专利名称：抗体片段修饰的微梁制备方法和基于抗体片段修饰的微梁免疫传感检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体片段修饰的微悬臂梁(以下也简称为微梁)，及其制备方法。本发明还公开了基于所述抗体片段修饰的微梁的免疫传感检测系统和检测方法，所述系统和方法可应用于食品安全、环境污染、生物医学、科学研究和生产制造等领域的监控和检测。
背景技术：
免疫传感技术的原理是基于检测抗原抗体的特异性配对反应，即针对需要检测的某种靶标分子(抗原)，通过生物免疫(把抗原注入小动物体内产生的)方法,产生出相应的探针分子(抗体)，提取、纯化出这种探针分子，再利用抗原抗体的特异性结合去检测样品中的靶分子。已有的免疫传感技术如酶联免疫吸附试验(ELISA，原理是利用抗原与抗体的特异性反应与酶标的催化放大来进行)和免疫荧光法(IF，原理是用荧光片段标记抗 原或抗体)，均需要标记物来示踪抗原抗体的反应结果，就是说仅有抗体，并不能建立相应的检测方法，还需要有酶标物或荧光标记物或蛋白复合物。而一些难制备的靶标分子的标记物价格昂贵，或几乎不可能制备或购买。同时酶联免疫试剂盒和蛋白芯片的检测从原理操作上都要求每一步反应完后进行清洗，标记过程繁琐耗时，是事后的检测，不能实时，原位、在线的检测。基于表面应力检测的微悬臂梁免疫传感技术是近年出现的一种新的免疫生化传感方法[1]，其原理是把探针(抗原或抗体)分子用直接或间接的方式固定(修饰)到微梁一侧的镀金层上，当被检测样品液中的靶分子与微梁金表面上的探针分子发生免疫生化反应时，会使微梁表面应力改变，从而导致微梁弯曲变形，通过光学或电学方法检测这种变形的过程，可得到免疫生化反应的实时信息。基于免疫特异性识别建立的微梁免疫传感技术与传统的需要标记物的免疫传感方法相比，它无需使用任何酶标、荧光物质和放射性作为反应示踪剂，消除了标记过程的影响，灵敏度高(比酶联免疫试验高数倍[2_4])，还可以通过监测微梁变形来实时、定量的监测抗原抗体的反应过程，得到更丰富的免疫生化反应的信息。经过这些年的发展，微梁传感被作为一种新兴技术，在生物工程和环境污染监测技术等方面与传统的方法进行对比研究，如RNA转录因子、酶、汞排放及挥发性化合物等，优于常规的酶联免疫方法。但即使如此，微悬臂梁免疫传感技术的检测灵敏度还不足以在成本方面获得相对于常规酶联免疫法的巨大优势，即如果微悬臂梁免疫传感技术的灵敏度或检测极限只比酶联免疫法高数倍，而微悬臂梁免疫传感技术的设备成本与酶联免疫相对较高，使得微悬臂梁免疫传感技术难以商业化。目前，国内外文献报道的方法主要是利用具有双功能基团的疏基化试剂的疏基(-SH)抓住微梁表面的金表面，和另一功能团抓住抗体，实现抗体在微梁镀金层上的固定。例如先将巯基化试剂11-羧酸硫醇结合到微梁的金表面，活化其上的羧基，使之与抗体上的氨基结合来固定抗体(图2)。或用一种巯基化试剂盐酸硫醇亚胺，通过与抗体反应，使抗体连接一个带巯基的分子基团，再通过这个巯基将抗体联结到微梁的金表面上(中国专利CN101407548)(见图3)。这些方法固定抗体，存在如下共同的问题，(I)Y字形抗体(见图I)的Fe段或Fab段的顶端部，会等概率的被固定在金表面上(见图2、3)，没有方向性[5]。而当Fab段的顶端被固定在金表面上时，结合位点被遮挡，限制了抗体的抗原结合位点与抗原的充分结合，从而降低了微梁传感灵敏度；(2)抗体与微梁之间存在不同数目C原子的单链分子，降低了抗原抗体反应产生的应力传递到梁上的效率。由此可见，中国专利CN101407548中公开的方法的灵敏度与酶联免疫法相比仅提高数倍，还无法达到商业化或用于极微量被分析物的检测。因此，在本领域中存在着改进微梁表面与抗体的结合和设计从而进一步提高微梁免疫传感灵敏度和效率的需求。
发明内容
综上所述，在已有的微梁免疫传感技术报道中，最突出的问题就是检测灵敏度。影响微梁免疫传感器灵敏度的因素主要有三个方面①抗体的灵敏度(或抗体与抗原结合的亲和性)、②微梁上抗体的固定方法和③微梁的设计与信号读出。由于抗体的灵敏度和微梁的规格与信号读出方式在微梁免疫传感器系统成型之后就无法改变，唯一可变的是微梁表面抗体的固定方法。一种合适的微梁表面抗体的修饰方法，能使固定在微梁表面的抗体与样品溶液中的抗原充分结合，并能高效地将抗原抗体结合所产生的应力变化传递到微梁表面。抗体在微梁表面固定的方向性、密度、活性以及抗体与微梁表面之间的联接分子的长度与刚性都有可能影响最终检测的灵敏度。鉴于现有技术中存在的问题，本发明用于解决上述问题的技术方案是通过I)减少抗体分子结合位点以外的抗体分子质量和体积，2)取消使用连接微梁镀金表面与抗体分子的过渡分子层(巯基化试剂)，3)提供一种制备镀金表面上定向固定有抗体片段的微梁的方法，达到提高微梁免疫检测方法的灵敏度目的。抗体Ig分子的结构示意图如图1，包括两个相同的抗原结合片段(Fab)和一个可结晶片段(Fe), Fab和Fe通过中间的铰链区连接,构成Y字形结构。Fab的顶端为与抗原分子的结合位点。在免疫球蛋白抗体分子的“Y”字形四肽链结构(图I)中，由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链以二硫键连接而成。对于Fe段修饰在微梁的镀金表面上时(抗体修饰的定向性好)，抗体对称(Fab段)的两个上端部抗原结合位点与抗原结合后产生的应力，通过抗体Y字型的腿部(Fe段)传递到镀金微梁表面。抗体(IgG)的分子量约150kDa，如果被检测的抗原分子分子量为数百Da，抗体抗原质量比近1000。参与抗原分子结合的位点由重链和轻链的高变区(VH和VL)构成，其与抗原分子的质量比约150，而抗体分子上不参加与抗原分子结合的Fe段，其与抗原分子的质量比近400。因此我们设想，如果能够减少结合位点以外的抗体分子质量和体积，保持抗体的结合位点朝向固定表面的外法线方向，就能够提高应力的传递效率和抗体在微梁表面的有效修饰密度，从而提高微梁免疫传感的灵敏度。为此，在第一个方面，本发明提供了一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤I)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁；2) 二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所述抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段；
3)固定步骤将步骤2)获得的半抗体片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金表面上固定有所述半抗体片段的微悬臂梁。在第二个方面，本发明还提供了一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤I)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁；2)酶解步骤用蛋白酶将所述抗体裂解成F(ab’)2片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合；3) 二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所述F(ab’)2片段，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的Fab’片段；4)固定步骤将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金表面上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁。 在第三个方面，本发明还提供了一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤I)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁；2) 二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段；3)酶解步骤用蛋白酶将所述半抗体片段裂解成Fab’片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合；4)固定步骤将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金层上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁。在第四个方面，本发明提供了一种应力传感元件，其包括基于应力的微悬臂梁，所述微悬臂梁的镀金层上固定有抗体的半抗体片段或Fab’片段。所述微悬臂梁优选通过本发明的方法制备而成。在第五个方面，本发明提供了一种基于应力的微悬臂梁免疫传感检测系统，其包括本发明的应力传感元件。在第六个方面，本发明提供了一种使用微悬臂梁传感检测系统免疫传感检测待测样品的方法，包括以下步骤I)提供对靶抗原特异的抗体和微悬臂梁传感检测系统，所述微悬臂梁传感检测系统包括反应池和带有镀金层的基于应力的微悬臂梁；2)使用二硫键还原剂处理所述抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段；3)将步骤2)获得的半抗体片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金层上固定有所述半抗体片段的微悬臂梁；4)将步骤3)获得的固定有所述半抗体片段的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感检测系统的反应池中；5)将待测样品加入至步骤4)获得的微悬臂梁传感检测系统中，检测待测样品中是否存在所述靶抗原。在第七个方面，本发明还提供了一种使用微悬臂梁传感检测系统免疫传感检测待测样品的方法，包括以下步骤I)提供对靶抗原特异的抗体和微悬臂梁传感检测系统，所述微悬臂梁传感检测系统包括反应池和带有镀金层的基于应力的微悬臂梁；
2)用蛋白酶将所述抗体裂解成F(ab’)2片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合；3)使用二硫键还原剂处理所述F (ab’)2片段，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的Fab’片段；4)将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金层上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁；5)将步骤4)获得的固定有所述Fab’片段的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感检测系统的反应池中；6)将待测样品加入至步骤5)获得的微悬臂梁传感检测系统中，检测待测样品中是否存在所述靶抗原。在第八个方面，本发明还提供了一种使用微悬臂梁传感检测系统免疫传感检测待测样品的方法，包括以下步骤I)提供对靶抗原特异的抗体和微悬臂梁传感检测系统，所述微悬臂梁传感检测系统包括反应池和带有镀金层的基于应力的微悬臂梁；2)使用二硫键还原剂处理所述抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段；3)用蛋白酶将所述半抗体片段裂解成Fab’片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合；4)将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金层上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁；5)将步骤4)获得的固定有所述Fab’片段的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感检测系统的反应池中；6)将待测样品加入至步骤5)获得的微悬臂梁传感检测系统中，检测待测样品中是否存在所述靶抗原。本发明的有益效果鉴于微梁免疫传感检测技术中抗体固定的重要性及巯基化试剂参与抗体固定的复杂性，本发明用二硫键还原剂将抗体拆分成带有巯基的对称的半抗体片段，或在拆分之前或之后通过蛋白酶消化从而获得Fab’片段，然后将获得的半抗体片段或Fab’片段通过自带的双巯基固定到微梁的金表面上。结果表明，本发明的方法与现有的微梁免疫方法相比较具有以下优点I)半抗体片段或Fab’片段通过自带的双巯基，直接固定到微梁镀金表面，一步完成，操作简单；2)半抗体片段或Fab’片段与微梁表面之间没有附加的其它的分子，有利于应力传递；3)减少了抗体抗原结合位点以外的抗体分子质量和体积；4)减小了抗体的抗原结合位点到梁表面距离，提高应力的传递效率；5)半抗体片段或Fab’片段与微梁表面之间的双巯基固定的较单巯基分子链联结的刚性要大，更有益于抗原抗体反应的作用力传递到梁上；6)通过自身双巯基一步完成固定，固定的抗原结合位点密度高,稳定性好；
7)镀金表面上固定的抗体的方向性好，易于与抗原结合。
图I为典型的抗体分子结构示意图。图2为羧酸硫醇类化合物和双功能交联剂法固定抗体示意图。图3为盐酸硫醇亚胺法固定抗体示意图。图4为基于自身巯基(-SH)定向固定半抗体片段示意图。图5胃蛋白酶水解抗体形成抗体F (ab ’)2片段示意图。图6为通过自身巯基(-SH)定向固定抗体Fab’片段示意图。·
图7为先用巯基乙胺将抗体拆分成半抗体，再用胃蛋白酶水解半抗体形成抗体Fab’片段,最后通过自身巯基(-SH)定向固定抗体Fab’片段示意图。图8为抗人参皂苷GS-Re巯基化抗体修饰微梁，检测不同浓度抗原时微梁尖端的时间位移曲线。图9为抗人参皂苷GS-Re半抗体片段修饰微梁，检测不同浓度抗原时微梁尖端的时间位移曲线。
具体实施例方式定义抗体抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。典型的抗体分子具有4条多肽链的对称结构，包括2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。轻链有K和λ两种,重链有μ、δ、Y、ε和α五种。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于"Y"的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2 3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段(antigen-binding fragment, Fab)。" Y"的柄部称结晶片段(crystalline fragment, Fe),糖结合在 Fe 上。从结构上来说，在本发明中，提及抗体时均指全抗体，即包括4条链和Fe段的抗体结构(见图I)。此外，从功能上来说，本发明中的“抗体”或“抗体片段”是指对靶抗原特异的抗体或抗体片段，即与抗原具有特异结合能力的抗体或抗体片段，如未特别说明，本发明中的抗体一般指单克隆抗体，抗体片段包括半抗体片段、F(ab’ )2片段、Fab’片段和Fab
坐寸ο半抗体片段如图4中所示，通过二硫键还原剂将全抗体拆分成各自带有巯基的对称的片段，每个半抗体片段包含一条完整的轻链和一条完整重链以及Fe片段。F(ab’ )2 :如图5中所示，Ig(immunoglobulin,免疫球蛋白)被胃蛋白酶水解在铰链区重链间二硫键近C处切断，形成一个双价抗原结合片段简称F (ab’)2片段和一些小片段pFc'。由于F(ab’)2片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了 Fe片段的抗原性可能引起的副作用，因而被广泛用作生物制品。如白喉抗霉素和破伤风抗霉素，经胃蛋白酶水解后，因去掉了 Fe片段的抗原性而减少了超敏反应的发生。pFc'片段最终被降解，无生物学活性。Fab (fragment of antigen binding):木瓜蛋白酶使Ig在铰链区重链间二硫键近N端处切断，形成两个相同的单价抗原结合片段简称Fab段(如图I中所示)，一个可结晶的片段简称 Fe (fragment crystallizable)段。Fab’ 是带巯基的单价抗原结合片段(如图6中所示，F(ab’ )2被二硫键还原剂拆分的各自带有巯基的片段)。抗原结合位点如图I中所示，抗体分子与抗原相结合的部位，由Ig轻、重链的CDR1、CDR2 和 CDR3 组成。 抗原是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答的产物(抗体或效应细胞)发生特异性结合的物质。抗原具有免疫原性和反应原性两种性质。根据抗原性质分为两类完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)是一类既有免疫原性，又有免疫反应性的物质。如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原，即半抗原(hapten)是只具有免疫反应性，而无免疫原性的物质，故又称不完全抗原。二硫键还原剂二硫键又称S-S键，是2个SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的键。在巯基乙胺(2-MEA)、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等的硫化合物存在下能与之发生作用，还原成巯基(-SH)。这些硫化物就是本发明中所说的二硫键还原剂。在微量的二硫键还原剂存在的情况下抗体的重链间的二硫键被还原而其它的二硫键不被破坏。微悬臂梁(微梁)典型的微悬臂梁由氮化硅制成，如商品化的三角形微悬臂梁(Veeco Instruments)(尺寸长200um,腿宽20um,厚O. 6um)，单侧镀有60nm的金；抗体通常通过巯基化试剂的巯基(-SH)与金的共价结合以及巯基化试剂的另外一端(含有-COOH或-NH2等活性基团)与抗体结合来固定到微梁表面。基于表面应力检测的微悬臂梁免疫传感系统微悬臂梁免疫传感系统主要由激光器、分光镜、微悬臂梁、光电位置敏感器(PSD)、温度控制系统、蠕动泵、以及数据分析处理装置组成。典型的微悬臂梁免疫检测方法的步骤如下将微悬臂梁固定到反应池中，以蠕动泵控制流动缓冲液通过反应池，待反应池中气泡排净后以O. lmL/min的速度流动缓冲液通过反应池。反应池的温度控制在37 ±0.01 °C，室温控制在27 ±0.01 °C。激光器发出一束激光经分光镜后照射在微悬臂梁的尖端，经微悬臂梁反射后再经分光镜反射后照在PSD的靶面上。当微悬臂梁的位移信号稳定后，加入缓冲液稀释的样品溶液，PSD实时记录微悬臂梁的尖端位移。本发明的优选实施方案在本发明中，抗体类型可以包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE。此外，抗体可以通过本领域中已知的任何方法制备，包括但不限于免疫法、杂交瘤法、化学合成法、基因工程法等。所述抗体还可以是基因工程修饰的杂合抗体，诸如人源化抗体，骆驼源化抗体等针对某种哺乳动物改造的抗体，例如人-鼠杂合抗体等。本发明中提到的待测样品可以是生物样品，例如来自于哺乳动物尤其是人的样品，包括组织样品(如病理组织切片、活检、毛发、拭子等)、细胞样品(如细胞涂片、血液涂片等)、体液样品(如血液、尿液、脑脊液、唾液等)、排泄物(例如呕吐物、汗液、粪便等)。所述待测样品还可以是环境样品，诸如土壤样品、水样、浮尘等；其他生产领域中获得的样品，诸如污水样品、食品样品等。本发明中所提及的抗原包括但不限于完全抗原和半抗原，其可以是本领域中所知晓的在本发明中所提到的待测样品中可能存在的需要检测的任何类型的抗原。本发明中提到的二硫键还原剂可以是巯基乙胺(2-MEA)、2_巯基乙醇、二硫苏糖醇等。使用二硫键还原剂还原二硫键从而拆分抗体的方法和条件是本领域中公知的，例如，可以根据靶抗原的类型、大小和性质等，遵照本领域中的已知方法或市售的相关试剂盒的说明书来选择具体的二硫键还原剂和浓度、抗体浓度，两者的用量和质量比，温育条件和温育时间等。在本发明的优选实施方案中，在用二硫键还原剂处理抗体或抗体片段之后，可以进行透析去除未反应的二硫键还原剂，以免影响带巯基的抗体片段与微梁镀金层的结合和固定。在本发明中，在酶解步骤中使用的蛋白酶可以根据要被水解的抗体的种类或其他 因素任意地选择，只要其水解产物中包括带有巯基的抗原抗体结合片段从而可以直接固定在微梁金表面上，所述抗原抗体结合片段包括不限于单价或二价的抗原抗体结合片段，诸如F(ab’)2、Fab’等。可选的蛋白酶诸如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等，也可以使用两者的组合。在本发明中，采用蛋白酶水解抗体Ig的方法和反应条件是本领域公知的，本领域普通技术人员可以根据要水解的抗体的种类来确定合适的蛋白酶和相应的水解条件。例如，当选择胃蛋白酶时，胃蛋白酶可以发挥其活性的环境，一般是指pH 2 5和在25 60°C下的环境。胃蛋白酶的最适pH和最适温度根据其来源而定,一般为pH 2左右和37°C左右(可以根据市售产品的要求来确定)。在本发明中可以使用的胃蛋白酶的来源不受限制，只要其可以将抗体分子裂解为F(ab’)2片段或将半抗体片段裂解为Fab’片段。在本发明中，抗体或抗体片段与胃蛋白酶的质量比不受限制，只要足以将抗体或抗体片段充分地水解为Fab’片段。两者的质量比可以根据常规方法来选择，也可以同时参考所选择胃蛋白酶的活性、所选择的抗体类型等因素，一般可以在10 : I 200 : I的范围内选择。另外，还可以选择木瓜蛋白酶。在合适的条件下木瓜蛋白酶也可以将抗体水解为F(ab’)2片段，例如，在文献Μ中在偏酸性(pH5. 5)的环境中在37°C下18小时木瓜蛋白酶可以将小鼠IgG1水解成F(ab’)2片段。在本发明中，抗体或抗体片段与木瓜蛋白酶的质量比不受限制，只要足以将抗体或抗体片段充分地水解为Fab’片段。两者的质量比可以根据常规方法来选择，也可以同时参考所选择木瓜蛋白酶的活性、所选择的抗体类型等因素，一般可以在10 I 200 I的范围内选择。当使用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物时，由于两者的活性环境均为酸性，因此根据具体的应用适当地调整两者的质量比，从而可以根据需要调整所需的水解活性和水解时间。在本发明中，酶解步骤可以在拆分抗体之前或之后进行。当在拆分抗体之前用蛋白酶水解时，即用蛋白酶水解抗体时，得到一个带有两个Fab’片段的F(ab’)2片段和多个小分子片段。当在拆分抗体之后用蛋白酶水解时，即用蛋白酶水解半抗体片段时，得到了一个Fab’片段和多个小分子片段。两种处理方式最终均可以得到带有双巯基的Fab’片段。在本发明中，抗体或抗体片段与微梁的镀金层的结合可以使用本领域公知的方法和条件，例如在适于两者结合的条件下温育一段时间来结合(参见下面的实施例或市售产品的说明书)。在本发明中使用的微梁可以根据本领域中的公知方法自行制备，也可以购买市售商品，对此在本发明中并无任何限制。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但需要说明的是下面的实施例不限制本发明的范围。实施例实施例I固定半抗体片段的微梁实验I利用巯基乙胺将抗体拆分成带巯基的半抗体片段I.准确称取人参皂苷GS-Re单克隆抗体(购自美国USBiological公司)7. Omg溶于I. OmL PBS (含O. 15M NaCl和5. OmM EDTA, pH 6. 5)中得到浓度为7. Og/L的抗体溶液；2.称取Img巯基乙胺(购自美国Sigma公司)溶于I. OmL水中得到浓度为I. Og/L的抗体拆分试剂；3.将I. OmL上述步骤I的抗体溶液和291. 2 μ L上述步骤2的抗体拆分试剂混合，室温下反应I. 5小时。4.用 2OmM 的 PBS 缓冲液(含 O. 15Μ NaCl 和 5· OmM EDTA, pH 6. 5)对上述步骤3的反应液透析48小时，期间每3小时更换一次透析液，得到带巯基的半抗体片段。用甘油等体积稀释后-20°C保存。实验2半抗体片段与微梁金表面的结合将洗净并用氮气吹干的镀有金层的微梁(购自美国Veeco公司)放入酶标板小孔中，加入150 μ L浓度为5. Omg/mL的实验I步骤I获得的抗人参皂苷GS-Re单克隆抗体片段，37°C温育I小时，即得到固定有半抗体片段的微梁。实验3直接竞争ELISA方法评价半抗体片段与微梁金表面的结合情况具体步骤如下I.清洗用镊子小心取出上述固定了半抗体片段的微梁，用洗涤液(每IL洗涤液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、I. OmL Tween-20，其余为水)冲洗数
次，氮气吹干；2.封闭将氮气吹干后的微梁分别放入酶标板中，加入100 μ L质量百分含量为5%的BSA溶液(用PBS溶解)封闭，37°C温育30分钟；3.清洗用镊子小心取出微梁，用洗涤液冲洗数次，氮气吹干；4.竞争将氮气吹干后的微梁分别放入酶标板的两个小孔中(做好标记，抑制孔与非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L经样品稀释液(含有终浓度为O. Imo 1/L ρΗ7. 5的PBS、
O.I %体积百分含量的吐温-20和O. I %质量百分含量的明胶)稀释的浓度为100mg/L的人参皂苷GS-Re溶液(购自美国Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L样品稀释液作为对照；然后再分别加入浓度为I. Omg/L的人参皂苷GS-Re过氧化物酶联结物(购自美国Sigma公司)，37°C温育30分钟；5.清洗用镊子小心取出上述抑制孔与非抑制孔中的微梁，用洗涤液冲洗数次，
氮气吹干。6.显色将氮气吹干后的两根微梁分别放入酶标板的两个小孔中，每孔加入100 μ L显色溶液(TMB底物使用液与底物缓冲液按I : 9的体积比混匀，每IOmL上述混合液中加入4. Omg过氧化脲)，室温显色；7.终止15分钟后，每孔加入50 μ L终止液(2. OM的硫酸溶液)终止反应，取出微梁，450nm波长处分别读取OD值。实验设三次重复，结果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波长下的吸光度值分别为O. 121和O. 727，说明抗人参皂苷GS-Re半抗体片段能有效结合微梁的金表面上并具有活性。实验4微梁传感器效果监测
I.清洗无水乙醇、丙酮和PBS分别流经微梁传感系统，流速O. 5mL/min ；2.固定微梁将步骤2中固定有抗人参皂苷GS-Re抗体片段的微梁固定到微梁传感系统的反应池中，流动PBS通过反应池子。排除反应池中的气泡后以O. lmL/min流动PBS。3.调节光路调节激光器与PSD(光电位置敏感器)的位置使激光器发出的激光照在微梁的尖端反射后被PSD接收。4.样品测定当PSD接收的微梁偏转信号稳定后，加入2mL PBS稀释的人参皂苷GS-Re标准样品。通过PSD实时记录微梁尖端位移信息。图9为抗人参皂苷GS-Re半抗体片段修饰微梁，检测不同浓度抗原时微梁尖端的时间位移曲线。检测了三个浓度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 02ng/mL的样品得到的微梁尖端位移幅值分别为77、58和32nm。不同浓度的人参皂苷GS-Re标准样品可以产生不同程度的微梁位移，说明抗人参皂苷GS-Re半抗体片段能有效结合到微梁的金表面上并能对人参皂苷GS-Re进行定量检测。并且具有很高的检测灵敏度(图8为利用盐酸硫醇亚胺做为巯基化试剂来巯基化抗体后将抗体固定到微梁上(中国专利CN101407548)对人参皂苷进行检测的结果)。结论用本发明的半抗体片段修饰的微梁和完整抗体修饰的微梁进行实验测试对比，检测不同浓度的人参皂苷GS-Re抗原时，微梁尖端的时间位移响应曲线(图9和图8)显示，在微梁位移响应为20纳米左右时，半抗体片段修饰和巯基化抗体修饰的检测人参皂苷GS-Re抗原浓度分别为O. 02ng/mL和O. 5ng/mL,灵敏度提高了约20倍。实施例2抗体Fab’片段修饰的微梁实验I抗体F(ab’)2片段的制备I.用O. lmol/L柠檬酸缓冲液(ρΗ3· 5)溶解人参皂苷GS-Re单克隆抗体(IgG)(购自美国 USBiological 公司)至 10mg/ml ；2.用O. lmol/L朽1檬酸缓冲液(ρΗ3· 5)溶解胃蛋白酶(pepsin)(购自美国Sigma公司)至lmg/ml ；3.将IgG:胃蛋白酶按质量比100 I混合，放在37°C水浴箱中2小时，然后加入3mol/L Tris使pH在7左右以终止反应。4.用 2OmM 的 PBS 缓冲液(含 O. 15M NaCl 和 5· OmM EDTA, pH 6. 5)对上述步骤3的反应混合液透析48小时，期间每3小时更换一次透析液，得到抗体F(ab’)2片段。
实验2抗体片段Fab’的制备I.用去离子水溶解巯基乙胺(2-MEA)(购自美国Sigma公司)至lmg/ml ；2.将步骤I中制备的F(ab’ )2 :2_MEA按质量比20 I进行混合，放在37°C水浴箱中2小时；3.用 20mM 的 PBS 缓冲液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)对上述步骤 2的反应混合液透析48小时，期间每3小时更换一次透析液，得到抗体Fab’片段。用甘油等体积稀释后保存在-20°C环境下。实验3将Fab’抗体片段修饰到微梁金表面上将洗净并用氮气吹干的镀有金膜的微梁(购自美国Veeco公司)放入酶标板小孔中，加入150 μ L浓度为5. Omg/mL的上述步骤2制得的Fab’抗体片段溶液，放在37°C水浴箱中2小时，即得到固定有抗体Fab’片段的微梁。·实验4ELISA直接竞争法效果检测I.清洗用镊子小心取出上述固定了抗体Fab’片段的微悬臂梁，用洗涤液(每IL洗涤液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96gNa2HP04 · 12H20U. OmL Tween-20，其余为水)冲洗数次，氮气吹干；2.封闭将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板中，加入ΙΟΟμ L质量百分含量为5%的BSA溶液(用PBS溶解)封闭，37°C温育30分钟；3.清洗用镊子小心取出微悬臂梁，用洗涤液冲洗数次，氮气吹干；4.竞争将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中(做好标记，抑制孔与非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L经样品稀释液(含有终浓度为O. lmol/L pH7. 5的PBS,O. 1%体积百分含量的吐温-20和O. 1%质量百分含量的明胶)稀释的浓度为IOOmg/L的人参皂苷GS-Re溶液(购自美国Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L样品稀释液作为对照；然后再分别加入浓度为I. Omg/L的人参皂苷GS-Re过氧化物酶联结物(购自美国Sigma公司)，37°C温育30分钟;5.清洗用镊子小心取出上述抑制孔与非抑制孔中的微悬臂梁，用洗涤液冲洗数次，氮气吹干；6.显色将氮气吹干后的两根微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中，每孔加入100 μ L显色溶液(TMB底物使用液与底物缓冲液按I : 9的体积比混匀，每IOmL上述混合液中加入4. Omg过氧化脲)，室温显色；7.终止15分钟后，每孔加入50 μ L终止液(2. OM的硫酸溶液)终止反应，取出微悬臂梁，450nm波长处分别读取OD值。实验设三次重复，结果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波长下的吸光度值分别为0. 178和0. 853，说明抗人参皂苷GS-Re抗体Fab’片段能有效结合微悬臂梁的金表面上。实验5微梁传感器效果检测I.清洗无水乙醇、丙酮和PBS分别流经微梁传感系统，流速0. 5mL/min ；2.固定微梁将实验3中修饰有抗人参皂苷GS-Re抗体片段Fab’的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感系统的反应池中，流动PBS通过反应池子。排除反应池中的气泡后以
0.lmL/min 流动 PBS。3.调节光路调节激光器与PSD(光电位置敏感器)的位置使的激光器发出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。4.样品测定当PSD接收的微梁偏转信号稳定后，加入2mL PBS稀释的人参皂苷GS-Re标准样品。通过PSD实时记录微梁尖端位移信息。检测了三个浓度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 01ng/mL的样品得到的微梁尖端位移幅值分别为79、61和21nm ;不同浓度的人参皂苷GS-Re标准样品可以产生不同程度的微悬臂梁位移，说明抗人参皂苷GS-Re抗体Fab’片段能有效结合到微悬臂梁的金表面上并能对人参皂苷GS-Re进行检测。结论 用本发明的抗体Fab ’片段修饰的微梁和完整抗体修饰的微梁进行实验测试对比，检测不同浓度的人参皂苷GS-Re抗原时，在微梁位移响应为20纳米左右时，抗体Fab’片段修饰和巯基化抗体修饰检测人参皂苷GS-Re抗原浓度分别为O. 01ng/mL和O. 5ng/mL,灵敏度提高了近40倍。实施例3抗体Fab’片段修饰的微梁实验I利用巯基乙胺将抗体拆分成带巯基的半抗体片段I.准确称取人参皂苷GS-Re单克隆抗体(购自美国USBiological公司)7. Omg溶于I. OmL PBS (含O. 15M NaCl和5. OmM EDTA，pH 6. 5)中得到浓度为7. Og/L的抗体溶液；2.称取Img巯基乙胺(购自美国Sigma公司)溶于I. OmL水中得到浓度为I. Og/L的抗体拆分试剂；3.将I. OmL上述步骤I的抗体溶液和291. 2 μ L上述步骤2的抗体拆分试剂混合，室温下反应I. 5小时。4.用 20mM 的 PBS 缓冲液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)对上述步骤 3的反应液透析48小时，期间每3小时更换一次透析液，得到带巯基的半抗体片段。用甘油等体积稀释后-20°C保存。实验2抗体Fab’片段的制备I.用O. lmol/L朽1檬酸缓冲液(ρΗ3· 5)溶解胃蛋白酶(pepsin)(购自美国Sigma公司)至lmg/ml ；2.将步骤I中制备的半抗体片段与胃蛋白酶按质量比100 I混合反应，放在37°C水浴箱中2小时，然后加入3mol/L Tris使pH在7左右以终止反应。3.用 20mM 的 PBS 缓冲液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)对上述步骤 2的反应混合液透析48小时，期间每3小时更换一次透析液，得到抗体Fab’片段。用甘油等体积稀释后保存在-20°C环境下。实验3将抗体Fab’片段修饰到微梁金表面上将洗净并用氮气吹干的镀有金膜的微梁(购自美国Veeco公司)放入酶标板小孔中，加入150 μ L浓度为5. Omg/mL的上述步骤2制得的抗体Fab’片段溶液，放在37°C水浴箱中2小时，即得到固定有抗体Fab’片段的微梁。实验4ELISA直接竞争法效果检测I.清洗用镊子小心取出上述固定了抗体Fab’片段的微悬臂梁，用洗涤液(每IL洗涤液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、I. OmL Tween-20，其余为水)冲洗数次，氮气吹干；
2.封闭将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板中，加入ΙΟΟμ L质量百分含量为5%的BSA溶液(用PBS溶解)封闭，37°C温育30分钟；
3.清洗用镊子小心取出微悬臂梁，用洗涤液冲洗数次，氮气吹干；4.竞争将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中(做好标记，抑制孔与非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L经样品稀释液(含有终浓度为O. lmol/L pH 7. 5的PBS,O. I %体积百分含量的吐温-20和O. 1%质量百分含量的明胶)稀释的浓度为100mg/L的人参皂苷GS-Re溶液(购自美国Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L样品稀释液作为对照；然后再分别加入浓度为I. 0mg/L的人参皂苷GS-Re过氧化物酶联结物(购自美国Sigma公司)，37°C温育30分钟;5.清洗用镊子小心取出上述抑制孔与非抑制孔中的微悬臂梁，用洗涤液冲洗数次，氮气吹干；6.显色将氮气吹干后的两根微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中，每孔加入100 μ L显色溶液(TMB底物使用液与底物缓冲液按I : 9的体积比混匀，每IOmL上述混合液中加入4. Omg过氧化脲)，室温显色；7.终止15分钟后，每孔加入50 μ L终止液(2. OM的硫酸溶液)终止反应，取出微悬臂梁，450nm波长处分别读取OD值。实验设三次重复，结果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波长下的吸光度值分别为0. 152和0. 763，说明抗人参皂苷GS-Re抗体Fab’片段能有效结合微悬臂梁的金表面上。实验5微梁传感器效果检测I.清洗无水乙醇、丙酮和PBS分别流经微梁传感系统，流速0. 5mL/min ；2.固定微梁将实验3中修饰有抗人参皂苷GS-Re抗体Fab’片段的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感系统的反应池中，流动PBS通过反应池子。排除反应池中的气泡后以
0.lmL/min 流动 PBS。3.调节光路调节激光器与PSD(光电位置敏感器)的位置使的激光器发出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。4.样品测定当PSD接收的微梁偏转信号稳定后，加入2mL PBS稀释的人参皂苷GS-Re标准样品。通过PSD实时记录微梁尖端位移信息。检测三个浓度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 015ng/mL的样品得到的微梁尖端位移幅值分别为68、42和22nm ;不同浓度的人参皂苷GS-Re标准样品可以产生不同程度的微悬臂梁位移，说明抗人参皂苷GS-Re抗体Fab’片段能有效结合到微悬臂梁的金表面上并能对人参皂苷GS-Re进行检测。结论通过先拆分后酶解的方法制备的本发明的抗体Fab’片段修饰的微梁和完整抗体修饰的微梁进行实验测试对比，检测不同浓度的人参皂苷GS-Re抗原时，在微梁位移响应为20纳米左右时，抗体Fab’片段修饰和巯基化抗体修饰检测人参皂苷GS-Re抗原浓度分别为0. 015ng/mL和0. 5ng/mL,灵敏度提高了近33倍。通过上述非限制性的实施例，可以看出，本发明的方法和通过本发明的方法制备的微悬臂梁在免疫传感检测技术中与现有技术的微梁法相比可以提高20-40倍，相当于常规酶联免疫法的200-400倍，实现了本发明的目的，即在食品安全、环境污染、生物医学、科学研究和生产制造等领域中监控和检测极微量被分析物的可能性和实用性，完全可以实现实际的商业化应用。参考文献[l]Koutilya R. Buchapudi, Xin Huang, Xin Yang，HaiFeng Ji and ThomasThundat, Microcantilever biosensors for chemicals and bioorganisms. Analyst,2011，136，1539-1556[2]Weiming Tan，Yuan Huang，Tiegui Nan，Changguo Xue,Zhaohu Li，QingchuanZhang, and Baomin Wang, Development of Protein A Functionalized MicrocantileverImmunosensors for the Analyses ofSmaII Molecules at part per trillion Levels.Analysis Chemistry,2010，82(2)，615-620[3] Hongwei Zhao ；Changguo Xue ；Tiegui Nan ；Guiyu Tan ；Zhaohu Li; Qing X. Li ；Qingchuan Zhang ；Baomin Wang, Detection of Copper Ions UsingMicrocantilever Immunosensors and Enzyme-linked Immunosorbent Assay, AnalyticaChimica Acta，2010，676，81-86，[4]Changguo Xue, Hongwei Zhao, Yanyun Chen, Baomin Wang, QingchuanZhang, Xiaoping Wu, Development of sulfhydrylated antibody functionalizedmicrocantilever immunosensor for taxol， Sensors and Actuators B，2011，156，863-866[5] A. Kausai te-Minkst imi ene，A. Ramanav i c i ene，J. Kirlyte , andA. Ramanavicius. Comparative Study of Random and Oriented AntibodyImmobilization Techniques on the Binding Capacity of Immunosensor. AnalysisChemistry,2010，82，6401-6408[6] [J]仇凯等，木瓜蛋白酶制备抗人肝癌抗F(ab’)2&Fab片段。第四军医大学学报，1995 ；16(6) :414-416。
权利要求
1.一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤 1)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁； 2)二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所述抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段； 3)固定步骤将步骤2)获得的半抗体片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金表面上固定有所述半抗体片段的微悬臂梁。
2.一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤 1)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁； 2)酶解步骤用蛋白酶将所述抗体裂解成F(ab’)2片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合； 3)二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所述F(ab’ )2片段，使得所述抗体铰链区的~■硫键还原成疏基，从而得到两个对称的带有疏基的Fab’片段； 4)固定步骤将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金表面上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁。
3.一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤 1)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁； 2)二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段； 3)酶解步骤用蛋白酶将所述半抗体片段裂解成Fab’片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合； 4)固定步骤将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金层上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁。
4.一种应力传感元件，其包括基于应力的微悬臂梁，所述微悬臂梁的镀金层上固定有抗体的半抗体片段或Fab’片段。
5.一种基于应力的微悬臂梁免疫传感检测系统，其包括权利要求4的应力传感元件。
6.一种使用微悬臂梁传感检测系统免疫传感检测待测样品的方法，包括以下步骤 1)提供对靶抗原特异的抗体和微悬臂梁传感检测系统，所述微悬臂梁传感检测系统包括反应池和带有镀金层的基于应力的微悬臂梁； 2)使用二硫键还原剂处理所述抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段； 3)将步骤2)获得的半抗体片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金层上固定有所述半抗体片段的微悬臂梁； 4)将步骤3)获得的固定有所述半抗体片段的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感检测系统的反应池中； 5)将待测样品加入至步骤4)获得的微悬臂梁传感检测系统中，检测待测样品中是否存在所述靶抗原。
7.一种使用微悬臂梁传感检测系统免疫传感检测待测样品的方法，包括以下步骤 I)提供对靶抗原特异的抗体和微悬臂梁传感检测系统，所述微悬臂梁传感检测系统包括反应池和带有镀金层的基于应力的微悬臂梁；2)用蛋白酶将所述抗体裂解成F(ab’)2片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合； 3)使用二硫键还原剂处理所述F(ab’)2片段，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的Fab’片段； 4)将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金层上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁； 5)将步骤4)获得的固定有所述Fab’片段的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感检测系统的反应池中； 6)将待测样品加入至步骤5)获得的微悬臂梁传感检测系统中，检测待测样品中是否存在所述靶抗原。
8.一种使用微悬臂梁传感检测系统免疫传感检测待测样品的方法，包括以下步骤 1)提供对靶抗原特异的抗体和微悬臂梁传感检测系统，所述微悬臂梁传感检测系统包括反应池和带有镀金层的基于应力的微悬臂梁； 2)使用二硫键还原剂处理所述抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段； 3)用蛋白酶将所述半抗体片段裂解成Fab’片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合； 4)将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金层上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁； 5)将步骤4)获得的固定有所述Fab’片段的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感检测系统的反应池中； 6)将待测样品加入至步骤5)获得的微悬臂梁传感检测系统中，检测待测样品中是否存在所述靶抗原。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法、应力传感元件或免疫传感检测系统，其特征在于所述二硫键还原剂选自巯基乙胺、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇中的一种或多种。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法、应力传感元件或免疫传感检测系统，其特征在于所述抗体为IgM、IgG、IgA、IgD、IgE中的任一种。
全文摘要
本发明提供了一种抗体片段修饰的微悬臂梁，其镀金表面上定向固定有半抗体片段或抗体的Fab’片段，提高了基于表面应力效应的微悬臂梁免疫检测方法的灵敏度。本发明还公开了所述微悬臂梁的制备方法、基于所述抗体片段修饰的微悬臂梁的免疫传感检测系统和检测方法。
文档编号G01L1/04GK102951598SQ20111023888
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者张青川, 吴尚犬, 邬林, 伍小平 申请人:中国科学技术大学
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