果也就越可靠。考虑到细胞内的代谢物水平应与细胞数量具有正相关性，寻找细胞内小分子代谢物替代蛋白量作为细胞数量的指标用于代谢组学数据的权重具有现实的可能性。研究表明，以GC/T0FMS测定为例，细胞内很多小分子代谢物包括几乎所有氨基酸、糖醇类化合物、脂肪酸类、小分子有机酸类、核苷和嘌呤化合物、氨类化合物的相对含量与细胞数量/蛋白含量呈良好的线性相关。其中一些代谢物水平与细胞数量之间的相关性还显示出独立于细胞株的特性，即在不同细胞株中都具有线性相关性，如肌醇、泛酸、胆固醇等。这些潜在的标志性代谢物可能对多种细胞都具有很好的普适性，是细胞数量的候选标志物，有望用于替代蛋白量作为细胞数量的指标并用于相关实验数据的校正和分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是改进细胞代谢组学研究中现有的细胞收集和代谢猝灭方法，优化溶剂提取的方案，利用鉴定出的小分子代谢物作为细胞数目的指标用于所得数据的权重，解决细胞代谢组学研究中存在的一系列研究难题。为解决上述问题，本发明提供如下技术方案，步骤包括样品收集和处理细胞按照标准操作规程培养于细胞板或培养皿中，待细胞生长至合适数量，弃去培养基并用2. 5mL的0. 5°C生理盐水迅速淋洗细胞表面2次，然后向每份样品中加入合适体积的超纯水(根据所采用的培养器皿的大小和细胞数量来综合考虑)， 再将样品迅速置于-70°C的冰箱中保存。细胞裂解悬液经反复冻融3次后加入适量的有机溶剂进行提�。谢芗涟ㄒ宜嵋阴�、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈；或经过蛋白沉淀，蛋白沉淀的方法包括加入有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)等单独或者综合的方式进行处理；样品可不进行干燥，或先干燥再利用各类含有机溶剂和水相 (单独或者综合，含盐或者不含盐)的溶媒溶解；样品不进行衍生化或者利用试剂进行衍生化处理。样品分析和数据处理采用基于质谱测定与色谱联用的技术方法或核磁共振技术的测定方法对上述样品进行检测，这些方法可以是液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳色谱-质谱、核磁共振等；经过数据处理后得到色谱图中各个峰的定量数据，这个数据可以是峰面积或峰高，或由峰面积或峰高计算得到的定量数据。本发明的一个突出优点是通过上述方法能简便迅速使细胞代谢猝灭，获得细胞即刻的代谢谱，保证了实验结果的准确性和可靠性，而且对样品进行一次测定即可获得细胞整体代谢谱和每个样本的校正/权重因子，该方法既简便快捷又避免额外实验(如细胞计数、蛋白浓度测定)所引入的系统误差和人为误差。本发明的有益效果在体外培养细胞代谢组学研究中由于不能及时有效地进行代谢猝灭，往往会导致细胞代谢模式的改变，快速简便的样品处理方法包括有效的细胞收集及快速的代谢猝灭是保证研究结果准确、可靠的关键。此外现有的细胞计数、蛋白定量等作为细胞数量校正的方法操作繁琐，容易引起细胞内代谢物含量偏差，而利用细胞内标志性代谢物的方法简便、快捷，其数据校正效果与传统的校正因子(如蛋白含量、细胞计数)相当，显示出较大的优越性。1.利用改进的细胞前处理方法可以高效提取细胞内代谢物、有效进行代谢猝灭， 一方面可以提高代谢物检测的准确性，防止代谢猝灭不完全造成的偏差；另一方面也简化了复杂的细胞收集、细胞代谢物提取的过程，减少了操作和系统误差。2.利用细胞内标志性代谢物作为细胞数量的权重因子用于细胞代谢组学研究可以简化实验操作，无需进行额外实验就可以获取权重因子，同时也减少测定误差和人为误差。3.采用细胞内标志性代谢物作为权重因子与蛋白含量相比，小分子代谢物含量测定的手段更加灵活多样，如LC-MS，GC-MS等，其检测的灵敏度、重现性和线性范围也大大提尚。4.采用细胞内标志性代谢物与细胞计数或细胞称重相比，可以迅速猝灭细胞生化代谢，减少不必要的实验操作，增强结果的准确性和可靠性。
图1马丁达比犬肾上皮细胞系(Madin-Darby canine kidney, MDCK)野生型(a， MDCK-WT)和转染人Mdrl基因的转染型(b，MDCK-MDR)的GC/T0FMS测定总离子流色谱图， 色谱图中可以发现252个色谱峰，已经鉴定的化合物有94个。图2细胞数量的胞内标志性代谢物-苹果酸、肌醇、泛酸和胆固醇与蛋白含量之间的线性回归曲线 A, D =MDCK-WT和MDCK-MDR细胞中的整合数据B, E 仅包括MDCK-WT细胞中的数据C，F 仅包括MDCK-MDR细胞中的数据图3细胞数量的胞外标志性代谢物-肌醇、丝氨酸和山梨醇与细胞数目/蛋白含量之间的线性回归曲线a 胞外标志性代谢物与蛋白含量之间的线性回归曲线b 胞外标志性代谢物与细胞数目之间的线性回归曲线图4不同数量细胞样品的代谢组学数据在权重前(A)和经蛋白含量(B)及鉴定出的细胞数目的标志性代谢物-泛酸(C)和肌醇⑶校正后的样品分布散点图。MDCK-WT和 MDCK-MDR细胞的代谢谱随着细胞数量的不同呈动态变化的轨迹，而肌醇和泛酸权重后每种细胞在第1主成分和第2主成分上的差异均明显降低，组内散点更加聚集，表明权重有效地降低了细胞数量造成的代谢物水平差异，从而增加了模型的有效性，而且权重效果可以与蛋白量权重相媲美。
具体实施例方式本发明通过下面的实施例进行详细的解释，但并不意味着本发明仅限于此。实施实例细胞代谢物作为细胞数量的指标用于细胞代谢组学数据的校正-马丁达比犬肾上皮细胞系(Madin-Darby canine kidney,MDCK)野生型(MDCK-WT)和转染人Mdrl基因的转染型(MDCK-MDR)细胞中的代谢组学范例研究1.实验方案和样品收集系列体积的细胞悬液(A-F2. 5,2. 0，1. 6，1. 2,0. 9,0. 6mL, MDCK-ffT 600，000/mL 和MDCK-MDR 800, 000/mL)接种于六孔板中(η = 4)，补充空白培养基使得每空中的体积为 2.5mL。两细胞株置于相同的培养条件下生长3天左右未更换培养液。收集每孔细胞的培养基样品，细胞则按照上述方法进行前处理，每孔中加入300 μ L的超纯水后冻存于_70°C 的冰箱中待测。2.样品处理细胞样品细胞的水裂解液经反复冻融3次后，取出其中的20μ L用于蛋白含量测定，其余加入840 μ L含0. 5 μ g/mL内标(IS 稳定同位素13C标记的肉寇酸)的甲醇进行提取和沉淀蛋白。每份细胞碎片悬液转移至一个1. 5mL的炮弹管中涡旋震荡5分钟后，在4°C 以19600g离心5分钟。转移等份的400 μ L上清于GC小瓶中，减压挥干。培养基样品移取50 μ L所收集的培养基，加入200 μ L含IS的甲醇沉淀蛋白后， 置于4°C的冰箱中1小时。然后在4°C以19600g离心5分钟，每份样品转移100 μ L上清于 GC小瓶中，减压挥干。向前述含细胞/培养基提取物的GC小瓶中加入30 μ L甲氧胺吡啶溶液(IOmg/ mL)，涡旋振荡:3min，室温下静置16h进行肟化。加入30 μ L三甲基硅烷基三氟乙酰 MSTFA (含TMCS作为催化剂)，涡旋振荡lmin，室温静置Ih进行衍生化反应，最后再加 Λ 30 μ L外标甲基肉寇酸酯的庚烷溶液(30 μ g/mL)，混合后进行GC/T0FMS检测。3. GC/T0FMS 测定仪器气相色谱-飞行时间质谱(GC/T0FMS)监测系统(GC =Angilent 6890N气相色谱仪，配备Angilent 7683B自动进样器和G2614A型100位样品进样盘；TOF-MS =Pegasus III，Leco, USA)。色谱条件色谱柱是DB-5石英毛细管柱(IOmXO. 18謹i. d.，J&ff Scientific, USA)，进样量1 μ L，采用不分流进样模式；载气氦气；恒流速度lmL/min ；程序升温模式70°C保持2. Omin，然后以35°C /min线性勻速线性升温至305°C，保持2. Omin0质谱条件进样口温度250°C ；清洗时间和流速lmin，20mL/min ；传输管温度 2500C ；离子源温度200°C ；离子源电压和电流_70eV，3. OmA ；MS采用全扫描方式进行数据采集，MS采用全扫描方式进行数据采集；扫描范围m/z 50-800 ；扫描速度20Spectra/S ； 检测电压为-1690v。测定结果在上述检测条件下可获得样品的GC/T0FMS总离子流色谱图(图1)。利用仪器自带的软件(ChromaTOF 2.00)可提取各个测定样品色谱图中每个色谱峰峰面积， 组成一个由峰面积组成的数据矩阵，该数据矩阵包括MDCK-WT (WA-WF)和MDCK-MDR (RA-RF) 共72个样品(为第一列)和252个色谱峰(为第一行)，保存在excel文件中。图1马丁达比犬肾上皮细胞系(Madin-Darby canine kidney, MDCK)野生型 (MDCK-WT)和转染型(转染人Mdrl基因，MDCK-MDR)的GC/T0FMS测定总离子流色谱图，色谱图中可以发现252个色谱峰，已经鉴定的化合物有94个。4.细胞数目的标志性代谢物鉴定通过PLS相关性分析和线性回归分析，鉴定出细胞内的泛酸、肌醇、胆固醇和苹果酸在两个细胞株中均与蛋白含量高度正相关(r > 0. 970)，且这种相关性是独立于细胞株的，相关回归曲线和参数分别见图2和表1。类似地，发现在细胞外液中，肌醇和丝氨酸含量与细胞数量负相关，而山梨醇与细胞数目呈正相关，其线性拟合结果如图3所示。5.权重因子有效性的验证将上述数据调入多元数据分析软件SIMCA P-Il⑴metrics AB，Ume§,瑞典)中， 利用PCA建模，通过样品散点图观察组细胞数量对其代谢谱的影响，通过比较权重前后间组间样品散点的聚集情况以及模型的有效性来评估权重的有效性，结果如图4所示，表明标志性胞内代谢物特别是泛酸和肌醇能有效降低细胞数量造成的代谢物水平差异，其权重效果与蛋白权重的效果相当。此外，权重前后各个代谢物的组内RSD值比较的结果显示类似于蛋白质的权重效应，经标志性代谢物尤其是泛酸和肌醇校正后两细胞株中绝大多数代谢物水平的组内RSD值均明显降低了，从而进一步证实了细胞代谢物相对含量作为细胞数量指标进行数据校正的可行性。表1.细胞数目的标志性代谢物与蛋白量之间的线性回归参数
权利要求
1.一种应用细胞内小分子代谢物作为细胞数目指标用于细胞代谢组学数据的权重，其特征包括以下几个方面a)采用体外培养细胞样本进行检测；b)采用反复冻融的方法破碎细胞，甲醇沉淀蛋白的方法对细胞中小分子进行提�。籧)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法对样本进行衍生化；d)采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/T0F-MS)进行样本分析；e)采用细胞内肌醇、泛酸、胆固醇、苹果酸对代谢组学数据进行校正。f)采用细胞培养液中肌醇、泛酸对代谢组学数据进行校正。
2.除权利要求1中的体外培养细胞样本外，还适用于其它培养细胞、原代细胞、原位组织细胞等。
3.除权利要求1中作为代谢组学数据权重因子外，还适用于其它分子细胞生物实验数据的权重与分析。
4.除权利要求1中反复冻融的方法破碎细胞外，还包括其它方法如超声破碎、高渗盐溶液、有机溶剂破碎的方法；除甲醇沉淀蛋白的方法提取细胞样本外，还包括经过其它蛋白沉淀方法，如加入有机溶剂(如乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)或经过有机溶剂进行液-液提取，有机溶剂包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、苯、正己烷、环己烷、乙腈。以及权利要求4中方法单独或者综合的方式进行处理。
5.除权利要求1中三甲基硅烷基三氟乙酰(MSTFA)的衍生化方法外，还包括其它任何市售试剂进行衍生化处理的方法；或不进行任何衍生化处理的方法。
6.除权利要求1中采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/T0F-MS)进行样本分析外，还包括其它任何基于质谱测定技术、核磁共振测定技术和其它代谢组学测定技术的分析方法。
7.权利要求1中所得到的数据可以是绝对定量数据，也可以为半定量数据，如峰面积、 峰高，以内标校正的峰面积、峰高，或由此进行数学计算得到的数据。
8.除权利要求1中肌醇、泛酸、胆固醇、苹果酸对代谢组学数据进行校正的化合物外， 还包括其它任何基于质谱测定技术、核磁共振测定技术和其它代谢组学测定技术的分析方法检测到的未鉴定出或已鉴定出的细胞内物质，如丙氨酸、次黄嘌呤等。
9.除权利要求1中细胞培养液中肌醇、泛酸对代谢组学数据进行校正的化合物外，还包括其它任何基于质谱测定技术、核磁共振测定技术和其它代谢组学测定技术的分析方法检测到的未鉴定出或已鉴定出的细胞细胞培养液中化合物，如山梨醇、丝氨酸、肌醇等。
全文摘要
本发明公开了“细胞代谢物相对含量作为细胞数量指标进行数据校正的新方法”。其特征在于采用简便的样品前处理方法实现细胞内生化代谢的快速猝灭；通过优化提取溶剂以高效提取细胞内小分子代谢物；再利用基于质谱、核磁共振等测定技术的代谢组学方法全面、半定量测定生物样本中小分子化合物，鉴定出的细胞内标志性代谢物作为细胞数量的定量指标，以此作为权重因子进行数据校正。与现有细胞数量的定量指标相比，该方法简便、快捷、重现性好，减少了额外的实验工作和由此引入的误差，增强了实验结果的准确性和可靠性，解决了体外培养细胞数相对定量的难题，为细胞代谢组学和相关研究提供了一个新的替代方法，可广泛用于细胞分子生物学领域的相关研究。
文档编号G01N24/08GK102175809SQ20111002751
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者刘林生, 张凤逸, 曹蓓, 李梦婕, 王广基, 王新文, 石建, 赵春艳, 郑天, 阿基业 申请人:中国药科大学
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